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实验方法汇总

可溶性蛋白、SOD、POD、CAT、MDA的测定

一、磷酸缓冲液的配制：

二、酶液的制备：

称取0.5—1g（FW）放入研钵中，加5×毫升PH=7.8的磷酸缓冲液，冰浴研磨，匀浆倒入离心管中，12000转冷冻离心20分钟，上清液（酶液）倒入试管中，置于0—4ºC下保存待用。

三、可溶性蛋白的测定

1、试剂的配制:

牛血清白蛋白标准液（100g/mL）：

精确称取0.0100g牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解后定容至100mL（4℃保存）。

考马斯亮蓝G-250染色液：

取0.10g考马斯亮蓝G-250，溶于50mL95%的乙醇中，加入100mL85%的正磷酸，再用蒸馏水定容到1000mL。

过滤待用。

该试剂于常温下可保存1个月。

2、标准曲线制作

0—1000μg/ml标准曲线的制作

取6支10ml具塞试管，按下表取样。

盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后，在595nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD值，并做出标准曲线。

表0~1000μg/ml标准曲线

管号

1000μg/ml母液（ml）

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

DH2O（ml）

1.00

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

G-250试剂（ml）

蛋白质含量（μg）

200

400

600

800

1000

OD250

2、样品测定

取2支试管（10ml具塞，作为3个重复），按下表加样：

管号

空白

样品

待测样品（ml）

0.08

DH2O（ml）

1.00

0.92

G-250

OD595

蛋白质含量

3、计算结果

样品中蛋白质含量（μg/gFW）=

其中X为在标准曲线上查得的蛋白质含量，μg；V0为提取的总体积，ml；V1为测定蛋白质时所用的体积，ml；W为样品鲜重，g。

四、SOD的测定：

1、SOD反应液的配制：

（1）0.05M磷酸缓冲液（PH=7.8）

（2）130mMMet（甲硫氨酸）：

取1.9399克Met用磷酸缓冲液定容至100ml；

（3）750μM四氮唑蓝（NBT）：

取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml；

（4）100μMEDTA-Na2:

取0.0372gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml，避光保存；

（5）20μM核黄素（FD）:

0.00753gFD用磷酸缓冲液定容至1000ml。

（取0.0753gFD用磷酸缓冲液定容至1000ml，取10ml稀释至100ml）

酶液：

磷酸缓冲液：

Met：

NBT：

EDTA-Na2：

FD：

H2O的比例为0.1：

1.5：

0.3：

0.2，按母液顺序配制。

2、SOD的测定：

取型号相同的四支试管，一支做空白，一支做对照（均不加酶液，以缓冲液代替）；空白置暗处，遮光保存，对照（CK）与酶液同置于4000Lux条件下照光20分钟，以空白调零，560nm比色。

表：

SOD反应体系

试剂

空白

（暗处）

对照

（4000Lux）

样品1

（4000Lux）

样品2

（4000Lux）

0.05mol/L磷酸缓冲液

1.6

1.5

130mmol/LMet溶液

0.3

750μmol/LNBT溶液

0.3

100μmol/LEDTA-Na2

0.3

20μmol/L核黄素

0.3

酶液

0.10

蒸馏水

0.2

0.20

总体积

3.0

吸光值

3、结果计算

SOD总活性（吸光度/g·FW）=

单位：

NBT光还原50%为单位

SOD比活性（酶单位/mg蛋白）=SOD总活性/蛋白质浓度

式中：

SOD总活性以鲜重酶单位每克表示；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；ACK为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V0为提取酶液的总体积，ml；V1为测定时所用的体积；W为鲜重，g；蛋白质含量单位为mg/g。

五、POD的测定：

1、0.1MPH6.0磷酸缓冲液的配制：

2、POD反应液的配制：

0.1MPH6.0的磷酸缓冲液50毫升于烧杯中，加入愈创木酚28微升，磁力搅拌器加热搅拌使之完全溶解，冷却后加入30%H2O219微升混合，保存于冰箱中。

3、POD的测定：

20微升酶液+3毫升反应液于比色皿中，20S后在470nm下开始计数，每隔20s读数一次，共读两次，以每分钟吸光度变化值（ΔA470/min·mgpr或ΔA470/mgFW）表示酶活力的大小。

4、结果计算：

POD活性（ΔA470/min·gFW）=ΔA470×V0/V1/W/t

式中：

△A470为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重，g；t为反应时间，min；V0为提取酶液的总体积，ml；V1为测定时所用的体积。

