流式细胞仪临床应用手册范本.docx
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流式细胞仪临床应用手册范本
目录
第一部分流式细胞术简介1
第二部分流式项目检测列表4
第三部分流式细胞术在各类疾病中的应用7
第一章感染性疾病7
第二章肿瘤、细胞治疗应用9
第三章血液系统疾病14
第四章器官移植检测15
第五章风湿免疫性疾病16
第六章呼吸系统疾病18
第七章消化系统疾病20
第八章泌尿系统疾病21
第九章心脑血管疾病22
第十章妇产科及儿科相关疾病24
第十一章内分泌患者免疫功能检测26
第十二章皮肤科疾病27
第一部分流式细胞术简介
1流式细胞术定义
流式细胞仪是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器，为生物医学与临床检验学发展提供了最强有力的工具。
流式细胞分析技术（flowcytometry，FCM）又称流式细胞术，是20世纪70年代发展起来的一种快速、准确、客观的检测技术，它能够同时检测快速直线流动状态中的单个细胞或微球的多项物理及生物学特性--在极短的时间内高速分析上万个甚至是几十万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，对其加以定性定量分析，还可以对特定群体加以分选。
目前，流式细胞术已经广泛用于临床应用与基础研究，在免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等医学与生命科学所有领域内发挥着重要的作用。
2流式细胞仪工作原理
制备成单细胞悬液的标本或单个微粒在上样前进行荧光染色。
流式细胞仪检测到上样管后，产生一定的气体压力将待测样本压入流动池。
同时鞘液（不含细胞或微粒的缓冲液）在仪器产生的高压作用下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与样本流形成一定的角度，形成一个圆形的鞘液流，包围着细胞或微粒高速流动，使待测细胞在鞘液的包裹下单行排列，逐个地通过流式细胞仪的激光聚焦区（流动池），从而被检测到，并发出散射光及荧光等多种光学信号。
光学信号通过光电信号转换器及电子信号处理系统采集及分析后，最后以图形的形式将数据结果显示在电脑屏幕上。
3流式细胞仪的主要结构
光学系统，液流系统，信号处理及放大系统，计算机系统。
4流式细胞仪检测信号
散射光信号：
FSSS
荧光信号：
FL1FL2FL3FL4…
5流式结果数据分析
双参数点图分析
双参数点图分析
单参数直方图分析
三维图分析
双参数密度图分析
双参数等高图分析
6流式细胞仪检测样品
可用于流式细胞仪检测的样本种类多样，包括各种细胞（如外周血、骨髓、细针穿刺、灌洗液、实体组织、悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等；血清、血浆、培养上清、细胞裂解液等。
如果检测样本为实体组织时，我们可以用物理化学（天然，机械研磨/消化）等方法将其制备成单细胞悬液5×105－1×107cells/ml，并在上机前用300目筛网过滤。
7流式细胞仪检测范围
细胞结构
细胞功能
细胞大小
细胞表面/胞浆/核的特异性抗原
细胞颗粒度
细胞活性
细胞表面面积
细胞内/外细胞因子
核浆比例
酶活性
DNA含量和细胞周期
激素结合位点
RNA含量、蛋白质含量
细胞受体
……
蛋白磷酸化
钙离子浓度
……
第二部分流式项目检测列表
序号
项目名称
项目内容
参考值
标本要求
1
淋巴细胞亚群
T细胞亚群
EDTA或肝素抗凝全血0.5～1ml
T淋巴细胞
CD3+
72±7%
辅助/诱导性T细胞（Th，Ti）
CD3+CD4+
