SDSPAGE电泳过程中常见问题以及解决方法要点.docx
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SDSPAGE电泳过程中常见问题以及解决方法要点
SDS—PAGE电泳过程中常见问题以
及解决方法
几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所有条件总
要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集，最
常用的就是SDS—PAGE电泳技术，关于大家在此过程中经常遇到的问题进行一些讨论：
Q:
SDS—PAGE电泳的基本原理？
A:
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：
logMW二K-bX，式中：
MW
为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
Q:
配胶缓冲液系统对电泳的影响？
A:
在SDS—PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris—HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9;而电泳缓冲液使用的Tris—甘氨酸缓冲系统。
在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，
因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子
却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所
以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
Q:
样品如何处理？
A:
根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：
还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
1、还原SDS处理：
在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。
一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。
2、带有烷基化作用的还原SDS处理：
碘乙酸胺的烷基化作用可以
很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。
100ul样品缓冲液中10ul20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。
3、非还原SDS处理：
生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%
SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。
Q:
SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？
A：
聚丙烯酰胺的作用：
丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体，其凝固的
好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；
制胶缓冲液：
浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris
—HCL系统，具体作用后面介绍；
TEMED与AP:
促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；
十二烷基硫酸钠（SDS）:
阳离子去污剂，作用有四：
去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
Q:
提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？
A:
1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。
建议做法：
待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。
忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。
一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。
2、一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。
Q:
微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？
A:
主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。
处理办法：
待其充分凝固再作后续实验。
Q:
皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因?
A:
主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气
泡未排除干净。
处理办法：
可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。
Q:
为什么带出现拖尾现象？
A:
主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。
处理办法：
加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。
Q:
为什么带出现纹理现象？
A:
主要是样品不溶性颗粒引起的。
处理办法：
加样前离心；加适量样品促溶剂。
Q:
什么是鬼带”，如何处理？
A:
鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被
解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其
分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。
但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。
处理办法：
在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。
Q：
为什么溴酚蓝不能起到指示作用？
A:
我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下
来的现象。
主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。
处理办法：
更换正确pH值的Buffer;降低分离胶的浓度。
Q:
为什么电泳的条带很粗？
A:
电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。
处理办法：
适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确
（6.7）；适当降低电压；
Q:
为什么电泳电压很高而电流却很低呢？
A:
这种现象一般初学者易出现。
比如电压50v以上，可电流却在
5mA以下。
主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。
包括:
a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。
处理办法：
电泳槽正确装配即可。
Q：
浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？
A:
这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。
前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。
简介
聚丙烯酰胺凝胶电泳作用：
用于分离蛋白质和寡糖核苷酸
作用原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应。
它有两种形式：
（1）非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。
而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。
该技术最初由Shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。
作用
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS
结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE-般采用的是不连续缓冲系统，于连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。
电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。
蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。
电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。
此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。
补充信息
聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamdegel
electrophoresis）
聚丙烯酰氨凝胶电泳
，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。
催化聚合的常用方法有两种：
化学聚合法和光聚合法。
化学聚合以过
硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED为加速剂。
在聚合过程
中，TEMEDS化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主
要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH,凝胶浓
度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。
浓缩胶是由AP催化聚
合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。
分离胶是由AP催化聚
合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9Tris-HC1。
电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。
2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
过程
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。
如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。
1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS具有这种作
用。
当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，SDS可使蛋白质分子中
