这样在为获得充分分离而调整选择性时，需要进行的试验次数一般不多。
例如图6-7中所示为硝基取代苯衍生混合物分离的溶剂强度选择性实验。
以60%MeOH作为流动相（见图6-7a），峰7/8（箭头所指）为关键峰对；而采用50%MeOH（图6-7c）峰2/3（箭头所指）为关键峰对。
本例中的最佳分离是二者中间的流动相组成：
55%MeOH（图6-7b）。
溶剂强度选择性的应用主要受样品保留值范围的限制[色谱图中首峰（a）与末峰（z）的保留值之比kz/ka]，若保持0.520），可允许的%B变化范围将很小，以改变%B而使选择性发生变化的可能性也很小。
当采用梯度洗脱时，这种限制将不太重要（见8-4-2节）。
6-3-2溶剂类型选择性
改变有机溶剂类型来改变峰间距与改善分离度是一种常用的方法。
按照溶质会影响选择性的那些特征（包括酸性、碱性、偶极性等）选用不同的RPC溶剂。
不同的有机溶剂可根据这些特性进行分类（如图2-6和6-8所示）。
这种选择性表示法（溶剂选择性三角形）在2-3-2节中已有详述。
溶剂分类对实际方法建立的意义在于一般只需选用3种溶剂，即可能将选择性达到要求的结果。
图6-8中的3种水溶性溶剂ACN、MeOH、THF的选择性（阴影部分）有很大差别，其紫外吸收和黏度也较合适，因此推荐这3种溶剂在RPC中作溶剂类型选择性试验。
通过适当地混合这3种溶剂可获得理想的选择性（如果特定样品需要的话）。
图6-6溶剂强度选择性：
改变有机溶剂百分比对样品RPC分离的影响
条件：
15×0.46cmC18柱，流速：
1.5ml/min
图6-9所示为一溶剂类型选择性的典型示例。
50%MeOH改为25%THF使4种化合物的流出顺序完全逆转，但应注意即使流出顺序未发生逆转，选择性的这种变化仍是非常有用的。
对于关键峰对，通过改变一些实验条件，即使选择性（或α值）有微小增加（2~5%），对获得较好的分离也可能是非常必要的。
图6-10所示为一个更复杂的溶剂类型选择示例，采用50%MeOH（如图6-10a）分离取代苯的混合物，重叠峰1/2为关键峰对。
用THF代替MeOH，改变%B保持相同的溶剂强度（见图6-4）。
采用32%THF（如6-10b）时1/2的分离很好，但此时2/3又成为关键峰对。
因此，这两种流动相的某种混合应能更好地分离该样品，以50%MeOH和32%THF按1：
4比例混合可得到如图6-10c的结果。
还应注意，本例中当由50%MeOH改为32%THF时，谱峰4~6的相对保留发生了逆转。
优化选择性时，除ACN、MeOH和THF外，有时也使用二氧六环、丙醇、二甲亚砜、2-甲氧乙醇等。
对于某些样品，用这些替代溶剂可能提供有益的选择性差别，但也必须考虑到它们的一些弊端：
UV吸收高、柱压高、以及纯度与稳定性问题。
在RPC中，改变溶剂类型通常是改变选择性、分离多组分中性样品最有效的措施。
因此，在建立复杂样品的反相分离方法时，调节流动相中有机溶剂种类和浓度应作为一种主要手段。
6-3-3柱类型对选择性的影响
改变柱类型可改变选择性。
在图6-11三种不同柱类型的色谱图中，峰间距确有较大变化。
例如峰6和7在苯基和C18柱上的分离效果好于氰基柱。
相反，峰6和7在氰基柱上的分离效果好于C8柱。
该样品在这种特定的流动相中，苯基柱的分离最好。
改变%B或溶剂类型有可能进一步改变各柱的选择性，所以对图6-11的样品来说，苯基柱可能并非唯一的（或最好的）色谱柱。
如6-2-2节中所述，改变柱类型也会改变整体样品组分的保留值。