43±9%
抑制/杀伤性T细胞（Ts，Tc）
CD3+CD8+
30±9%
Th/Ts
CD4/CD8
1.42±0.89
B淋巴细胞
CD3-CD19+
11.56±2.54%
NK细胞
CD3-CD（16+56）+
14.91±4.87%
2
细胞免疫表型
CD45RA/CD45RO
EDTA或肝素抗凝全血0.5～1ml
幼稚/静止T细胞
CD45RA+CD45RO-
记忆性T细胞
CD45RA-CD45RO+
活化T细胞
CD45RA+CD45RO+
CD3/CD4/CD29
辅助性T细胞（Th）
CD3+CD4+CD29+
16.92±5.35%
诱导性T细胞（Ti）
CD3+CD4+CD29-
CD3/CD8/CD28
抑制性T细胞（Ts）
CD3+CD8+CD28-
15.99±5.13%
杀伤性T细胞（Tc）
CD3+CD8+CD28+
13.22±4.18%
调节性T细胞
CD4+CD25+FOXP3+
3
淋巴细胞亚群活
化程度分析
HLA-DR
总活化T淋巴细胞
静止T淋巴细胞
活化B淋巴细胞
CD3+HLA-DR+
CD3+HLA-DR-
CD3-HLA-DR+
3.1±1.3%
67.10±11.69%
7.42±3.22%
EDTA或肝素抗凝全血0.5～1ml
活化的辅助性/诱导性T细胞
CD4+HLA-DR+
活化的抑制性/杀伤性T细胞
CD8+HLA-DR+
4
细胞因子检测
Th1/Th2
Th1:
IFN-γ
18.7±5.03%
EDTA或肝素抗凝全血0.5～1ml
Th2：
IL-4
2.99±0.72%
5
HLA-B27检测
HLA-B27/HLA-B7
HLA-B27+/HLA-B7-
阳性标准：
HLA-B27+/HLA-B7-百分比＞80%，同时平均荧光强度＞8.0
EDTA或肝素抗凝全血0.5～1ml
6
造血干细胞
造血干细胞相对计数
造血干细胞绝对计数
CD45/CD34
CD45/CD34,绝对计数微球
0.58±0.29%
EDTA或肝素抗凝全血0.5～1ml
7
白血病/淋巴瘤免疫分型
急性白血病
1）初治AL分型粗分首选基本抗体：
CD45、CD10、CD19、CD34、CD13、CD33、CD7、CD117、HLADR、MPO、cCD3、CD79a
2）AL细分推荐选择抗体：
AML：
CD15、CD11b、CD64、CD4、CD16、CD41、CD61、CD71、GPA、CD56
T-ALL：
CD4、CD8、CD3、CD5、CD2、CD1a、CD16、CD56、TdT、αβTCR、γδTCR
B-ALL：
CD20、CD22、CD38、κ/λ、μ
EDTA或肝素抗凝骨髓或外周血
慢性淋巴增生性疾病（CLD）/淋巴瘤
First:
CD5,CD19,kappa,lamdaCD3,CD20,CD23,CD10,CD45
B-cell:
CD22,FMC7,CD11c,CD103，CD38,CD25,CD79b,heavychain，（约12-15Ab）
T-cell:
CD4,CD7,CD8,CD2,CD56，CD16,TCRα/β，TCRγ/δ，（16个Ab）
特殊用途:
CD30,bcl-2,TdT，CD1a,CD34,CD71
EDTA或肝素抗凝骨髓或外周血
淋巴瘤组织
8
T细胞受体
TCR系列检测
TCRVβ1-24
9
多药耐药基因检测
P糖蛋白检测
CD243
10
PNH诊断
CD55/CD59
红细胞CD55/CD59
粒细胞CD55/CD59
CD55+＞95%,CD59+＞90%
CD55+＞95%,CD59+＞90%
EDTA或肝素抗凝全血0.5～1ml
11
网织红细胞/
网织血小板
网织红细胞
网织血小板
TO
网织红：
0.005～0.024%
EDTA或肝素抗凝全血0.5～1ml