六、CAT的测定：

1、CAT反应液的配制：

0.1MH2O2溶液：

0.568毫升30%H2O2定容至100毫升。

0.1MPH7.0磷酸缓冲液：

0.1M的H2O25毫升+0.1M的PH7.0的磷酸缓冲液20毫升（即按1：

4的比例）混匀，即为CAT反应液。

2.CAT的测定：

0.1毫升（或50微升）酶液+2.5毫升反应液，240纳米下比色，每隔1分钟读数1次，共读数3次。

3.结果计算：

CAT活性（Δ240/min·gFW）=Δ240×V0/V1/W

七、丙二醛（MDA）的测定

1、试剂：

10%的三氯乙酸、0.6%的硫代巴比妥酸（配法：

称取0.6g硫代巴比妥酸，加入10ml1mol/L的NaOH溶液，加热溶解，再加入11ml1.0mol/L的HCl溶液，然后转移到100ml容量瓶中，5小时内使用）

2、MDA测定体系

对照

待测1

待测2

TBA溶液（ml）

2.0

磷酸缓冲液0.05M（ml）

2.0

1.0

酶液

0.0

1.0

按上表加入各溶液，混匀后于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心（3000，15min）。

取上清液测定532、600和450nm波长下的吸光值。

3、含量计算，采用双组分光广度计法，根据公式

（1）：

C1（μmol/L）=6.45（D532－D600）－0.56D450

（1）

其中C1为MDA的浓度，D450、D532、D600分别代表450nm、532nm、600nm波长下的吸光值。

此外还可以计算出溶液中可溶性糖的浓度C2。

C2（mmol/L）=11.71D450

（2）

粗纤维含量的测定

本标准适用于植物类食品中粗纤维含量的测定。

　　一、原理：

　　在硫酸作用下，样品中的糖、淀粉、果胶质和半纤维素经水解除去后，再用碱处理，除去蛋白质及脂肪酸，遗留的残渣为粗纤维。

如其中含有不溶于酸碱的杂质，可灰化后除去。

　　二、试剂：

　　1.25%硫酸。

（取比重1.84的浓硫酸13ml加水稀释至1L）

　　1.25%氢氧化钠溶液、酒精70—85%、乙醚

　　三、实验步骤：

　　1、将磨碎的烘干样品0.5g左右，无损失地倒入具塞三角瓶中。

再烘干滤纸。

注意温度不要过高，一般在80—90度，防止滤纸烘焦影响重量。

2、将200ml1.25%的硫酸倒入瓶中，加热至沸腾时再继续30分钟。

3、冷却之后，用带有已知重量的滤纸过滤，并用热蒸馏水冲洗三角瓶及漏斗3—4次，直到滤液用石蕊试纸试验呈中性反应为止。

4、用1.25%氢氧化钠溶液将滤纸上的沉淀物完全洗入瓶内，将其加热至沸腾再继续30分钟（操作同上）。

5、煮沸后冷却，用酒精冲洗2—3次直至滤液无色为止。

若植物样品含色素多，除用酒精外，还要用乙醚冲洗至无色为止。

6、将滤纸和沉淀在75度的烘箱中烘至恒重（用分析天平称重）。

四、计算：

已知滤纸重量为Wp，滤纸及纤维重量为Wt，则粗纤维重量Wc=Wt－Wp，再换算成百分重量。

硝酸还原酶活性测定

一、原理：

硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮肥有关。

它作用于NO3-使还原为NO2-；产生的NO2-可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应溶液中NO-2的含量的高低，即表明酶活性的大小。

NO2-含量的测定用磺胺（对氨基苯磺酸胺sulfanil—amide）比色法，这种方法非常灵敏，能测定每m10.5ug的NaNO2。

二、仪器药品：

721型分光光度计、真空泵（或注射器）、保温箱、天平、真空干燥器、钻孔器、三角烧瓶、移液管、烧杯

0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.5

0.2mol/LKNO3：

溶解10.11gKNO3于500ml蒸馏水中。

磺胺试剂：

1g磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml。

α—萘胺试剂：

0.2gα—萘胺溶于含1ml浓盐酸的蒸馏水中，稀释至100ml。

NaNO2标准溶液：

0.1gNaNO2用蒸馏水溶解成100ml。

然后吸取0.5ml，再加蒸馏水稀释成100ml，此溶液每ml含有NaNO25μg，用时稀释之。

三、操作步骤

1、将新鲜取回的叶片水洗，用吸水纸吸干，然后用钻孔器钻成直径约1cm的圆片，用蒸馏水洗涤2到3次，吸干水分，然后于天平上称取等重的叶子圆片两份，每份约0.2—0.3g（或每份取30个圆片），分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中：