几种除莠剂在键合官能团不同的3种色谱柱上，采用35%ACN-水进行的分离见图6-11。
溶质在“较强的”C8柱与苯基柱上保留值较大（且运行时间较长），在“较弱的”氰基柱上则较小改变色谱柱通常不如改变流动相类型效果明显，因此，只有在调整溶剂强度或溶剂类型改变选择性不成功时，才尝试改变柱类型来改善选择性与分离。
如果改变色谱柱，必须针对新柱重新优化流动相。
也有研究表明，氰基、苯基与C8或C18柱的选择性差异很大。
通常应先试验C8或C18柱，然后再试氰基柱、苯基柱。
如果只可以采用一种有机溶剂时，通过改变柱型来改变选择性则较有利。
例如，样品需要在UV短波长检测（<210nm）时只有ACN和水可用。
如某些样品组分或全部样品不稳定或可能与流动相发生反应时，可能需用特殊的有机溶剂。
类型相同、来源不同的色谱柱，也可能会影响RPC峰间距。
如X牌号的C18柱被替换成Y牌号的C18柱，尽管柱长和直径相同，选择性可能发生改变（尤其是离子样品），但我们不推荐这种方法。
这种选择性差别由很多原因引起，包括：
所采用硅胶的类型、键合化学的技术和类型，是否经过封尾处理及其它因素（见第5章中详述）。
不同批次的柱填料之间的差别通常难以控制，导致使用一段时间后，柱重现性不好，RPC方法的普适性变差。
该问题的讨论详见7-3-3节。
上述建议的一个重要例外是不要用来源不同的色谱柱作为改变选择性的手段。
用多官能团（聚合物）硅烷制备的大孔隙RPCC18柱对形状不同的（由于分子内的聚集）多环芳烃（PAH）似乎有独特的选择性。
因此，这种由多官能团硅烷制得的大孔隙柱，适用于PAH样品混合物的分离。
采用PAH测试混合物有可能说明C18键合情况与相应柱的选择性差异，见附录Ⅴ。
选择性相似的RPC柱在一些HPLC法中可以相互替换，可由附录Ⅴ中表Ⅴ-2色谱柱的分类中推断（亦见图5-9）。
环糊精（CD）键合的柱填料也可用于RPC，尤其是用于分离对映异构体（见12-5节）。
这些CD柱在分离其它（非手性）异构体中也很有效。
在这方面，CD键合柱分离异构体可与正相HPLC相比美。
见6-6-1节与图6-12中的示例。
6-3-4温度对选择性的影响
采用RPC分离中性化合物时，k值通常随着柱温升高而降低（见6-2-2节）。
然而，非离子溶质的选择性随温度变化很大的情况不多。
因此，大多数情况下，改变柱温对改变非离子化合物的选择性，进而改变分离的效果不大。
但在图6-13中的情况也可能发生，化合物2与4是两种卷曲分子（邻-三联苯和间-三联苯），而其余4种化合物是平面稠环多环芳烃。
当柱温升高时，平面化合物相对保留值的降低比非平面化合物快。
于是关键峰2~4在温度变化时峰间距发生了变化；峰3在360C时重叠入峰4中，当温度升高时向峰2迁移，480C时与峰2重叠。
而在420C时达到该流动相/固定相系统的最佳峰间距。
图6-7硝基取代苯分离效果与溶剂强度（甲醇百分含量）的关系
箭头所指为关键峰对
6-4反相色谱中非离子样品的分离条件的优化
第9章中总结的RPC方法建立的初始运行方案适用于各种常规样品（离子的或中性的）。
用此方法可以使大多数中性样品达到理想的分离。
也可以通过其它方式更有效地进行方法建立，尤其那些需另外方法建立实验、改变选择性的样品。
本节中对这样一些技术加以阐述，它们包括：
图6-8改良的溶剂选择性三角形
阴影区域为MeOH、AcN、THF的选择性
图6-9RPC中溶剂类型的选择性
（a）50%MeOH-水；（b）25%THF-水；