12
血小板相关检测
血小板相关抗体
IgA,IgG,IgM
枸橼酸钠抗凝全血0.5～1ml
血小板膜表面糖蛋白
CD41/CD42a/CD61
血小板活化功能
CD61/CD62p/CD63
13
细胞周期
DNA周期和倍体分析
DNA分析诊断肿瘤
1.出现非整倍体细胞峰，DI>1.1或DI<0.9
2.无明显的异倍体，但S期>15%
3.无明显的异倍体，但G0/1的CV>10%，S期在10%-15%
4.S+G2/G1/0>20%
EDTA或肝素）抗凝全血（0.5～1ml）,胸水、腹水、尿液、灌洗液、穿刺液（2×106细胞），穿刺、活检各种实体组织（0.1cm3以上）
14
细胞凋亡
细胞凋亡检测
AnnexinV/PI
AnnexinV/7-AAD
第三部分流式细胞术在各类疾病中的应用
第一章感染性疾病
自有人类以来，就有感染性疾病。
感染性疾病又称“传染病”，严重时甚至可以改变了人类的历史文明。
如十四世纪蒙古帝国的兴起，骁勇善战的骑兵把鼠疫传播至欧洲，造成欧洲中世纪的黑死病，流行四五百年之久，许多城市因鼠疫流行而荒芜甚至消失。
感染性疾病的治疗就是一场病原体与机体免疫系统的战争，当感染发生时，免疫系统的变化往往能很敏感地反映感染的状态与程度。
因此，对机体免疫系统的检测有助于对感染的诊断、治疗效果的动态观察，监测药物疗效，判断疾病的预后。
检测项目及临床意义
1淋巴细胞亚群
感染科
FCM指标（外周血）
CD3+
CD3+CD4
CD3+CD8+
CD19+
CD3-CD16+56+
CD4+/CD8+
肝炎
↓
↓
↓
↑
↓
↑
慢性丙肝
↓
↓
↓
↓
↑
病毒性中型肝炎
↓
↓
↑
↑
↓
肝硬化
↓
↓
↑
↓
细胞病毒感染
↓
↓
↓
流行性出血热
↓
↓
↑
↑
↓
↓
成人麻疹
↓
↓
↓
↓
儿童麻疹
↓
↑
↓
传单
↑
↓
↑
↓
↓
↓
登革热
↓
↓
↓
乙脑
↓
↓
↑
↑
HIV感染
↓
↓
↑
↓
术后CMV感染
↓
↑
↓
2细胞免疫表型、淋巴细胞活化程度分析
CD45RO+CD45RA+的活化细胞增高；
术后感染的评价：
术后感染CD3↓、CD4↓、CD8↑、NK↑、HLA-DR↑；
鉴别急性/慢性病毒感染，判定抗病毒药物治疗效果：
急性感染性疾病及病毒感染进展期，CD45RO记忆性T细胞增高；慢性感染性疾病或接受抗病毒治疗后，记忆性T细胞降低。
3细胞因子检测
3.1移植术后监测：
急排Th1↑；
3.2细胞外感染：
Th2↑；细胞内感染：
Th1↑；
3.3作为过敏性哮喘、过敏性皮炎治疗的评价指标：
Th2↑；
3.4恶性肿瘤：
Th2↑；
3.5自身免疫病：
Th1↑；
3.6耐受：
Th2↑；
4中性粒细胞CD64抗原检测
正常：
中性粒细胞CD64指数（中性粒细胞CD64平均荧光强度/淋巴细胞CD64平均荧光强度）≤1；
感染或组织损伤：
中性粒细胞CD64指数＞1。
第二章肿瘤、细胞治疗应用
肿瘤中的应用
免疫系统能够通过免疫机制对肿瘤进行特异性应答和非特异性应答，该过程涉及多种免疫细胞及其分泌的产物,它们相互影响，相互调节，相辅相成，共同完成免疫监视功能。
虽然机体有免疫监视机制，但肿瘤仍发生并持续发展，原因是肿瘤细胞存在多种免疫逃逸机制。
众多临床实验和研究表明，宿主对机体内发生的肿瘤免疫逃逸，表现为特异性的细胞免疫、体液免疫及非特异性免疫低下。
众所周知，机体的细胞免疫由T淋巴细胞介导，体液免疫由B细胞（CD3-CD19+）介导，非特异性免疫以NK细胞（CD3-/CD56+16+）。
T淋巴细胞进一步分为辅助性T淋巴细胞（Th，CD3/CD4）和细胞毒性/抑制性T淋巴细胞（Tc/Ts，CD3/CD8），Th和Tc对于抗原刺激的应答，辅助性T淋巴细胞分泌细胞因子抑制肿瘤细胞，Ts则抑制机体免疫功能。
