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4论文12生工辛悦
SRTP论文
题目产低温纤维素酶微生物的筛选与鉴定
学院食品科学与工程学院
专业生物工程
姓名辛悦
指导教师张卫兵副教授
食品科学与工程学院制
二〇一五年
目录
前言1
1材料与方法2
1.1实验材料2
1.1.1样品2
1.1.2培养基2
1.1.3主要试剂2
1.1.4主要仪器2
1.2实验方法3
1.2.1纤维素酶产生菌的初筛3
1.2.2纤维素酶产生菌的复筛3
1.2.3形态学观察4
1.2.4菌株的分子生物学鉴定5
1.2.5酶的最适温度5
1.2.6产酶曲线的测定5
2结果与分析5
2.1纤维素酶产生菌的筛选5
2.1.1葡萄糖标准曲线5
2.1.2初筛结果5
2.1.3复筛结果6
2.2菌株形态的观察7
2.3菌株的分子生物学鉴定7
2.4酶促反应最适温度7
2.5产酶曲线8
3结论8
参考文献9
产低温纤维素酶微生物的筛选与鉴定
辛悦
（甘肃农业大学食品与工程学院生物工程专业，甘肃兰州，730070）
摘要：
纤维素酶主要应用于生物质能源发酵的前处理过程,低温纤维素酶在工业生产中也越来越被关注。
本试验从天祝地区高寒草地的土样若干中筛选出一株可降解纤维素的菌株，通过菌落形态观察和分子生物学技术对该菌株进行鉴定，并将其命名为XMS-4。
研究表明：
菌株XMS-4为革兰氏阳性,无芽孢,直杆菌,无鞭毛，经鉴定为鞘氨醇杆菌（Sphingobacteriumfaeciumstrain）,能在低温下分解纤维素,具有较大的潜在工业应用价值。
关键词：
低温;纤维素酶；筛选；鉴定；
Screening and identification of cold-adapted
cellulase-producingmicroorganism
XinYue
（MajorinBiologicalEngineeringintheCollegeofFoodScienceandEngineeringofGansuAgricultureUniversity，GansuLanzhou，730070）
Abstract:
Cellulase is mainly applied in pro-treatment process of biomass fermentation,which hasattractedmoreattention in industrial production.In this test,adegradationcellulasewasscreenedfromseveralstrainssoilsamplesofbacteriainalpinemeadow,Throughthecolonymorphologyobservationandmolecularbiologytechnologytoidentifythestrain,andnameditXMS-4.TestshowthatstrainXMS-4forgram-positive,buds,straightbacillus,noflagella.PreliminaryidentificationofSphingobacteriumfaecium strain （Sphingobacterium faecium strain）, can decompose cellulose under cold-adapted, the industry has great potential application value.
Keywords:
cold-adapted;cellulase;screening;identifying;
前言
纤维素是植物纤维的主要成分，也是自然界中丰富的可再生资源[1]。
纤维素是多个葡萄糖残基以β-1，4糖苷键连接而成的多聚化合物，其基本重复单位为纤维二糖，是自然界最丰富的生物聚合物[2]。
据报道，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达1.55×109吨，其中89%尚未被人们利用[3]。
