哮喘患儿的外周血淋巴细胞CD40CD40L的表达及其与Tc1和精.docx

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哮喘患儿的外周血淋巴细胞CD40CD40L的表达及其与Tc1和精

哮喘患儿的外周血淋巴细胞CD40/CD40L的表达及其与Tc1和Tc2的关系

　　作者：

黄花荣，刘甜甜，魏菁，吴葆菁，檀卫平，麦贤弟作者单位：

（中山大学附属第二医院1.儿科，2.医学研究中心，广东广州510120）

　　【摘要】【目的】研究发作期哮喘患儿的外周血CD40、CD40L的表达率及其与Tc1和Tc2的关系。

【方法】应用流式细胞术检测30例哮喘患儿和20例正常对照儿童的外周血淋巴细胞CD40、CD40L的表达率和Tc1、Tc2的细胞数。

【结果】哮喘患儿和正常对照组的外周血淋巴细胞CD40表达率分别为21.59±7.61和15.82±4.44（t=3.376，P<0.001）;CD40L表达率分别为0.20±0.11和0.33±0.12（t=-2.747，P<0.05）;Tc1细胞数分别为9.06±3.80和7.28±3.01（t=0.582，P>0.05）;Tc2细胞数分别为7.64±3.67和3.02±1.38（t=3.981，P<0.001）。

CD40和CD40L表达率与Tc1、Tc2数量无显著的相关性（r分别为-0.004和0.231、-0.280和0.186，P>0.05）。

【结论】发作期哮喘患儿存在明显的CD40/CD40L、Tc1/Tc2的异常，这可能与哮喘的发生有重要的关联。

　　【关键词】哮喘;白细胞分化抗原40/40配体;细胞毒性T细胞;淋巴细胞;儿童

　　ExpressionofCD40/CD40LofLymphocytesandTheirCorrelationwithTc1andTc2

　　CellsinPeripheralBloodinAsthmaticChildren

　　HUANGHua-rong,LIUTian-tian,WEIJing,WUBao-jing,TANWei-ping,MAIXian-di

　　（DepartmentofPediatrics,TheSecondAffiliatedHospital,SUNYat-senUniversity,Guangzhou510120,China）

　　Abstract：

【Objective】ToinvestigatetheexpressionofCD40/CD40LandtheircorrelationwithTc1/Tc2cellsofperipheralbloodinchildrenwithattackasthma.【Methods】TheflowcytometrywasusedtodetecttheexpressionofCD40/CD40LandchangeofTc1andTc2cellsofperipheralbloodin30childrenwithattackasthmaand20normalchildren.【Results】TheexpressionlevelsofCD40were21.59±7.61and15.82±4.44（t=3.376,P<0.001）,CD40Lwere0.20±0.11and0.33±0.12（t=-2.747,P<0.05）inasthmaticchildrenandthecontrol,respectively.ThepercentagesofTc1cellswere9.06±3.80and7.28±3.01（t=0.582,P>0.05）,Tc2cellswere7.64±3.67and3.02±1.38（t=0.582,P<0.001）inasthmaticchildrenandthecontrol,respectively.TherewerenosignificantcorrelationbetweentheexpressionsofCD40orCD40LandthepercentageofTc1orTc2cells?

酌.were-0.004,0.231,and-0.280,0.186,respectively;P>0.05）.【Conclusions】ExpressionofCD40/CD40LandchangesofTc1/Tc2cellsaresignificantabnormalofperipheralbloodinchildrenwithattackasthma,whichcancontributetotheimmunepathogenesisofasthma.

　　Keywords：

asthma;CD40/CD40L;cytotoxicTcell;lymphocyte;child

　　[JSUNYat-senUniv（MedSci）,2007,28

（1）:

79-82]

　　小儿哮喘是儿科呼吸道疾病中常见病之一，发病机制仍未能完全明了，其中最主要是免疫异常、气道反应性增强等。

在众多实验中发现，发作期哮喘患儿的T、B淋巴细胞功能均有不同程度的异常，而以T细胞功能异常更为关注[1-3]。

在免疫反应的起始阶段，T细胞激活需要两个信号：

主要组织相容性复合物（majorhistocompatibilitycomplex,MHC）-抗原肽信号和共刺激信号，如缺乏共刺激分子提供的共刺激信号，T细胞便不能活化，而处于无能状态。