所以肿瘤患者的免疫力低下表现为CD3+，CD3+CD4+，CD3-CD56+CD16+，CD19+含量明显低于正常人，而且CD4/CD8比例倒置。
所以了解评估肿瘤患者的免疫状态有重要的临床意义。
检测项目及临床意义
1在肿瘤进展和预后中的意义
国内外研究表明肿瘤的进展和预后取决于肿瘤细胞的侵润性与机体免疫功能的变化。
所以连续监测肿瘤患者的免疫状态是肿瘤患者病程监控和预后的重要指标。
已有众多报道乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌、食管癌等肿瘤，当病程进展、转移或者复发时机体的T细胞、B细胞、NK细胞整体减低。
特别是抑制性免疫细胞比例增加是肿瘤预后的非常重要的指标。
GilbertoFilaci报道在结肠癌、胃癌、肺癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌、乳腺癌、头颈癌等患者中，从T1-T4分级CD8+CD28-Ts细胞明显增高（P<0.01），而且CD8+CD28-增高程度与患者的生存期明显相关（P<0.0001），说明CD28分子具有重要的临床意义。
同时SasadaT,IchiharaF,CurielTJ等在胃癌、食管癌、卵巢癌等报道，同样有抑制作用的CD4+CD25+（Treg细胞）增高预示着肿瘤没有得到控制，患者生存期缩短。
也有文献报道记忆型T淋巴细胞CD4+CD45RO+的表达降低与肿瘤转移相关。
2肿瘤治疗效果监控
Hansbrough曾报道肿瘤患者术后第一天CD4减少，CD8增加，CD4/CD8比值下降，术后3-4天免疫细胞水平开始恢复，表明有效的肿瘤切除，解除了肿瘤细胞对机体的免疫抑制，免疫功能增强。
临床可通过术前后连续监测免疫功能来了解术后患者的恢复情况。
化疗对于肿瘤患者是把双刃剑。
对于恶性肿瘤患者，有效的化疗有可能促进肿瘤患者T淋巴细胞功能的恢复，化疗后CD3+，CD4+、NK细胞、CD3+HLA-DR+显著增高，CD4+CD25+，CD8+CD28-降低达到正常水平。
但由于个体差异和变化，有的化疗会明显降低机体的免疫力，及时调整合适化疗方案，或者给于免疫支持，不但可以杀伤肿瘤细胞还可以重塑机体的免疫力，提高患者的生活质量。
KAZUHIKO研究证明化疗后的毒副作用程度（恶心呕吐/乏力/食欲不振）与CD4/CD8比例负相关，同时CD4+CD25+比例正相关，说明化疗过程中机体免疫状态与生活质量息息相关。
3细胞因子变化
根据T细胞分泌的细胞因子不同，可分为Th1（CD4+IFNg+）和Th2（CD4+IL4+）。
Th1与细胞免疫相关，Th2与肿瘤体液免疫相关。
肿瘤发生时机体细胞免疫低下，所以多种肿瘤患者体内以Th2细胞为主，Th1明显减少；随着肿瘤的发展，Th2细胞比例上升；当Th1细胞上升提示免疫体系恢复；Th1细胞下降，Th2升高提示复发、残留或转移。
切除肿瘤后Th2细胞下降，Th1细胞升高。
4细胞周期分析
人体正常的体细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量，当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变。
所以DNA非整倍体出现是癌前病变发生癌变的一个重要指标。
对于非整倍体的肿瘤，其恶性程度高，复发率高，转移率高，预后差；近二倍体和二倍体肿瘤，则预后较好。
DNA诊断肿瘤标准，如下：
4.1出现非整倍体细胞峰，DI>1.1或DI<0.9；
4.2无明显的异倍体，但S期>15%；
4.3无明显的异倍体，但G0/1的CV>10%，S期在10%-15%；
4.4S+G2/M>20%。
临床
意义
FCM指标（外周血）