（1）0.1mol/L磷酸缓冲溶液（pH7.5）5ml+蒸馏水5ml；

（2）0.1mol/L磷酸缓冲溶液（pH7.5）5ml+0.2mol/LKNO35ml。

然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，圆片即沉于溶液中（如果没有真空泵，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中）。

将三角烧瓶置于30℃温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸取反应溶液1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟，在520nm下进行比色测定。

通过标准曲线测得NO2-的含量，然后计算酶活性，以每小时每克鲜重产生的NO2-μg或μmol表示之。

注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可于反应溶液中加入30μg3—磷酸甘油醛或1，6—二磷酸果糖，能显著增加NO2-的含量。

2、绘制标准曲线

与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色速度，同时也影响灵敏度，但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行，则显色速度相同，彼此可以比较。

吸取不同浓度的NaNO2溶液（例如5、4、3、2、1、0.5μg/ml）1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟（或于一定温度的水浴中保温30分钟），立即于分光光度计中进行测定，测定时的波长为520nm，比色，读取吸光度或透光率。

然后，以吸光度为纵坐标，NaNO2浓度为横坐标绘制吸光度—浓度曲线。

表：

标准曲线的制作

NaNO2浓度（μg/mL）

0.5

标准母液（mL）

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.1

蒸馏水（mL）

0.2

0.4

0.6

1.0

磺胺（mL）

α—萘胺

OD值

叶绿素含量测定（张宪政三波长检测法）

一、药品：

乙醇：

丙酮=1：

1混合液（各5ml）

二、方法：

1、提取称取0.05g左右或用打孔器打0.1dm2叶圆片,放入试管中（最好用密封的刻度试管）,加10ml提取液,密封,写好处理编号,置于试管架上,在黑暗条件下浸提24-36小时（至叶片脱色变白）.

2、比色测定

（1）调杯误差把比色杯编号,清洗干净,干燥后待用;杯中加入空白提取液,以1号杯在663nm处调零,然后记录其它3个杯在此波长下的OD值;然后波长转到645nm下,以1号杯调零再记录其它三个杯的数值;最后转到440nm下重复上述步骤.

（2）测样品1号杯空白液保留,其它三个比色杯倒出液体,控干,倒入少量待测液润洗（润洗液倒入入废液缸中）,再次倒入待测液体,三个杯均装好后,进行比色测定.（注意测定一个波长后在转到另一个波长时要重新调零）,记录测定OD值.

3、计算:

所得的OD值代入以下公式求得溶液色素浓度（mg/L）

Chla=12.7D663－2.59D645

Chlb=22.9D645－4.67D663

Chla+b=20.3D645+8.04D663

Ca2=（1000D440－3.27Chla－104Chlb）/229

得到结果代入下式中得到单位叶面积重或面积叶绿素含量

叶绿素含量（mg/g）=C×V/A×1000或

叶绿素含量（mg/dm2）=C×V/A×100

测定液中叶绿素浓度（mg/L）

提取液总体积（ml）

叶鲜重（g）或叶面积（dm2）

蒽酮法可溶性糖含量的测定

一、试剂：

标准葡萄糖母液：

在电子天平上称取100mg分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水中，定容至500ml，则得每ml含糖量为200ug的标准溶液。

蒽酮试剂：

称取1g蒽酮结晶粉末，溶解于1000ml稀硫酸溶液中即得。

[稀硫酸溶液由760ml浓硫酸（比重1.84）稀释成1000ml而成]

二、方法步骤

1、标准曲线的制作。

取标准糖溶液将其稀释成一系列不同浓度的溶液各10毫升，浓度分别为每毫升含糖0、25、50、75、100、120、150、200微克。

将试管编号，依次将每管中加入1毫升上述葡萄糖标准溶液及5毫升的蒽酮试剂，震荡使之完全混合，在沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却，然后在分光光度计波长620纳米下比色，测定各溶液的光密度，以光密度为纵坐标，糖溶液浓度为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。

2.测定样品的可溶性糖含量

称取重量3g的新鲜植物叶子，于研钵中仔细研磨，研磨时加乙醚少许，倒入烧杯中，用热水（70oC）洗涤研钵，洗涤液并入烧杯中，再加入蒸馏水约30～40ml。

将烧杯放在水浴锅上加热，保持温度70～80oC半小时，冷却后一滴一滴地加入饱和中性醋酸铅以除去混合液中的蛋白质，直至不再形成白色沉淀为止，然后将此混合物连同残渣一并洗水100ml容量瓶中，加水至刻度，充分摇荡，用漏斗过滤到三角烧瓶中，瓶中事先放有少量（约0.2—0.4g）的草酸钠粉末，以除去滤液中过量的醋酸铅，使生成草酸铅沉淀，再行过滤，所得透明滤液即为可溶性糖提取液。

