pcr标准程序.docx

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pcr标准程序

xxxx医院检验科

PCR实验室程序管理文件

撰写人：

批准人：

批准日期：

启用日期：

二零零四年贰月一日制

某某医学院第一附属医院

科室管理诊疗规范文件

文件编号:

JYYFY-PCR

版序:

20021130

生效日期:

2002年12月3日

责任部门:

细胞基因诊断中心

页码:

第1页共48页

程序文件名称页码

核酸扩增荧光检测实验室设置和管理………………………………………2

实验室内务管理及清洁………………………………………………………5

实验室人员的配置及培训程序………………………………………………6

仪器申请、采购、验证和管理程序…………………………………………8

离心机的使用、维护和校准的标准操作程序………………………………9

测量仪器设备统一管理标准程序……………………………………………11

连续可调移液器的操作及校准程序…………………………………………12

常规仪器设备的使用、操作和维护程序……………………………………14

应急处理程序…………………………………………………………………17

实验耗材的购买、质检和储存程序…………………………………………19

试剂质检的标准操作程序……………………………………………………21

实验室化学试剂的管理及配制标准操作程序………………………………23

实验室残留试剂药品、废弃物处理及生物防护程序………………………25

标本采集、验收和保存的标准操作程序……………………………………27

标本唯一标识编号程序………………………………………………………30

标本前处理标准操作程序……………………………………………………31

检验结果报告程序……………………………………………………………33

抱怨的处理程序………………………………………………………………35

实验室记录的管理……………………………………………………………37

实验室室内质量控制标准操作程序…………………………………………39

实验室室间质量评价标准操作程序…………………………………………41

GeneAmp5700型核酸扩增荧光检测仪操作及分析程序…………………42

附图与附表

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修改内容

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科室管理诊疗规范文件

文件编号:

JYYFY-PCR

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20021130

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2002年12月3日

责任部门:

细胞基因诊断中心

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第2页共48页

核酸扩增荧光检测实验室设置和管理

1目的：

实现核酸扩增荧光检测实验室有专人负责，依照实验室管理规范实施全面质量管理，保证实验质量。

2范围：

本制度适用于所有开展核酸扩增荧光检测项目的实验室及相关人员，并明确了实验室各项规章。

3操作人：

4规章

4.1实验室分区设置

a）核酸扩增荧光检测实验室设置为试剂准备区、标本制备区及扩增区。

每个区都设置一个缓冲区，用于更换工作服、鞋套及维持空气流向，实验室布局见附图01。

进入各个工作区域工作扩增时,必须严格遵守单一方向顺序,即从第一区试剂准备区→第二区的标本制备区→第三区的扩增区。

各区门前有醒目标志，一、二区通过排风装置保持正压，三区通过抽风装置保持负压。

b）各室的实验物品（含移液器、试管架、吸头盒、记录本、笔等），不得混用，须贴上不同标签予以区别。

c）各区配有不同颜色工作服，一区为白色，二区为蓝色，三区为粉红色。

进入实验室，必须更换本室有颜色标识的工作服，穿上鞋套。

4.2试剂准备区工作制度

a）实验人员进入该区须穿本区专用白色工作服。

实验中须戴手套、一次性鞋套。

b）记录温湿度计读数（例附表01）。

c）记录冰箱的温度计读数，绘制冰箱的质控图（例附图02）。

d）根据当天的标本验收登记表，取出当天实验须配制和使用的试剂，其余试剂要立即收好放回冰箱内。

e）每周一清点库存试剂，看有无过期或将近到期的试剂，或作报废处理或排列优先使用，避免浪费，然后记录试剂的详细保存情况。

f）实验中所使用的离心管、吸头等需经高压灭菌处理，使用时应在消毒有效期内。

g）试剂准备工作完成后，将使用过的离心管、吸头须置于盛有10％“84”消毒液

或类似消毒液的废液缸中，还原实验台面。

h）将准备好的试剂放入传递窗中。

i）其他区的用品不得带入本区。

j）每次实验记录，书写工整详细，应使用本室专用的、带有本室标识的记录本、纸和笔。

k）实验完毕打开紫外灯消毒30～60分钟，记录紫外灯使用情况。

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科室管理诊疗规范文件

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2002年12月3日

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细胞基因诊断中心

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第3页共48页

4.4标本制备区工作制度

a）实验人员进入该区须穿本室专用蓝色工作服。

实验中须使用一次性鞋套，戴手手套，手套需常更换。

b）从传递窗中取出试剂放入冰箱冷冻室试剂存放专区暂存。

c）记录温湿度计读数。

d）记录冰箱的温度计读数，绘制冰箱的质控图。

e）核对标本的编号、类型和标本数量。

f）按试剂盒要求进行标本的裂解和提取处理，在超净工作台上进行加样，递入传递窗内。

g）使用本室专用的经过灭活无菌处理的加样器和带滤心的吸头。

h）使用过的离心管、吸头须置于盛有10％“84”消毒液或类似消毒液的废液缸中。

i）使用本室专用的带有本室标识的记录本、纸和笔。

j）患者样品应按有生物传染性危险品对待。

k）标本处理完成后，关闭所有仪器，记录仪器使用时间和运行状态。

l）其他区的用品不得带入本室。

m）实验完毕要打开紫外灯消毒30～60分钟，记录紫外灯使用情况。

4.4扩增区工作制度

a）实验人员进入该区须穿本区专用粉红色工作服。

实验中须使用一次性鞋套，戴手套，手套需常更换。

b）将从传递窗接收来的离心后加好样的反应管上机扩增。

c）扩增分析完后，记录结果，打印报告。

d）得到当天室内质控结果后，在室内质控图（例附图03）上描点。

e）关掉扩增仪，记录仪器使用时间和运行状态。

f）实验完毕要打开紫外灯消毒30～60分钟，记录紫外灯使用情况（例附表02）。

本文涉及以下图表，见SOP文件末的附图表：

实验室平面布局示意图---附图01

冰箱质控图---附图02

室内质控图---附图03

温度、湿度记录表---附表01

移动紫外灯使用记录表---附表02

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实验室内务管理及清洁

1目的：

保证实验室日常内务管理及清洁工作顺利进行。

2范围：

实验室相关人员及医院清洁工人。

3内务管理及清洁制度

3.1内务管理制度

b）进入实验室的工作人员必须遵守实验室的单一流向的规定，禁止逆向走动。

c）非本室工作人员未经允许不得进入实验室。

d）实验人员必须熟悉仪器性能方允许操作，严格遵守操作规程。

e）所有仪器（如PCR扩增仪）须有专人负责，有使用维护记录。

f）注意保持仪器卫生整洁，严禁在室内抽烟，吃零食，非仪器操作人应尽量少入。