的二硫键还原。
由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质一SDS复合物都
带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而
掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构
象改变，蛋白质一SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋
白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为18A，这样的蛋白质一SDS复合
物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于
分子量的大小由于蛋白质一SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以
它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。
因而SDS聚丙烯酰胺凝
胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。
当分子量在15KD到200KD之间时，
蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：
logMW=K-bX,式
中：
MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。
SDS-聚丙烯
酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。
常见问题及分析
1.配胶缓冲液系统对电泳的影响？
在SDS-PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris—HCL缓冲系
统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9;而电泳缓冲液使用的Tris—甘氨酸缓冲系统。
在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的
区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸
大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
2.样品如何处理？
根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：
还原SDS处理、非还
原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
1）还原SDS处理：
在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。
一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。
2）带有烷基化作用的还原SDS处理：
碘乙酸胺的烷基化作用可以很好
的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT,而防止银染时的纹理现象。
100ul样品缓冲液中10ul20%的碘乙酸
胺，并在室温保温30min。
3）非还原SDS处理：
生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子
量来使用。
3.SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？
聚丙烯酰胺的作用：
丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；
制胶缓冲液：
浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris—HCL
系统，TEMED^AP:
AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（SDS:
阳离子去污剂，作用有四：
去蛋
白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
4.提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？
聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。
建议做法：
待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。
忌即配即用或4度冰箱放置，
前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。
一般凝胶可在室温下保存4
天，SDS可水解聚丙烯酰胺。
一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》
P82-103。
5.“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？
主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。
处理办法：
待其充分凝固再作后续实验。
6.“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？
主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。
处理办法：
可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。
7.为什么带出现拖尾现象？
主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。
处理办法：
加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。
8.为什么带出现纹理现象？
主要是样品不溶性颗粒引起的。
处理办法：
加样前离心；加适量样品促溶剂。
9.什么是“鬼带”，如何处理？
“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。
但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。
处理办法：
在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补
充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。
10.为什么溴酚蓝不能起到指示作用？
我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。
主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。
处理办法：
更换正确pH值的Buffer;降低分离胶的浓度。
11.为什么电泳的条带很粗？
电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。
处理办法：
适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；
适当降低电压；
12.为什么电泳电压很高而电流却很低呢？
这种现象一般初学者易出现。
比如电压50v以上，可电流却在5mA以
下。
主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。
包括：
a.内外槽
装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。
处理办法：
电泳槽正确装配即可。
13.浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？
这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。
前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。
14.凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？
通常胶在30MIN-1H内凝。
如果凝的太慢，可能是TEMEDAPS剂量不
够或者失效。
APS应该现配现用，TEMED^稳定，易被氧化成黄色。
如果
凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。
15.电泳时间比正常要长？
可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地
PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。
电泳相关溶液的配置：
1、30%丙稀酰胺混合溶液（100ml）:
称取29g丙稀酰胺和1gbis丙稀酰胺，用水溶解定容到100ml，过滤，4摄氏度保存一个月。
2、5XSDS电极缓冲液：
称取Trisbase15.1g甘氨酸94.g,SDS5.g加dH2O定容至1000ml。
3、2X样品缓冲液（10ml）:
甘油2ml，溴酚蓝0.0202g,IMTris•Cl（pH6.8）1ml巯基乙醇0.14ml，10%SDS4ml。
4、染色液的配制（1000ml）:
用量筒分别量取250ml甲醇或者乙醇、80ml乙酸；在电子天平上称取0.125%考马斯亮蓝R2501.25g,再将其加到1000ml锥形瓶中，
用蒸馏水加以补足至1000ml。
加入的先后顺序为：
考马斯亮蓝R250,
甲醇或者乙醇，蒸馏水，乙酸。
充分混匀后进行过滤，收集滤液备用。
当过滤速度变慢时要更换滤纸，快速过滤完，不可隔夜以免影响染色效果。
5、脱色液（1000ml）:
用量筒分别量取250ml甲醇或者乙醇、80ml乙酸、670ml蒸馏水加入烧杯中，待溶液混和均匀后加入盛脱色液的广口瓶；备用。
收集液的SDS-PAG分析：
1、取20ul收集液，加入5X样品缓冲液5ul，在80C水浴锅中煮5min。
分离胶配方
ResolvingGel（10ml）
6%
8%
10%
12%
15%
H2O
5.4
4.7
4.1
3.4
2.4
30%acrylamidemix
2.0
2.7
3.3
4
5
4xresolving-gelbuffer
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
20%SDS
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
20%APS
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
TEMED
0.0080.0060.0040.0040.004浓缩胶配方（10ml）
H2O
6.9ml
30%acrylamidemix1.7ml
8xstacking-gelbuffer1.25ml
20%SDS0.05ml
20%APS0.05ml
TEMED0.01ml
2、按照上面配方制SDS-PAG凝胶，安装好电泳仪，在槽中加入电极缓冲液。
3、按一定顺序在加样孔中加入样品。
4、打开电源将电压调到80v，待样品跑过压缩胶后将电压调到120v至样品电泳到胶底部为止。
5、将凝胶小心取下放入容器中，加入染色液，用摇床摇2－3h
6、待条带清晰后倒出染色液，加入脱色液过夜
7、将脱色液倒掉，在灯箱下观察
8、用数码相机拍照，分析。
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