CD（clusterofdifferentiation）40/CD40L是重要的协同刺激分子，它们在哮喘中的作用如何，以及它们在哮喘免疫发病中与细胞毒性T细胞（cytotoxicTcell,Tc）的关系如何鲜见报道。

我们应用流式细胞术检测哮喘患儿的外周血淋巴细胞的CD40、CD40L表达和Tc1、Tc2细胞数的变化，并探讨它们的关系，以进一步探讨哮喘的发病机制。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　2004年3月~2006年3月，初次发作期哮喘患儿30例随机进入研究组，均为我科住院或哮喘专科门诊的病人，均符合我国的儿童哮喘的诊断标准[4]，其中男性21例，女性9例，年龄为3月~13（4.68±3.40）岁;正常对照组为同期的健康体检者20例，无哮喘及过敏性家族史，其中男性13例，女性7例，年龄为1.3~12（4.95±3.20）岁。

两组患儿的年龄分布（t=0.224，P=0.824）及性别构成（?

字2=0.138，P=0.710）均无统计学差异。

　　1.2方法

　　1.2.1主要试剂及仪器鼠抗人CD40-FITC、CD154（CD40L）-FITC、CD3-TC、CD8-FITC、IFN?

酌-PE、IL4-PE、同型阴性对照鼠抗人IgG1-PE和大鼠抗人IgG1-PE均购自BDPharmingen公司。

流式细胞仪FACSCalibur，BD公司产品。

　　1.2.2CD40、CD40L的检测采集空腹肝素静脉抗凝血2mL,密度梯度离心法分离单个核细胞,PBS洗涤,将浓度为1×106/mL单个核细胞以100?

滋L加入试验管和阴性对照管中,试验管加入荧光标记的单克隆抗体CD3-TC+CD40-FITC、CD3-TC+CD40L-FITC，阴性对照管中加入IgG1-PE，用流式细胞仪进行淋巴细胞上CD40/CD40L表达率检测。

　　1.2.3Tc1、Tc2的检测取100?

滋L肝素抗凝血与100?

滋LRPMI1640混匀后，加入5.0?

滋LPMA（1?

滋L/mL）、4?

滋LIonomycin（50?

滋L/mL）、3.4?

滋lMonensin（0.1mg/mL），37℃、体积分数5%CO2培养4~6h。

吸出100?

滋L培养的全血，用做破膜染色QC用。

加入20?

滋LCD3-TC和20?

滋LCD8-FITC，室温避光15min后，分成4管（编号A1、A2、A3、A4），每管加入50?

滋L已染色的全血;每管加入100?

滋LFixPerm中的RegentA液（固定液），室温避光15min，加入3mLPBS，1200r/min离心5min，弃去上清;每管中加入100?

滋LFixPerm中的RegentB液（破膜液和溶血液），同时各管中A1加照鼠抗人IgG1-PE，A2加IFN?

酌-PE，A3加大鼠抗人IgG1-PE，A4加IL4-PE各5?

滋L;室温避光15min，加入3mLPBS，1200r/min离心5min，弃去上清;0.5mLPBS重悬细胞，上机检测。

　　1.3统计学处理

　　定量资料应用均数±标准差（x±s）表示，两组均数比较采用独立t检验。

采用Pearson相关系数r进行相关分析。

定性资料应用率或比表示，采用?

字2检验。

所有数据处理均在计算机SPSS10.0软件包进行。

　　2结果

　　2.1哮喘患儿外周血CD40、CD40L的表达

　　哮喘患儿的外周血淋巴细胞CD40表达率明显高于正常对照组（t=3.376，P<0.001）;而CD40L表达率明显低于正常对照组（t=-2.747，P<0.05;表1;图1-3）。

　　2.2哮喘患儿的外周血Tc1、Tc2细胞数的变化

　　哮喘患儿的外周血Tc1细胞数高于对照组，但无显著性差异（t=0.582，P>0.05）;而Tc2细胞数明显高于对照组（t=3.981，P<0.001），差异有统计学意义（表1;图4~8）。