g）每天了解仪器运转情况及试剂使用情况，负责仪器的整洁，安全，检查电源，水龙头，节假日应指定人员负责检查实验室的仪器、设备，确保安全。

3.2内务清洁制度

a）合理规划实验室内物品，做到摆放整齐、有序，无用的或使用效率低的物品放置到储存处，常用的物品要容易寻找到。

b）抽屉、柜子、文件类物品要作好标记，以方便识别。

c）实验结束后用10%“84”消毒液对台面进行清洁，并用紫外线灯进行消毒。

d）每天对使用过的移液器用优氯净进行擦拭，每2周1次对移液器进行高压消毒。

e）实验过程中如发生标本或试剂外溅，应立即用10%“84”消毒液滴上，滤纸盖上半小时，然后用酒精擦洗，并经紫外灯消毒。

f）每天实验前通过内走廊上的开关，开启各区的通风系统，各区实验结束后打开该区移动紫外灯消毒实验台面，紫外灯每天开启30～60分钟。

g）每天实验结束，待紫外灯消毒时间足够后，依次关闭各区紫外灯并记录。

h）依次清洁三个区的实验台面和地面，各区清洁消毒工具均专用，不可混用，注意按照单一方向流程的原则来进行清洁。

i）处理好各区废弃物，交医院集中处理。

j）每周将工作服交院洗衣房洗涤消毒，不同实验区的工作服隔开洗涤。

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实验室人员的配置及培训程序

1目的：

保证实验室有足够数量的合格的具备开展该类实验的能力的实验人员。

2适用范围：

本程序适用于实验室人员配置、管理、培训及考核。

3程序：

3.1人员要求：

3.1.1本实验室工人作员应为医学检验专业或相关专业毕业，具有中级技术职称或专科学历。

3.1.2实验室工作人员应参加卫生部或省临检中心举办的PCR技术培训，并取得合格证。

3.1.3对于新进入本室的人员，如尚未取得PCR技术培训合格证，应在实验室有培训合格证的上级技术人员的指导下进行实验工作，实验报告由有资格人员出具，并应在最短的时间内取得上岗培训合格证。

3.2人员配置：

3.2.1实验室应根据工作需要配备足够的工作人员，目前实验室有主任技师、主管技师、技师各1人，获得培训合格证者1人，视工作量的增加和业务发展需要，应适当增加工作人员。

3.2.2各级技术人员履行相应的工作职责。

3.3人员培训及考核：

3.3.1实验室负责人（或委托人）参加每年卫生部PCR室间质评总结会。

3.3.2实验室工作人员每1～2年至少参加1次PCR技术的省级或国家级继续教育项目，参加相关学术交流会议。

3.3.3安排未取得上岗培训合格证的工作人员在合适的时间内参加技术培训。

3.3.4科室定期组织实验室内部实验人员学习、更新核酸扩增方面的相关知识，提升自身的理论学习水平。

特别是在标本接收区采血、接收标本的实验人员，需定期对其进行有关核酸扩增技术，标本采集、保存、运输等知识的培训。

一些科室的送检标本由该科室的人员送到标本接收区，对这些临床医护人员也要定期进行有关核酸扩增技术，标本采集、保存、运输等知识的培训。

3.3.5实验室工作人员每年应提交至少1篇本专业相关学术论文或综述作为年度业务考核的依据之一。

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3.4人员管理

3.4.1实验室建立所有工作人员的技术档案，包括：

学历、任职资格、发表论文、研究成果、培训等相关材料复印件。

3.4.2技术档案分文本档案和电子档案，文本档案每年更新1次，电子档案随时更新。

本文涉及以下表格，见SOP文件末的附图表：

实验室主要负责人简历表---附表03

实验室工作人员一览表---附表04

人员培训计划及培训记录表---附表05

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仪器申请、采购、验证和管理程序

1目的：

保证仪器正常的购买、安装、使用，确保实验室仪器设备得到妥善的管理。

2适用范围：

基因扩增检验实验室所有的仪器设备。

3负责人：

刘某某

4申请、采购及验证程序

4.1仪器申请购买需根据实验室需要由实验室工作人员提出并向实验室负责人进行书面汇报。

4.2由实验室负责人填写仪器设备申购表，通过科室领导小组会议批准后，上报医院设备科统一进行购买。

4.3仪器采购到货后，在医院设备科人员和实验室人员共同陪同下由厂家到实验室进行安装。

4.4仪器安装后由厂家工程师进行培训并通过设备科人员确认后，填报仪器安装表后，设备科和实验室各备份一份仪器维护使用档案后，由实验室负责人签字后方可使用。

5管理程序：

5.1基因扩增检验实验室的主要仪器设备均需建立档案，主要的仪器包括：

PE7000扩增仪、冷冻离心机、离心机、超低温冰箱、普通低温冰箱、移液器、超净工作台等。

5.2设备的档案包括：

设备名称、制造商名称、型号、序号、接收日期和启用日期、目前放置地点、接收时的状态、校准和鉴定的日期和结果以及下次校准的日期、进行的维护和维护计划、故障记录等，并应有仪器使用说明书或其它技术资料复印件。

