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17第十六章RNA的生物合成

第十六章RNA的生物合成

1961年S.B.Weiss和J.Hurwitz等各自在大肠杆菌裂解液中发现了DNA依赖的RNA聚合酶（DNA-dependentRNApolymerase,RNApol）。

在此之前S.Ochoa已经提出了RNA的转录机制，并因此获得1959年度诺贝尔生理／医学奖。

生物体以DNA为模板合成RNA的过程称为转录（transcription），意指将DNA的碱基序列转抄为RNA。

DNA分子上的遗传信息是决定蛋白质氨基酸序列的原始模板，mRNA是蛋白质合成的直接模板。

通过RNA的生物合成，遗传信息从染色体的贮存状态转送至胞质，从功能上衔接DNA和蛋白质这两种生物大分子。

1958年，F.Crick将上述遗传信息的传递方式归纳为中心法则（centraldogma）。

1970年H.Temin发现了逆转录现象，对中心法则进行了补充。

在生物界，RNA合成有两种方式。

一是DNA指导的RNA合成，也称转录，为生物体内的主要合成方式。

转录产物除mRNA,rRNA和tRNA外，在真核细胞内还有snRNA,miRNA等非编码RNA。

对RNA转录过程的调节可以导致蛋白质合成速率的改变，并由此而引发一系列细胞功能变化。

因此，理解转录机制对于认识许多生物学现象和医学问题具有重要意义。

mRNA转录过程及其加工和剪切错误可引起疾病。

RNA的转录合成是本章的主要内容。

另一种是RNA依赖的RNA合成（RNA-dependentRNAsynthesis），也称RNA复制（RNArep-lication），由RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase）催化，常见于病毒，是逆转录病毒以外的RNA病毒在宿主细胞以病毒的单链RNA为模板合成RNA的方式，限于篇幅本章未予叙述。

转录和复制都是酶促的核昔酸聚合过程，有许多相似之处。

它们都以DNA为模板；都需依赖DNA的聚合酶；聚合过程都是核昔酸之间生成磷酸二醋键；都从5’向3’方向延长聚核昔酸链；都遵从碱基配对规律。

但相似之中又有区别（表16-1）。

第一节原核生物转录的模板和酶

RNA的生物合成属于酶促反应，反应体系中需要DNA模板,NTP,RNApol,其他蛋白因子及Mg2+和Mn2+等。

合成方向5'→3'，核昔酸间的连接方式为3'，5'一磷酸二酯键。

312

第十六章RNA的生物合成313

一、原核生物转录的模板

在DNA分子双链上，按碱基配对规律能指导转录生成RNA的一股链作为模板指导转录，另一股链则不转录，这种模板选择性称为不对称转录（asymmetrictranscription）。

用RNA对DNA的核酸杂交法（见第二十章）或做DNA、RNA碱基序列测定比较，都可证明DNA分子上的一个基因只有一股链可转录生成其编码产物（图16-1a）。

作为一个基因载体的一段DNA双链片段，转录时作为RNA合成模板的一股单链称为模板链（templatestrand），相对应的另一股单链被称为编码链（codingstrand）。

转录产物若是mRNA，则可用作翻译的模板，决定蛋白质的氨基酸序列（图16-lb）。

模板链既与编码链互补，又与mRNA互补，可见mRNA的碱基序列除用U代替T外，与编码链是一致的。

文献刊出的各个基因的碱基序列，为避免烦琐和便于查对遗传密码，一般只写出编码链。

二、RNA聚合酶催化RNA合成

（一）RNA聚合酶能从头启动RNA链的合成

DNA依赖的RNApol催化RNA的转录合成。

该反应以DNA为模板，以ATP、GTP、UTP和CTP为原料，还需要Mg2+和Zn2+作为辅基。

RNA合成的化学机制与DNA的复制合成相似。

RNApol通过在RNA的3'-OH端加入核苷酸，延长RNA链而合成RNA.。

3'-OH在反应中是亲核基团，攻击进入的核苷三磷酸的α-磷酸，并释放出焦磷酸，总的反应可以表示为：

（NMP）n+NTP→（NMP）n＋1+PPi。

RNA聚合酶和双链DNA结合时活性最高，但是只以双链DNA中的一股DNA链为模板。

新加入的核苷酸以Watson-Crick碱基配对原则和模板的碱基互补。

前述的DNA聚合酶在启动DNA链延长时需要RNA引物存在，而RNA聚合酶能够直接启动转录起点处的两个核苷酸间形成磷酸二酯键（图16-2），因而RNA链的起始合成不需要引物。