　　2.3哮喘患儿外周血CD40、CD40L的表达与Tc1、Tc2细胞数的关系

　　CD40、CD40L的表达率与Tc1、Tc2的细胞数无明显相关性（表2）。

　　3讨论

　　初始T细胞的完全活化，需要两种活化信号分子的协同作用，第1信号由T细胞抗原受体（Tcellantigenreceptor,TCR）识别抗原产生，经CD分子将信号转导至细胞内，第2信号（或称协同刺激信号）则由抗原提呈细胞（antigenpresentingcell,APC）或靶细胞的协同刺激分子与T细胞表面的相应的协同刺激分子受体相互作用而产生。

在协同刺激信号的作用下，已活化的抗原特异性T细胞增殖、分化为效应T细胞。

目前已知的协同刺激分子有B7/CD28和CD40/CD40L等[5]。

已有研究表明：

B7/CD28在哮喘中起重要作用[6]，但有关CD40/CD40L在哮喘患儿免疫发病机制中的作用研究较少，且结果不统一。

　　CD40分布广泛，主要表达在B细胞、单核细胞、树突状细胞、成纤维细胞等。

CD40L主要由活化的T细胞表达，其中在CD4T细胞的表达明显高于CD8T细胞，而B细胞、NK细胞和单核细胞表面也有少量表达。

表达于T细胞表面的CD40L通过CD40对B细胞介导的免疫反应发挥重要的调节作用。

如果缺乏刺激信号，则T细胞不能完全活化，而处于无能状态[5,7]。

　　本组资料表明：

在哮喘发作期患儿外周血淋巴细胞的CD40表达明显升高，这与国外多项研究的结果一致[8,10]。

但CD40L则降低，这提示在哮喘发作期，哮喘患儿T细胞的活化功能或数量是降低的，B细胞活化还存在着其它激发途径，如T、B细胞间其它信号分子和细胞因子的刺激[11]。

这些结果提示哮喘患儿存在CD40/CD40L刺激信号传导途径的异常，有可能参与了哮喘的免疫发病。

　　目前已公认，哮喘的发病与Th（helpTcell）2细胞因子分泌过多有关。

具有细胞毒作用的T细胞（Tc）同样分为Tc1和Tc2两个亚群，分泌细胞因子类型与Th1细胞类似的Tc细胞称为Tc1细胞，分泌细胞因子类型与Th2细胞类似的Tc细胞称为Tc2细胞。

Tc1及Tc2的细胞数在哮喘发作期有何改变，以往研究甚少。

　　本组资料还显示：

Tc2明显升高，Tc1虽亦升高，但与对照组比较无显著性意义。

这提示哮喘患儿Tc2细胞在哮喘免疫发病中也起关键的作用。

另外，我们在既往研究中发现，哮喘患儿外周血IFN-γ水平较正常明显降低，发作期更为明显[1,12]，而本次实验结果显示分泌IFN-γ的Tc1细胞在哮喘发作期较正常对照增多，由此我们推测，哮喘患儿发作期可能存在IFN-γ分泌的障碍，从而导致外周血IFN-γ水平的降低。

　　最近的研究发现，细胞毒性T细胞（Tc）的激发可通过激发树突状细胞（DC）的CD40分子而绕过Th细胞的辅助作用，这对激发体内Tc提供了新的手段[13]。

我们分析CD40/CD40L的表达与Tc1、Tc2细胞数的关系，结果提示：

哮喘患儿发作期CD40、CD40L表达与Tc1、Tc2细胞数均无明显相关性。

这些结果提示CD40、CD40L表达可能与T细胞的活化功能有密切的关联，而与T细胞的数量的多少无明显的关联，从而可能从侧面帮助说明在哮喘发病机制中Th细胞起着关键性的作用。

最近有研究认为，CD40和CD40与CD40L的相互作用，参与了黏膜的防御和保护作用[10,14]。

　　因此，在哮喘患儿中，可能存在极其复杂的免疫与免疫调节异常，需要更广泛、更深入的免疫学的研究。

本组资料提示：

CD40/CD40L的表达和Tc1/Tc2细胞数的异常，可能与哮喘的发生有重要的关联。

　　【参考文献】

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