5.3仪器出现故障应作记录和处理意见，如不能正常使用，应填写维修申请单，交医院设备维修人员或相关专门维修单位进行处理。

5.4仪器应有工作状态标识，正常使用者贴绿色标签。

有故障待修暂停使用者用黄色标签，不能使用者应贴红色标签。

需定期作校准或检定的仪器应有校准或检定日期及下次校准或检定日期的记录。

5.6基因扩增检验实验室仪器设备实行分区使用，不得混用。

5.7本实验室所有仪器、设备均为专用不外借。

本文涉及以下表格，见SOP文件末的附图表：

主要仪器设备一览表---附表06

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离心机的使用、维护和校准的标准操作程序

1目的：

保证离心机的正常使用。

2适用范围：

适用于本室使用的普通离心机和低温离心机。

3操作人：

刘某某胡某某陈某某

4操作

4.1使用方法

4.1.1普通离心机

a）离心机应放置在水平坚固的地板或平台上，并力求使仪器处于水平位置以免离心时造成仪器振荡。

b）打开电源开关，将预先平衡好的样品对称放置于转头的样品架上，关闭机盖。

c）旋动定时旋钮设定离心时间，缓慢旋转转速调节旋钮使仪器转速达到预定要求。

d）离心完毕后，将转速调节旋钮调回零位，关闭电源开关。

e）待离心机完全停止转动时打开机盖，取出离心样品，再次关闭机盖结束离心。

4.1.2低温离心机

a）离心机应放置在水平坚固的地板或平台上，并力求使仪器处于水平位置以免离心时造成仪器振荡。

b）打开电源开关，按功能选择键，设定离心温度、速度和时间。

c）待机腔温度达到设定要求时，将预先平衡好的样品对称放置于转头的样品架上，关闭机盖。

d）按启动键，离心机将执行上述参数进行运行，到预定时间自动关机。

e）待离心机完全停止转动时打开机盖，取出离心样品。

如不再使用该离心机，关闭电源，用柔软干净的布擦拭转头和机腔内壁，待离心机腔内温度与室温平衡后方可盖上机盖。

4.2维护保养

a）离心室的清洁：

为了避免样本等残留物的污染，应经常对离心机外壳和离心室进行清洁处理。

对离心室清洁，应先打开离心机盖，拨掉电源线，用专用设备将离心机转头旋下，70%乙醇去污染清洁离心室；离心室内的橡胶密封圈经去污剂处理后，用水冲洗，再用甘油润滑。

b）转头的清洁：

转头会被样本残留物污染，也可能会被某些化学试剂腐蚀，因此应对转头每月进行清洁维护。

每月用中性的清洁剂清洁转头一次，并在仪器使用记录本上作好记录，以延长转头的寿命。

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c）离心完毕后，应及时用干的软布拭去离心室的冷凝水。

（此步仅适用于低温离心机）

d）离心结束后，使离心机盖打开，然后关机。

4.3校准

每年6月、12月请医院设备科南昌市计量局对该类仪器进行定期检修校准。

5应急处理

如果离心时发现离心管破裂，必须先停止实验，将破裂管密封放入生物垃圾桶，再

用75%酒精进行擦拭消毒，如必要需用移动紫外灯照射30～60分钟后才能开始实验。

注意事项：

a）离心机应始终处于水平位置，与外接电源电压匹配，并要求有良好的接地线。

b）开机前应检查机腔有无异物掉入。

c）样品应预先平衡，使用离心机微量离心时离心套管与样品应同时平衡。

d）挥发性或腐蚀性液体离心时，应使用带盖的离心管，并确保液体不外漏以免侵

蚀机腔或造成事故。

e）每次操作完毕，应做好使用情况记录，应定期对机器各项性能进行检修。

f）离心过程中若发现异常现象，应立即关闭电源，报请有关技术人员检修。

g）定期清洁机腔。

h）使用离心机时遵守左右手分开原则，只以右手操作仪器。

i）使用冷冻离心机时，除注意以上各项外，还应注意擦拭机腔的动作要轻柔，以免损坏机腔内温度敏感器。

j）相对离心力于每分钟转速的换算。

以往离心机的转速常以每分钟多少转表示，现在常用相对离心力（RCF）表示。