（二）RNA聚合酶由多个亚基组成

大肠杆菌（E.coli）的RNA聚合酶是目前研究得比较透彻的分子。

这是一个分子量达480kDa,由4种亚基α2（2个α）、β、β’和σ组成的五聚体蛋白质。

有证据表明，大肠杆菌RNA聚合酶还有第五种亚基（w亚基）存在，其功能不详，本章不予赘述。

其他各主要亚基及功能见表16-2。

314第三篇遗传信息的传递

大肠杆菌RNApol的4个主要亚基（α2ββ’）称为核心酶（coreenzyme）。

体外或称试管内转录（invitrotranscription）实验（含有模板、酶和NTP）证明，核心酶能独立催化模板指导的RNA合成，但合成RNA时没有固定的起始位点。

加入了σ亚基的酶才能在DNA的特定起始点上起始转录，可见σ亚基的功能是辨认转录起始点。

σ亚基与核心酶共同称为全酶。

细胞内的转录起始需要全酶。

转录延长阶段则仅需核心酶。

图16-3示RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合。

大肠杆菌内有一些不同的RNApol全酶，其差异是σ亚基的不同。

目前已发现多种σ亚基，并用其分子量命名区别，最常见的是σ70（分子量70kDa）。

σ70是辨认典型转录起始点的蛋白质，大肠杆菌中的绝大多数启动子可被含有σ70因子的全酶所识别并激活

第十六章RNA的生物合成315

将细菌从通常培养的37℃升温至42℃，细菌可迅速增加一套共17种蛋白质的合成。

这些蛋白质被称为热激蛋白（heatshockproteins,HSP）。

当温度升至50℃，大部分蛋白质合成已停止，HSP却能继续合成。

HSP的编码基因称为热激基因（hsp）。

hsp基因的转录起点的上游序列与其他基因不同，因而需另一种σ因子，即σ32（分子量32kDa）辨认及启动其转录。

可见，σ32是应答热刺激而被诱导产生的，它本身也属于一种Hsp。

框16-1RNA聚合酶的发现

早在1955年，M.Grunberg-Manago和S.Ochoa就已报道分离出了催化合成RNA的酶，尽管人们随后发现他们分离得到的酶是多聚核苷磷酸化酶，但是他们发现的酶在M.Nirenberg和J.H.Matthaei合成第一个遗传密码子中发挥了重要作用。