纤维素利用最大难题是由于纤维素本身的结构特点而不容易被降解，许多研究表明利用微生物产生的纤维素酶来分解和转化纤维素是纤维素利用的一条有效途径。
纤维素酶是指能降解纤维素分子生成纤维二糖和葡萄糖等小分子物质的一组酶的总称。
目前广泛应用于纺织、食品、可再生资源利用等领域的纤维素酶几乎都是中温纤维素酶（最适作用温度45°C−65°C）[4]。
低温纤维素酶主要指最适作用温度为15°C−35°C的酶,与中温纤维素酶相比,低温纤维素酶在自然条件下具有高酶活力及高催化效率,可大大缩短处理过程的时间,节省加热或冷却费用,并且经过温和的热处理即可使其失活,不会影响产品品质。
因此,其应用对于减少工艺流程、降低生产成本以及节能方面有相当大的优势[5−7]。
目前有关高效低温纤维素酶的研究报道较少。
天祝地区海拔高、空气干燥且稀薄、昼夜温差大、辐射强度大。
特殊的地理、气候环境孕育了历史悠久的牧区文化，同时蕴藏着极为丰富、独特的微生物种质资源。
近年来人们对于该地区的乳酸菌、产乳糖酶微生物和产脂肪酶微生物等进行了研究，但对该地区产低温纤维素酶微生物的报道较少。
本研究拟从甘肃天祝高寒草甸采集土壤样品，从中分离筛选低温纤维素酶微生物并对其进行鉴定，以期为开发低温纤维素酶奠定基础。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1样品
本实验土样取自天祝高寒区，采集土样地点为多年堆积枯枝落叶处，地面有很厚的腐殖质层，其中枯枝落叶大部分已被分解为碎末，取样时取距土壤界面2cm处的土壤，样品取回来后保存于4℃冰箱。
1.1.2培养基
筛选培养基：
羧甲基纤维素钠盐（CMC-Na）0.5%，蛋白胨0.5%，酵母浸粉0.1%，琼脂2%，pH7.0-7.2。
种子培养液：
PDA培养基---200g土豆，20g葡萄糖，定容至1000mL。
发酵产酶培养基：
酵母膏1.00%，蛋白胨1.00%，NaCl0.50%，CMC-Na0.50%，pH7.0-7.2。
1.1.3主要试剂
0.1mol/LpH6柠檬酸缓冲液，标准葡萄糖溶液,DNS试剂,CMC-Na溶液.1%刚果红，1%NaCl溶液，结晶紫等。
1.1.4主要仪器
AL204电子天平；TGL-20台式高速冷冻离心机；双人单面超净工作台；生化培养箱；立式电热压力蒸汽灭菌锅；HWS26型电热恒温水浴锅；恒温摇床；754PC型可见分光光度计；GZX-GF101-
电热恒温鼓风干燥箱。
1.2实验方法
1.2.1纤维素酶产生菌的初筛
1.2.1.1土壤稀释液的制备分别称取采集的样品10.0g，加到含有玻璃珠的90mL无菌水的三角瓶（250mL）中，25℃，180r/min摇床中培养30min。
取其上清液1mL加入到9mL无菌水中,稀释成合适的10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的浓度梯度,然后通过涂布法接种于纤维素平板分离培养基之上,培养于25℃恒温培养3d[8]。
1.2.1.2菌种的初筛将培养出来的菌株,分别接种到另外一个培养基上,保持对应关系,进行培养。
将一定量1mg/ml浓度的刚果红溶液倒入培养好的对应平板中盖住平板上层,染色1h,之后倒出刚果红溶液,再用1mol/LNaCl比溶液浸泡洗脱,倒出NaCl溶液,若菌株产纤维素酶,则会在菌落周围出现清晰的透明圈,依据透明圈直径的大小选择产酶菌株[9]。
用游标卡尺测量菌菌落周围水解透明圈的直径（d1）和菌落直径（d2）,并以两者的比值（HC值）大小作为初步判断分解能力的指标,将比值较大的菌落挑取到选择培养基上培养,作进一步产酶水平的测定和纤维素酶高产菌株的筛选[10]。
1.2.2纤维素酶产生菌的复筛
1.2.2.1粗酶液的制备在250mL三角瓶中装100mL种子培养基，分别将X株菌株接种，25℃旋转摇床振荡培养24h作种子液。
无菌条件下用1000µL移液枪量取5mL转接于250mL三角瓶中100mL液体发酵产酶培养基中，在25℃摇床培养72h，在4℃，8000r/min离心10min，取上清液作为粗酶液[11]。