两者互换公式如下：

N=（RCF×105）/（1.18×R）RCF=0.011238095×R×N

N表示转速，单位为转/分（r/min）；

R表示离心半径，即离心管底端至轴心的距离，单位为厘米（cm）；

RCF表示相对离心力，单位用重力加速度g（g＝9.8m/s）

本文涉及以下图表，见SOP文件末的附图表：

离心机使用记录表---附表07

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测量仪器设备统一管理标准程序

1目的：

确保设备仪器的精确性，保证实验的准确性。

2适用范围：

实验室所有测量设备（包括移液器、温度计、湿度计、天平等）。

3操作人：

刘某某胡某某陈某某

4操作方法

a）根据具体仪器的要求在规定时间内上报设备科，要求仪器校准。

如移液器校准

时间半年；温度计、湿度计1年；天平1年。

b）由医院设备科联系某某省标准计量局统一校准。

c）详细记录校准仪器的名称型号、以及校准时间。

d）一些测量设备（如温湿度计）可只校准一套，校准过的测量设备可作为实验室其它该种测量设备的参照。

e）一些仪器设备（包括冰箱、水浴箱等）每天都要用校准过的温度计进行测定、记录，以确保其精确性，保证实验质量。

本文涉及以下表格，见SOP文件末的附图表：

设备校正记录表---附表08

冰箱温度记录表---附表09

水浴箱温度记录表---附表10

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连续可调式移液器的操作及校准程序

1目的：

正确使用移液器，确保移液器加样的精确性和准确性。

2适用范围：

各种品牌、型号的连续可调式移液器。

3操作程序

3.1转动旋钮设定移液量，设定的移液量不可超出该移液器规定的范围。

3.2装上配套的吸头（Tip）。

3.3将按钮压至第一停点位置。

3.4将移液管吸头浸入液面下2～3mm深处，然后慢慢松开按钮吸入液体。

待移入吸头吸满液体后，将吸头撤出液面，擦掉吸头外侧的所有液滴。

3.5轻轻压下操作按钮至第一停点位置，放出液体。

约1秒钟后，继续将操作按钮向下压至第二停点位置。

待吸头液体放干净后，将吸头贴在容器瓶壁上防止形成液滴滴入瓶中，撤出吸头。

3.6松开按钮使之回到起点位置。

需要时，可更换吸头继续移液操作。

4校准方法

4.1校准环境和用具要求

室温：

20～25℃，测定中波动范围不大于±0.5℃。

电子天平：

放置于无尘和震动影响的台面上，房间尽可能有空调。

称量时，为保证天平内的湿度（相对湿度60～90％），天平内应放置一装有10mL蒸馏水的小烧杯。

小烧杯：

5～10mL体积。

测定液体：

温度为20～25℃的去气双蒸水。

选定校准体积：

a）拟校准体积；

b）移液器标定体积的中间体积。

c）最小可调体积（不小于拟定体积的10％）。

如为固定体积移液器，则只有一种校准体积。

4.2校准步骤

a）将移液器调至拟校准体积，选择合适的吸头；

b）调节好天平；

c）来回吸吹蒸馏水3次，以使吸头湿润，用纱布拭干吸头；

d）垂直握住移液器，将吸头浸入液面2～3mm处，缓慢（1～3秒）一致地吸取蒸馏水；

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e）将吸头离开液面，靠在管壁，去掉吸头外部的液体；

f）将移液器以30℃角放入称量烧杯中，缓慢一致地将移液器压至第一档，等待1～3秒，再压至第二档，使吸头里的液体完全排出；

g）记录称量值；

h）擦干吸头外面；

i）按上步骤称量10次；

j）取10次测量值的均值作为最后移液器吸取的蒸馏水重量，按附表1所列蒸馏水Z因子计算体积；

k）按校准结果调节移液器。

备注：

连续可调移液器校准由某某省标准计量局统一校准。

（附表蒸馏水Z因子