S.Ochoa因阐明RNA生物合成机制而获得了1959年诺贝尔生理学／医学奖。

1959年，美国科学家J.Hur-witz在大肠杆菌的抽提液中分离得到了真正的RNA聚合酶。

与此同时，S.B.Weiss在大鼠肝细胞核提取物中也发现了参与RNA合成的物质。

他们发现，提纯的RNA聚合酶在体外能够以DNA为模板，在加入ATP、GTP、CTP、UTP及Mg2+等后合成RNA，合成的RNA与DNA模板链完全互补。

其他原核生物的RNApol在结构和功能上均与大肠杆菌相似。

抗生素—利福平（rifampi-cin）或利福霉素可以特异抑制原核生物的RNApol，成为抗结核菌治疗的药物。

它专一性地结合RNA聚合酶的β亚基。

若在转录开始后才加入利福平，仍能发挥其抑制转录的作用，这说明β亚基是在转录全过程都起作用的。

三、RNA聚合酶结合到DNA的启动子上启动转录

对于整个基因组来讲，转录是分区段进行的。

每一转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子（operon）（第十八章）。

操纵子中包括了若干个基因的编码区及其调控序列。

调控序列中的启动子（promoter）是RNApol结合模板DNA的部位，也是控制转录的关键部位。

原核生物是以RNApol全酶结合到启动子上而启动转录的，其中由σ亚基辨认启动子，其他亚基相互配合。

启动子结构的阐明回答了转录从哪里起始这一问题，是转录机制研究的重要发现。

研究中采用了一种巧妙的方法，即RNA聚合酶保护法。

在实验中，先将提取的DNA与提纯的RNA聚合酶混合温育一定时间，再加入核酸外切酶进行反应。

结果显示，大部分DNA链被核酸酶水解为核苷酸，但一40~6bp的DNA片段被保留下来。

这段DNA没有被水解，是因为RNA聚合酶结合在上面，因而受到保护。

受保护的DNA位于转录起始点的上游，并最终被确认为是被RNA聚合酶辨认和紧密结合的区域，是转录起始调节区（图16-4）。

对数百个原核生物基因操纵子转录上游区段进行的碱基序列分析，证明RNA聚合酶保护区存在共有序列。

以开始转录的5’-端第一位核苷酸位置转录起点（transcriptionstartsite，TSS;或initiator）为+1，用负数表示其上游的碱基序号，发现-35和-10区A-T配对比较集中。

-35区的最大一致性序列是TTGACA。

-10区的一致性序列TATAAT，是1975年由D.Pribnow首先发现的，故称为Pribnow盒（Pribnowbox）。

-35与-10区相隔16~18个核苷酸，-10区与转录起点相距6或7个核苷酸。

A-T配对相对集中，表明该区段的DNA容易解链，因为A-T配对只有两个氢键维系。

比较RNApol结合不同区段测得的平衡常数，发现RNApol结合在-10区比结合在-35区更为牢固。

从RNApol分子大小与DNA链长的比较，可确定其结合DNA链时分子的跨度。

这些结果都能推论出：

-35区是RNApol对转录起始的识别序列（recognitionsequence）。

结合识别序列后，酶

316第三篇遗传信息的传递

向下游移动，达到Pribnow盒，酶形成相对稳定的酶一DNA复合物，就可以开始转录。

第二节原核生物的转录过程

原核生物的转录过程可分为转录起始、转录延长和转录终止三个阶段。

一、转录起始需要RNA聚合酶全酶

转录全过程均需RNApol催化，起始过程需核心酶，由σ亚基辨认起始点，延长过程的核苷酸聚合仅需核心酶催化。

简言之，转录起始就是RNApol在DNA模板的转录起始区装配形成转录起始复合体，打开DNA双链，并完成第一和第二个核昔酸间聚合反应的过程。

转录起始复合物中包含有RNApol全酶、DNA模板和与转录起点配对的NTPs。

起始阶段的第一步是由RNApol识别并结合启动子，形成闭合转录复合体（closedtranscriptioncomplex），其中的DNA仍保持完整的双链结构。

原核生物需要靠RNApol中的σ亚基辨认转录起始区和转录起点。

首先被辨认的DNA区段是-35区的TTGACA序列，在这一区段，酶与模板的结合松弛；接着酶移向-10区的TATAAT序列并跨过了转录起点，形成与模板的稳定结合。

起始的第二步是DNA双链打开，闭合转录复合体成为开放转录复合体（opentranscriptioncomplex）。

开放转录复合体中DNA分子接近-10区域的部分双螺旋解开后转录开始。

无论是转录起始或延长中，DNA双链解开的范围都只在17bp左右，这比复制中形成的复制叉小得多。

起始的第三步是第一个磷酸二酯键的形成。

转录起始不需引物，两个与模板配对的相邻核苷酸，在RNApol催化下生成磷酸二酯键。

转录起点配对生成的RNA的第一位核苷酸，也是新合成的RNA分子的5’-端，总是GTP或ATP，又以GTP更为常见。

当5'-GTP与第二位的NTP聚合生成磷酸二酯键后，仍保留其5’端3个磷酸基团，生成聚合物是5'-pppGpN-OH3’，其3’端的游离羟基，可以接收新的NTP并与之聚合；使RNA链延长下去。