取1ml这种糖提取液，加入5ml蒽酮试剂，混匀后立即置于沸水中，煮沸10分钟，取出冷却后比色。

五、计算

根据光密度值从标准曲线上查出相应的糖含量，按下列公式计算出样品的含糖量：

可溶性糖含量%=

×100%

A为植物样品稀释后的体积（ml）

C为提取液的含糖量（μg/ml）

W为植物组织鲜重量（g）

绿原酸含量测定（紫外分光光度法）

1、标准曲线的绘制:

精密称取绿原酸标准样品?

mg（0.25mmol），用95%乙醇溶解，转移到250ml容量瓶中，加95%乙醇到刻度，混匀。

此溶液浓度为1μmol/mL。

精密吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1mL到25ml容量瓶中，加95%乙醇到刻度，混匀，此为标准系列溶液。

在330nm处测定吸光度，以绿原酸标准品的浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘制标准曲线，并求出相应的回归方程。

2、样品中绿原酸含量的测定

（1）提取液的制备：

准确称取干物质0.2g左右，置于10ml容量瓶中，量取约10ml95%的乙醇溶解样品，并置于85℃的恒温水浴箱中，4h。

放置、冷却至室温，过滤。

（2）含量测定：

吸取1ml过滤液用95％乙醇定容至10ml容量瓶，待用。

以95%的乙醇作空白，在330nm处测定吸光度，由标准曲线计算出待测样品液浓度。

绿原酸标准液（mL）

0.1

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

绿原酸浓度（μmol/L）

0.4

0.8

1.6

2.4

3.2

4.0

吸光值

3.绿原酸含量计算：

绿原酸含量＝C×5×M/干物质重

由标准曲线查得的浓度

α-萘胺氧化法测定根系活力

一、试剂

α-萘胺溶液：

称取12.5gα-萘胺，先用2mL左右的95％乙醇溶解，然后加水定容到250mL，成为50μg/mL的溶液。

0.1mol/LpH7.0磷酸缓冲液

1%对氨基苯磺酸：

将1g对氨基苯磺酸溶解于100mL30％醋酸溶液中。

亚硝酸钠溶液：

称10mg亚硝酸钠溶于100mL水中。

二、实验步骤

1、α-萘胺的氧化：

挖出蒲公英植株，并用水洗净根系上的泥土，剪下根系，再用水洗，待洗净后用滤纸吸去根表面的水分，称取1-2g放在100mL三角瓶中。

然后加50μg/mL的α-萘胺溶液与磷酸缓冲液等量混合液50mL，轻轻振荡，并用玻棒将根全部浸入溶液中，静置10min，吸取2mL溶液测定α-萘胺含量，作为实验开始时的数值。

再将三角烧瓶加塞，放在25℃恒温箱中，经一定时间后，再进行测定。

另外，还要用另一支三角烧瓶盛同样数量的溶液，但不放根，作为α-萘胺自动氧化的空白，也同样测定，求它自动氧化量的数值。

2、α-萘胺含量的测定：

吸取2mL待测液，加入10mL蒸馏水，再在其中加入1％对氨基苯磺酸1mL和亚硝酸钠溶液1mL，室温放置5min待混合液变为红色，再用蒸馏水定容到25mL。

在20-60min内510nm处比色，读取OD，在标准曲线上查得相应的α-萘胺浓度。

从实验开始10min时的数值送去自动氧化的数值，即为溶液中所有的α-萘胺的量。

被氧化的α-萘胺的量以μg/g·h表示。

因此，还应将根系烘干称其干重。

3、绘制α-萘胺的标准曲线：

取浓度为50μg/mL的α-萘胺溶液，配制成浓度为50、45、40、35、30、25、20、15、10、5μg/mL的系列溶液，各取2mL放入试管中，加蒸馏水10mL，1％对氨基苯磺酸溶液1mL和亚硝酸钠溶液1mL，室温放置5min待混合液变为红色，再用去离子水定容到25mL。

在20-60min内510nm处比色，读取OD。

然后以OD510作为纵坐标，α-萘胺浓度为横坐标，绘制标准曲线。

还原型VC含量的测定

一、试剂

5%的钼酸铵溶液：

（w/v）准确称取钼酸铵5.000g，加适量水溶解后定容至100ml）；5%的硫酸溶液（v/v）;