色谱峰：
1对-硝基苯酚；2对-二硝基苯；3硝基苯；4苯甲酸甲酯
溶剂类型和%B的使用（见6-4-2-2节）
1有机溶剂混合使用（见6-4-2-3节）
2柱类型及%B的改变（见6-4-2-4节）
3不同溶剂和不同柱型的结合使用（见6-4-2-5节）
6-4-1开始
为非离子化合物建立RPC方法的初始推荐条件见表1-3的总结。
选取这些参数必须兼顾分离度、运行时间和柱压。
15或25cm、5μmC8或C18柱为首选，以未经缓冲pH的ACN-水为流动相。
流速1~2ml/min。
为了避免由于室温变化可能引起的保留值和选择性变化，柱温应控制在35~450C之间，但温度控制对于分离非离子样品不很重要。
如果开始不知道UV检测的最佳波长，在210nm检测可能是最佳首选（见3-2-2节）。
图6-10RPC中溶剂类型的选择性
（a）50%MeOH-水；（b）32%THF-水；（c）10%MeOH-25%THF-水。
色谱峰：
1苯乙醇；2苯酚；33-苯丙醇；42，4-二甲基苯酚；5苯；6二乙基邻苯二甲酸酯。
中性样品等度分离的RPC方法建立的推荐方法归纳如表6-2。
首次实验采用等度方法或梯度方法均可。
此处假设采用等度；如首次应用梯度实验（这样更好）见8-2-2与9-2-1节的讨论。
图6-2与6-6所示为采用初始等度分离（100%ACN）与下面进行的试-凑法实验，使样品保留值达到满意（0.5保留太强或太弱的样品需要特殊处理（见9-2-2节）。
另外，若峰拖尾、柱塔板数（N）较低或峰形不理想，则应在继续进行方法建立实验前解决。
这往往需要采用第7章中所讨论的解决方案。
6-4-2优化选择性
使样品保留值范围合适的%ACN确定之后，可能有必要调整选择性以改善分离（即：
使运行时间更短或分离度更佳）。
如本章前面所述，有许多方法可改变选择性：
表6-3中以改变选择性的优先顺序列出了一些可能的方法。
6-4-2-1溶剂强度（%B）的影响改变溶剂强度（%B）方法简便，是分离重叠峰的首选。
如图6-6与6-7中所示，调整%B使保留值范围合适时（0.5最终选择%B时应综合考虑保留值范围（0.5若%ACN值不能得到适宜的选择性（峰重叠），则必须进一步改变实验条件。
当研究用另一方式改变选择性时，最好重新优化%B使0.56-4-2-2溶剂类型与%B的影响对于大多数中性样品来说，当有机溶剂由ACN替换为MeOH或THF时，那些以ACN作溶剂时重叠的峰对的峰间距和分离度有可能发生很大变化。
见图6-14所示的甾体样品的分离。
图6-14左侧3张色谱图的流动相分别为24%ACN、45%MeOH与19%THF为流动相，各图末峰的k=20（即溶剂强度相同）。
其中24%ACN的峰1和3未分开，而用45%MeOH和19%THF时，该2峰可达基线分离。
另外，MeOH和THF的峰4和峰6相对位置发生了变化。
图6-14也说明改变溶剂时，优化%B对选择性及保留值范围（0.5在以ACN作溶剂的情况下，24%ACN（末峰k=20）及42%ACN（首峰k=0.5）均未能将峰1和3分开。
这种情况下，即使再进一步调节%B（修饰剂不变）以改变选择性，也不可能成功分离该混合物。
用MeOH作溶剂，当浓度为45%时（末峰k=20），4/5为关键峰对，但浓度为65%时（首峰k=0.5），1/2则为关键峰对。
改变%B关键峰对也改变时，%B有一中间
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