RNA链的5’-端结构在转录延长中一直保留，至转录完成。

二、RNApol核心酶独立延长RNA链

第一个磷酸二酯键生成后，转录复合体的构象发生改变，σ亚基从转录起始复合物上脱落，并离开启动子，RNA合成进人延长阶段。

此时，仅有RNApol的核心酶留在DNA模板上，并沿

第十六章RNA的生物合成317

DNA链不断前移，催化RNA'链的延长。

实验证明，σ亚基若不脱落，RNApol则停留在起始位置，转录不继续进行。

化学计量又证明，每个原核细胞，RNApol各亚基比例为:

α:

β:

β:

σ=4000:

2000：

2000：

600，σ因子的量在胞内明显比核心酶少。

在体外进行的RNA合成实验也证明，RNA的生成量与核心酶的加入量成正比；开始转录后，产物量与σ亚基加人与否无关。

脱落后的σ因子又可再形成另一全酶，反复使用。

RNA链延长时，核心酶会沿着模板DNA不断向下游前移。

聚合反应局部前方的DNA双链不断解链，合成完成后的部分又重新恢复双螺旋结构。

核心酶可以覆盖40bp以上的DNA分子段落，但转录解链范围约17bp。

RNA链延长过程中的解链和再聚合可视为这一17bp左右的开链区在DNA上的动态移动，其外观类似泡状，被称为“转录泡”（transcriptionbubble）。

在开链区局部（图16-5），RNApol的核心酶催化着模板指导的RNA链延长，转录产物3’端会有一小段暂时与模板DNA保持结合状态，形成一8bp的RNA-DNA杂合双链（hybridduplex）。

随着RNA链不断生长，5’端脱离模板向空泡外伸展。

从化学结构看，DNA/DNA双链结构比DNA/RNA形成的杂化双链稳定。

核酸的碱基之间有3种配对方式，其稳定牲是：

G=C>A=T>A=U。

GC配对有3个氢键，是最稳定的；AT配对只在DNA双链形成；AU配对可在RNA分子或DNA/RNA杂化双链上形成，是3种配对中稳定性最低的。

所以已转录完毕的局部DNA双链，就必然会复合而不再打开。

根据这些道理，也就易于理解空泡为什么会形成，而转录产物又是为什么可以向外伸出了。

观察图16-5中的“转录泡”局部，可概括出转录延长以下特点：

①核心酶负责RNA链延长反应；②RNA链从5’-端向3’-端延长，新的核苷酸都是加到3’-OH上；③对DNA模板链的阅读方向是3’-端向5’-端，合成的RNA链与之呈反向互补，即酶是沿着模板链的3’向5’方向或沿着编码链的5’向3’方向前进的；④合成区域存在着动态变化的8bp的RNA-DNA杂合双链；⑤模板DNA的双螺旋结构随着核心酶的移动发生解链和再复合的动态变化。