CD3+
CD3+CD4+
CD3+CD8+
CD3-CD16+56+
CD4+CD25+
CD8+CD28-
CD4+CD45RO+
CD3+
HLADR+
CD4+/CD8+
Th1
Th2
肿瘤进展
↓
↓
↑
↓
↑
↑
↓
↓
↑
预后不良
↓
↓
↑
↑
↑
↓
复发转移
↓
↓
↑
↓
↓
↓
↓
↑
有效手术
↑
↑
↓
↑
↓
↓
↑
↑
↓
↓
有效化疗
↑
↑
↓
↑
↓
↓
↑
↓
生活质量差
↓
↓
↑
↓
↑
↑
↓
↓
细胞治疗应用
细胞治疗可以利用某些具有特定功能的细胞来治疗疾病。
现在细胞治疗在造血及免疫系统疾病、肿瘤性疾病、心血管系统疾病、神经系统疾病、肌肉骨骼相关疾病、糖尿病等多种疾病的临床治疗中得到广泛的应用。
特别成为肿瘤辅助治疗的重要手段，其中过继性免疫治疗在肿瘤中应用最广。
细胞免疫治疗的关键是输注细胞的数量和质量，因而在体外培养出大量、高质量的效应细胞成为治疗效果。
检测项目及临床意义
1CIK和DC-CIK在肿瘤细胞治疗中应用
CIK是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子（如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等）共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。
CIK细胞中的效应细胞是主要来源于CD4-CD8+细胞的CD3+CD56+细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。
因此，应用CIK细胞被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。
CIK细胞与DC细胞共培养可使CIK细胞获得更快的增殖速率和更强的抗肿瘤活性，利用DC-CIK免疫治疗联合放化疗及手术治疗，有助于减少恶性肿瘤的转移与复发，进一步提高临床疗效。
2干细胞治疗
干细胞作为一类既有自我更新能力、又有多分化潜能的细胞，具有非常重要临床应用价值，所以现正日益广泛地用于各种血液病、肿瘤及某些遗传性疾病的治疗。
应用最广泛的是造血干细胞移植，就是给完全丧失造血功能的患者通过中心静脉输入造血干细胞，使患者骨髓恢复再造血功能的一种治疗方法。
主要适用于再生障碍性贫血等造血功能障碍性疾病、急、慢性白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤等造血系统肿瘤。
现在自体造血干移植也用在乳腺癌、卵巢癌、神经母细胞瘤等实体肿瘤经超大剂量化疗后、全身放疗后的骨髓功能的重建。
在造血干细胞移植过程中，需要根据移植者的体重来确定移植细胞数量，而且需要保证移植的干细胞的功能，所以造血干细胞移植前准确定量干细胞数量和活性非常重要。
FCM检测项目
临床意义
CD45+CD34+7AAD-
造血干细胞采集、培养过程中监测干细胞数目和活性；移植前根据体重不同确定输入数量
CD3+CD8+
监测移植者免疫状态,CIK培养过程中监测CIK诱导情况
CD3+CD4+
监测移植者免疫状态,CIK培养过程中监测CIK诱导情况
CD3+CD56+
监测移植者免疫状态,准确知道CIK培养过程中CIK细胞数量
CD11C+
骨髓来源DC成熟标志，监测诱导分化DC细胞数量
CD80+/CD86+
DC活化标志
DC1（髓系DC）/DC2（淋巴系DC）
细胞治疗前后检测周血中含量了解免疫状态和治疗效果
第三章血液系统疾病
检测项目及临床意义
1白血病淋巴瘤（见白血病淋巴瘤病例分析手册）
2贫血
网织红细胞计数，评价疗效。
3血小板减少
3.1再生障碍性贫血等：
血小板计数：