1.2.2.2羧甲基纤维素酶（CMCase）活力的测定
（1）原理Teather等认为，对数酶浓度同刚果红染色水解圈存在线形关系，产酶越多，透明圈越大；产酶越快，透明圈出现越早。
然而，虽然透明圈大小直接反映了酶浓度的高低，但不能完全代表菌株产酶能力。
试验表明，液体样品的酶浓度与透明圈的直径成线性关系，可以对酶活进行初步定量，但不能作为菌株产酶活力大小的唯一定量指标。
因为刚果红纤维素平板筛选法受菌苔大小、菌苔在平板上的堆积情况、菌落之间相互位置和产物或分泌物的相互抑制、不同菌株生长和产酶速度、不同细菌细胞壁的特性等因素的影响，并不能精确反应纤维素酶活力的大小[12]。
因此本试验最初以水解圈的大小来判定纤维素降解能力，进而筛选出纤维素降解能力较强的菌株。
然后采用DNS法来测定纤维素酶活力的大小。
（2）测定方法以1mL1.0%CMC溶液为底物，加1mL上清液，摇匀于25℃反应40min，取出后迅速加入1.5mLDNS试剂，沸水浴煮5min，以终止反应，然后放入凉水冷却至室温，加入1.5mL的柠檬酸缓冲溶液，在540nm测光密度值（O.D.）；以相应空白样（1mL1.0%CMC溶液为底物，1mL灭菌的发酵培养液,于25℃反应40min，然后加人1.5mLDNS试剂，沸水浴煮5min，然后一起放入凉水冷却至室温，再加入1.5mL的柠檬酸缓冲液）调零[13-14]。
1.2.2.3酶活力单位的定义以每1mL酶液每分钟水解1%CMC-Na溶液产生1μg还原糖的酶量定义为一个CMC酶活力单位[15]。
酶活力计算公式如下
X=M×n×1000/V×t
式中，X为CMC酶活力（U/mL）;M为吸光度在标准曲线上查得的葡萄糖量（mg）;n为酶液的稀释倍数;V为:
酶液体积（mL）;t:
时间（min）;1000为1mg到1μg的换算值。
1.2.2.4葡萄糖标准曲线的绘制3，5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的强度成比例关系，利用分光光度计测出其在540nm处的吸光度，得出还原糖的量。
采用标准葡萄糖配置一系列不同浓度的葡萄糖溶液，如表1，利用DNS法分别对它们在540nm处测吸光度值。
以葡萄糖含量为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线[16]。
表1.葡萄糖标准曲线的制作配方表
试管号
1
2
3
4
5
6
标准葡萄糖溶液（mL）
0
1
2
3
4
5
缓冲溶液（mL）
5
4
3
2
1
0
DNS显色剂（mL）
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.2.3形态学观察
将分离筛选得到的纤维素分解菌进行涂片和革兰氏染色，然后置于光学显微镜下进行观察，对其进行初步的形态学鉴定。
1.2.4菌株的分子生物学鉴定
对XSM-4菌测定16SrRNA序列,采用通用引物。
PCR反应采用50μL体系。
反应条件：
94℃,20min；94℃,45s;55℃,45s;72℃，1.5min30个循环；72℃，7min。
取5µlL进行1%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收,目的片断进行测序。
将测定的序列提交GenBank数据库并进行BLAST比较分析,并用MEGA5.05软件进行同源性分析,建立系统发育树。
1.2.5酶的最适温度
取25℃摇床培养72ｈ的发酵液，离心后得到粗酶液，分别在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃及45℃的条件下进行酶促反应，40min后用DNS法测定酶活，确定酶促反应最适温度。
1.2.6产酶曲线的测定
将筛选得到的菌株以5%的接种量接入到装有100mL发酵产酶培养基的250mL三角瓶中，25℃条件下180r/min培养，间隔3h取样，测定其OD600值。
同时取发酵液在4℃,8000r/min离心10min，取上清液，通过DNS法测定其OD540值。