三、原核生物转录延长与蛋白质的翻译同时进行

进一步分析表明，在同一个DNA模板分子上，有多个转录复合体同时在进行着RNA的合成；在新合成的mRNA链上还可观察到结合在上面的多个核糖体，即多聚核糖体。

结论是，在原核生物，RNA链的转录合成尚未完成，蛋白质的合成已经将其作为模板开始进行翻译了。

转录和翻译的同步进行在原核生物是较为普遍的现象，保证了转录和翻译都以高效率运行，满足它们快速增殖的需

318第三篇遗传信息的传递

要。

真核生物有核膜将转录和翻译过程分隔在细胞内的不同区域，因此没有这种转录和翻译同步现象。

四、原核生物转录终止分为依赖ρ因子与非依赖ρ因子两大类

RNApol在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来，就是转录终止。

依据是否需要蛋白质因子的参与，原核生物的转录终止分为依赖ρ（Rho）因子与非依赖ρ因子两大类。

（一）依物ρ因子的转录终止

用T4噬菌体DNA作体外转录实验，发现其转录产物比在细胞内转录出的产物要长。

这一方面说明转录终止点是可以被跨越而继续转录的；还说明细胞内的某些因子有执行转录终止的功能。

根据这些线索，1969年，J.Roberts在T4噬菌体感染的大肠杆菌中发现了能控制转录终止的蛋白质，命名为ρ因子。

体外转录体系中加人了ρ因子后，转录产物长于细胞内的现象不复存在。

ρ因子是由相同亚基组成的六聚体蛋白质，亚基分子量为46kDa。

ρ因子能结合RNA，又以对polyc的结合力最强，但对polydC/dG组成的DNA的结合能力就低得多。

在依赖ρ因子终止的转录中，产物RNA的3'-端会依照DNA模板，产生较丰富而且有规律的C碱基。

ρ因子正是识别产物RNA上这一终止信号，并与之结合。

结合RNA后的ρ因子和RNApol都可发生构象变化，从而使RNApol的移动停顿9p因子中的解旋酶活性使DNA/RNA杂化双链拆离，RNA产物从转录复合物中释放（图167），转录终止。

（二）非依赖p因子的转录终止

DNA模板上靠近转录终止处有些特殊碱基序列，转录出RNA后，RNA产物可以形成特殊的

第十六章RNA的生物合成319

结构来终止转录。

这一类的转录终止依赖于RNA产物3’-端的特殊结构，不需要蛋白因子的协助，即非依赖ρ因子的转录终止。

可导致终止的转录产物的3’-端常有多个连续的U，其上游的一段特殊碱基序列又可形成鼓褪状的茎环或发夹形式的二级结构，这些结构的形成是非依赖ρ因子终止的信号。

如图16-8所示，RNA链延长至接近终止区时，转录出的碱基序列随即形成茎-环结构。

这种二级结构是阻止转录继续向下游推进的关键。

其机制可从两方面理解：

一是RNA分子形成的茎环结构可能改变RNA聚合酶的构象。

注意RNA聚合酶的分子量大，它不但覆盖转录延长区，也理盖部分3’-端新合成的RNA链，包括RNA的茎环结构。

酶的构象改变导致酶-模板结合方式的改变，使酶不再向下游移动，于是转录停止。

其二，转录复合物（酶-DNA-RNA）上形成的局部RNA/DNA杂化短链的碱基配对是最不稳定的，随着单链DNA复原为双链，转录泡关闭，转录终止。

RNA链上的多聚U也是促使RNA链从模板上脱落的重要因素。

第三节真核生物RNA的生物合成

真核生物的转录过程远比原核复杂。

真核生物和原核生物的RNA聚合酶种类不同，结合模板的特性不一样。

原核生物RNApol可直接结合DNA模板，而真核生物RNA聚合酶需与辅助因子结合后才结合模板，所以两者的转录起始过程有较大区别，转录终止也不相同。

转录调控是基因表达调控的关键点（参见第十八章），也是当今生命科学研究的热点问题。

了解真核生物的转录过程，是研究转录调控的重要基础。

一、真核生物有三种DNA依翰的RNA聚合醉

真核生物具有3种不同的RNA聚合酶，分别是RNA聚合酶I（RNAPolI）,RNA聚合酶1<（RNApolⅡ）和RNA聚合酶Ⅲ（RNApolⅢ）。

真核细胞的3种RNA聚合酶不仅在功能和理化性质上不同，而且对一种毒蘑菇含有的环八肽毒素—α-鹅膏荤碱（α-amanitine）的敏感性也不同（表16-3）。

RNApolI位于细胞核的核仁区（nucleolus），催化合成rRNA前体，rRNA前体再加工成28S，5.8S及18SrRNA。

RNApolⅢ位于核仁外，催化转录tRNA、5S-rRNA和一些核小RNA（snRNA）的合成。

RNApolⅡ在核内转录生成核不均一RNA（hnRNA），然后加工成mRNA并输送给胞质的蛋

320第三篇遗传信息的传递

白质合成体系。

mRNA是各种RNA中寿命最短、最不稳定的，需经常重新合成。

RNApolⅡ还合成一些具有重要的基因表达调节作用的非编码RNA，如长链非编码RNA（1ncRNA）、微RNA（miRNA）和piRNA（与Piwi蛋白相作用的RNA）的合成。