在血小板<2万/ul或造血异常导致血小板大小不均匀时，血球计数仪结果误差很大，流式计数最准确；
网织血小板计数：
评价疗效；
3.2ITP：
血小板相关抗体检测，正常为阴性。
4出凝血疾病
血小板活化：
CD62p、CD63>3%提示血小板活化，有凝血倾向。
5阵发性睡眠性血红蛋白尿PNH
实验室诊断金标准，CD55、CD59，正常人阳性表达>95%，患者表达下降或缺失。
第四章器官移植检测
检测项目及临床意义
1骨髓移植
CD34+造血干细胞计数，保证移植所需细胞量。
2移植后监测
2.1排斥反应的评价
CD3+/CD25+高于正常5-10%以上，表明即将或已发生排斥反应；
CD4/CD8比值下降提示并发凶险感染，<0.2%则必须停用免疫抑制剂；
CD3+/HLA-DR+增加5-10%且不伴有CD25+增加提示巨细胞病毒感染；
CD4+/CD45RA+及Th17数量与急性排斥反应严重程度正相关；
NK细胞（CD3-CD16+56+）是参与急性免疫排斥反应的重要效应细胞；
Th1（CD4+INF+）是介导急慢性免疫排斥反应的主要细胞。
2.2排斥反应的调控
Treg（CD4+CD25+CD127dim）对移植后急慢性排斥反应起负调控作用；
DC细胞：
mDC细胞抑制免疫排斥反应的发生，pDC通过Treg维持免疫耐受。
第五章风湿免疫性疾病
风湿免疫系统疾病主要包括风湿病和免疫病。
风湿一词起源于古希腊。
公元前4世纪，《希波克拉底全集》有关人体解剖一文中认为：
人体的体液由于湿冷而下注于四肢、内脏引起疾病，即为风湿。
我国《黄帝内经》（公元前5世纪）也把风寒湿三气杂合为痹。
因为风湿病大多累及关节而引起疼痛，所以风湿这一词一直沿用至今，风湿病是一种全身性疾病，主要累及结缔组织，大多数病人有关节、肌肉的病变。
与机体的免疫学异常有关，是属于自身免疫性疾病。
因此，对机体免疫系统的检测能有效地帮助判断疾病的发生及监控治疗疗效，判断预后。
检测项目及临床意义
1淋巴细胞亚群及绝对计数
疾病
FCM指标（外周血）
CD3+
CD3+CD4+
CD3+CD8+
CD3-CD16+56+
CD4+/CD8+
自身免疫性疾病
SLE
↓
↓
↑
类风湿性关节炎
↓
↓
↑
自身免疫性溶血性贫血
↓
↓
↑
重症肌无力
↓
↓
↑
免疫缺陷病
AIDS
↓
↓
↑
↓
CD4+T淋巴细胞记数测定的主要意义：
①用于HIV感染者的疾病分期：
凡CD4+T淋巴细胞＜200/μl或CD4+T淋巴细胞的百分比＜14%的HIV感染者可归入艾滋病。
②判断HIV感染者的临床合并症（各种机会性感染与CD4+T淋巴细胞的相关性），如CD4+T淋巴细胞＜200/μl时，很容易发生卡氏肺囊虫肺炎；而巨细胞病毒感染和鸟分支杆菌感染常发生于CD4+T淋巴细胞＜50/μl的病人，极少见于CD4+T淋巴细胞＞100/μl的病人。
③帮助确定抗HIV药物治疗及机会性感染预防性治疗的适应症，例如，当CD4+T淋巴细胞＜200/μl时，应给予抗卡氏肺囊虫肺炎的预防性治疗。
④抗HIV药物疗效的重要判断指标。
2淋巴细胞免疫表型分析
淋巴细胞免疫表型分析联合淋巴细胞亚群分析，能更全面的评价细胞免疫状态，评估机体的免疫功能，监测药物疗效，判断疾病的预后。
如：
风湿性关节炎关节液中CD4+CD29+细胞增多。
多发性硬化（MS）、SLE患者外周血CD4+CD45RA+细胞减少。
3HLA-B27检测
HLA-B27是MHCI类抗原，在有核细胞上广泛表达，其表达与强直性脊柱炎高度相关，在其它血清阴性骨关节病也有明显表达。
强直性脊柱炎
HLA-B27阳性率超过90%
Reiter’s综和症
HLA-B27阳性率为70-90%
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