草酸EDTA溶液：

（草酸0.05mol/L、EDTA0.2mmol/L，准确称取含结晶水的草酸6.3000g，EDTA0.0584g，充分溶解定容至1000ml）;

偏磷酸-醋酸溶液（摇动溶解3g片状偏磷酸于8ml醋酸中，稀释至100ml用滤纸过滤，取滤液备用）。

标准VC溶液：

准确称取60g真空干燥2h的VC0.0500g，用上述配好的草酸-EDTA溶液定容于50ml的容量瓶中，使标准溶液浓度达到1mg/ml。

二、实验步骤

1、还原性VC含量的测定：

称取蒲公英鲜叶5g，匀浆后用草酸EDTA溶液定容至10mL容量瓶，过滤，吸取上清液待用。

吸取2mL提取液于50mL容量瓶中，然后加入8mL草酸-EDTA溶液。

再加入1.00ml偏磷酸-醋酸溶液和5%的硫酸溶液2.0ml，摇匀后加入4.00ml钼酸铵，用蒸馏水定容到50mL。

以蒸馏水代替提取液作空白在705nm处测定吸光度。

2、标准曲线制作：

分别吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准液于10mL容量瓶中，用草酸-EDTA溶液定容到10mL。

转入50mL容量瓶中，再加入1.00ml偏磷酸-醋酸溶液和5%的硫酸溶液2.0ml，摇匀后加入4.00ml钼酸铵，用蒸馏水定容到50mL。

以蒸馏水代替提取液作空白，15min后在705nm处测定吸光度。

VC标准液（mL）

0.1

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

VC浓度（μg/mL）

草酸-EDTA溶液（mL）

9.9

9.8

9.6

9.4

9.2

9.0

偏磷酸-醋酸溶液（mL）

1.0

5%的硫酸溶液（mL）

2.0

钼酸铵（mL）

4.0

蒸馏水（mL）

吸光值

三、结果计算

还原型VC含量（μg/g）＝C×V1/（W×V）

由标准曲线查得的VC含量（μg）；V1：

测定用样品液体积（mL）；

W：

样品鲜重（g）；V：

样品液定容总体积（mL）。

硝态氮（硝酸盐）含量的测定

一、试剂：

（1）500mg/L：

硝态氮标准溶液：

精确称取烘至恒重的KNO30.7221g溶于蒸馏水中，定容至200ml。

（2）5％水杨酸-硫酸溶液：

称取5g水杨酸溶于100ml比重为1.84的浓硫酸中，搅拌溶解后，贮于棕色瓶中，置冰箱保存一周有效。

（3）8％氢氧化钠溶液：

8g氢氧化钠溶于1ml蒸馏水。

二、方法：

1、标准曲线的制作：

（1）吸取500mg/L硝态氮标准溶液1、2、3、4、6、8、10、12ml分别放入50ml容量瓶中，用无离子水定容至刻度，使之成为10、20、30、40、60、80、100、120ml/L的系列标准溶液。

（2）分别吸取上述系列标准溶液0.1ml于试管中，以0.1ml蒸馏水代替标准溶液作空白。

再分别加入0.4ml5%水杨酸-硫酸溶液，摇匀，在室温下放置20min后再加入8％NaOH溶液9.5ml，摇匀冷却至室温。

（3）以空白作参比，在410nm波长下测定光密度。

绘制标准曲线。

2、样品中硝酸盐的测定

（1）取样品鲜重2g左右，放入20ml刻度试管中，加入10ml无离子水，置于沸水浴中提取30min。

到时间后取出，用自来水冷却，定容至刻度。

（2）样品液的测定：

吸取样品液0.1ml于试管中，然后加入5％水杨酸-硫酸溶液0.4ml，混匀后置室温下20min，再慢慢加入9.5ml8％NaOH溶液，待冷却至室温后，以空白作参比，在410nm波长下测其光密度。

在标准曲线上查得硝态氮浓度，再用以下公式计算其含量。

三、结果计算：

硝态氮含量＝DV/W

D：

从标准曲线上查得的硝态氮浓度；

V：

样品液总量；

W：

样品鲜重。

电导率测定方法

1．清洗用具：

由于电导率仪对溶液中的电解质含量变化极为灵敏，所以实验开始前必须首先清洁实验用具。

玻璃用具和打孔器先用去污粉（或洗液）清洗，再分别用自来水、无离子水冲洗数遍，然后放入（或倒置在）洗净且垫有洁净滤纸的瓷盘中，并用盖子或洁净纱布盖好。

2．材料准备：

本实验选取颜色、大小、

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