在此意义上可以说，RNApolII是真核生物中最活跃、最重要的酶，故本章叙述的真核生物的转录主要以RNApolⅡ所催化的转录反应为例的。

框16-2真核生物转录过程的阐明

在发现了原核生物中的RNA聚合酶后，科学家们逐渐推导出了真核生物的转录过程，但一直不清楚转录的具体细节。

直到2001年美国科学家R.D.Kornberg在《科学》杂志上发表了第一张RNA聚合酶的全动态晶体图片，才解决了这一难题。

Kornberg小组利用X射线和计算机技术测算并描绘出RNA聚合酶中各原子的真正位置，构建出了真核生物转录机构整个活动的晶体图片。

Kornberg因此获得2006年诺贝尔化学奖。

值得指出的是，他的父亲A.Kornberg找到了DNA复制所需的DNA聚合酶与S.Ochoa分享了1959年诺贝尔生理学医学奖。

真核生物的RNApol的结构比原核生物复杂，所有真核生物的RNApol都有2个不同的大亚基和十几个小亚基。

3种真核生物RNApol都具有核心亚基，与大肠杆菌RNApol的核心酶的各亚基间有一些序列同源性。

最大的亚基（160一220kDa）和另一大亚基（128-150kDa）与大肠杆菌RNApol的β’和β相似。

酵母的RNApolI和RNApolⅢ各有2个不同的亚基，与大肠杆菌RNApol的α亚基有一定相似性；酵母的RNApolⅡ有2个相同的亚基，与大肠杆菌RNApol的α亚基也有一定同源性。

除核心亚基外,3种真核生物RNApol都有5个共同小亚基，其中2个是相同的。

另外，每种真核生物RNApol各自还有5-7个特有的小亚基。

这些小亚基的作用尚不完全清楚，但是，每一种亚基对真核生物RNApol发挥正常功能都是必需的。

RNApolⅡ由12个亚基组成，其最大亚基的梭基端有一段Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser的7个氨基酸共有重复序列，称为羧基末端结构域（carboxyl-terminaldomain，CTD）。

RNApolI和RNApolⅢ中都没有CTD结构。

所有真核生物的RNApol11都具有CTD,只是其中的7个氨基酸共有序列的重复程度不同。

酵母RNApolⅡ的CTD有27个重复共有序列，其中18个与上述7个氨基酸共有序列完全一致；哺乳类动物RNApolⅡ的CTD有52个重复共有序列，其中21个与上述7个氨基酸共有序列完全一致。

CTD对于维持细胞的活性是必需的。

体内外实验均证明，CTD的可逆磷酸化在真核生物转录起始和延长阶段发挥重要作用。

去磷酸化的CTD在转录起始中发挥作用，当RNApolⅡ完成转录启动，离开启动子时，CTD的许多Ser和一些Tyr残基必须被磷酸化。

二、转录因子在真核生物转录起始中具有重要作用

真核生物的基因转录过程，同样可以分为3个阶段：

起始阶段（RNApol和通用转录因子形成转录起始复合体）、延长阶段和转录终止。

与原核生物的显著不同是，起始和延长过程都需要众多相关的蛋白质因子参与，这些因子被称为转录因子（transcriptionalfactors,TF）或反式作用因子（trans-actingfactors）。

（一）转录前起始翅合体的形成

真核生物的转录起始上游区段序列与原核生物相比更加多样化。

不同物种、不同细胞或不同的基因，转录起始点上游都有不同的特异DNA序列，包括启动子、增强子等，统称为顺式作用

第十六章RNA的生物合成321

元件（见第十三章和第十八章）。

真核生物转录起始也需要RNApol对起始点上游DNA序列进行辨认和结合，生成转录前起

始复合体（preinitiationcomplex，PIC）。

转录起始时，真核生物的RNApol不直接识别和结合模板的起始区，而是依靠转录因子识别并结合起始序列，故其起始复合体的装配过程比原核生物复杂的多。

能直接或间接识别和结合启动子及其上游调节序列等顺式作用元件的蛋白质属于转录因子其中直接或间接结合RNA聚合酶，为转录起始前复合体装配所必需的，又称为通用转录因子（generaltranscriptionfactor）或基本转录因子（basaltranscriptionfactor）。

真核生物中不同的RNA州需要不同的基本转录因子（TF）配合完成转录的起