以未接种的种子培养基为空白对照，培养时间t为横坐标，培养液OD600,OD540为纵坐标，分别得到菌株的生长曲线和产酶曲线。
2结果与分析
2.1纤维素酶产生菌的筛选
2.1.1葡萄糖标准曲线
DNS法测定葡萄糖标准曲线，见图1。
图1DNS法测定葡萄糖标准曲线
2.1.2初筛结果
通过刚果红检测初步筛选出产纤维素酶菌株20株，水解圈最大的菌株的水解圈/菌落直径约为4.5，如表2；初筛中刚果红检测水解圈，见图2。
表2初筛菌株结果
序号
d1/mm
d2/mm
HC值
序号
d1/mm
d2/mm
HC值
XMS-1
2
3
1.5
XMS-11
1
2.5
2.5
XMS-2
2
6
3.0
XMS-12
1.5
3.5
2.3
XMS-3
3
4
1.3
XMS-13
1
2.5
2.5
XMS-4
1
4.5
4.5
XMS-14
1
2
2,0
XMS-5
1
2.5
2.5
XMS-15
1
3
3.0
XMS-6
1
3
3.0
XMS-16
1
4
4.0
XMS-7
3
6
2.0
XMS-17
4
5
1.3
XMS-8
4
6
1.5
XMS-18
1
2.6
2.6
XMS-9
2
8
4.0
XMS-19
1.2
4
3.3
XMS-10
1
4
4.0
XMS-20
2
4
2.0
图2刚果红检测水解圈
2.1.3复筛结果
DNS法测定酶活力，筛选出产低温纤维素酶产生菌10株，依次为编号XMS-2、XMS-4、XMS-6、XMS-9、XMS-10、XMS-11、XMS-15、XMS-16、XMS-18、XMS-19；10株纤维素酶产生菌纤维素酶活力测定结果见表3：
表3筛选菌株的纤维素酶活力
菌株编号
纤维素酶活力（U/mL）
菌株编号
纤维素酶活力
（U/mL）
XMS-2
57.82
XMS-11
56.56
XMS-4
66.82
XMS-15
53.21
XMS-6
53.79
XMS-16
54.58
XMS-9
56.56
XMS-18
52.38
XMS-10
52.53
XMS-19
57.67
结果表明菌株XMS-4，在25℃，180r/min，摇床振荡培养3d，DNS法测定粗酶液的酶活力最高，为66.82U/mL。
2.2菌株形态的观察
25℃条件下，在羧甲基纤维素钠平板培养菌株XMS-4，其菌落为圆形，淡黄色，边缘不整齐，如图3。
在光学显微镜下观察XMS-4为革兰氏阳性,无芽孢,直杆菌,无鞭毛如图4。
图3菌落形态图4光学显微镜形态
2.3菌株的分子生物学鉴定
以XMS-4菌株基因组DNA为模板扩增该菌的ITS序列,将该序列提交GenBank数据库进行BLAST比对分析,利用MEGA5.05软件构建系统进化树,结果如图5所示。
XMS-4与屎鞘氨醇杆菌（Sphingobacteriumfaeciumstrain）相似性达99%,结合该菌的形态特征确定该菌为一株鞘氨醇杆菌（Sphingobacteriumfaeciumstrain）。
图5XMS-4菌株的系统进化树
2.4酶促反应最适温度
图6温度对纤维素酶活力的影响
不同温度下酶活测定结果（图6）表明，菌株XMS-4所产纤维素酶在10~25℃时酶活随温度升高增加，25℃达到最高，然后呈下降趋势。
此纤维素酶最适反应温度为25℃，属于低温酶。
2.5产酶曲线
图7发酵产酶进程
由图7可知：
菌株XMS-4在发酵的初级阶段,菌株生长迅速,但几乎不产生纤维素酶。
培养12h后,菌体生长速度变慢,产酶量逐步提高,菌体在培养的27h达到稳定期,48h后产酶最大。
3结论
通过对天祝地区高寒草地的土样进行筛选得到一株可降解纤维素的菌株，将其命名为XMS–4。
菌株XMS-4为革兰氏阳性,无芽孢,直杆菌,无鞭毛，其菌落为圆形,淡黄色,边缘不整齐,经鉴定为鞘氨醇杆菌（Sphingobacteriumfaeciumstrain）。
该菌株能在低温下分解纤维素,最适反应温度25℃,在发酵45-57h时纤维素酶活最高，具有较大的潜在应用价值。
参考文献
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