作物保护优秀论文4.docx

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作物保护优秀论文4

岩木瓜化学成分的分离、结构鉴定与杀虫活性

植物保护（含农药方向）2005级沈丽淘

指导教师王学贵讲师

摘要：

为了研究岩木瓜的杀虫活性成分，本文利用活性跟踪分离技术，采用硅胶柱层析、薄层层析及葡聚糖凝胶等分离手段对岩木瓜的化学成分进行了分离、纯化，结合化合物理化性质和波谱数据对其结构进行了鉴定。

结果表明，从岩木瓜中分离得到4个化合物，分别为β-香树脂醇乙酸酯

（1）、蒲公英赛酮

（2）、柯依利素（3）及齐墩果酸（4）。

利用胃毒法测定了化合物（500μg/g）对家蝇的生物活性，处理家蝇48h后，蒲公英赛酮

（2）的校正死亡率达到83.33%，弱于对照药剂（鱼藤酮）校正死亡率（100%），与其他处理差异显著，表现出较好的杀虫活性，其杀虫作用机理值得进一步研究。

关键词：

岩木瓜；活性跟踪分离；家蝇；杀虫活性；蒲公英赛酮

CompoundsfromFicustsiangiiMerr.exCorner:

isolation,structuralelucidationandinsecticidalactivity

ShenLi-taoPlantprotection（directionofpesticide）,Grade2005

DirectedbyWangXue-gui（lecturer）

Abstract:

ThechemicalconstituentsofFicustsiangiiMerr.exCornerwereisolatedandpurifiedwithactivity-guidedfractionationtechnologybysilicagel,thin-layerchromatographyandSephadexLH-20columnchromatographytoinvestigatetheinsecticidalactivityconstituents,andtheirstructureswereidentifiedwithspectroscopicmeansinthispaper.Theresultsindicatedthat4compoundswereisolatedandtheirstructureswereidentifiedasβ-amyrinacetate

（1）,taraxerone

（2）,chrysoeriol（3）,oleanolicacid（4）.Theinsecticidalactivitiesofcompounds（500μg/g）werealsoevaluatedagainstimagoofMuscadomesticawithstomach-toxicitytest.Aftertreated48h,thecorrectedmortalityoftaraxerone

（2）achieved83.33%,whichwasalittlelowerthancontrastpesticide（rotenone）butsignificantwithothertreatments.Aboveall,taraxeroneshowedbetterinsecticidalactivity,andtheinsecticidalmechanismwouldbeworthyoffurtherstudy.

Keywords:

FicustsiangiiMerr.exCorner;activity-guidedfractionation;Muscadomestica;insecticidalactivity;taraxerone

由化学农药带来的残留、环境污染等问题受到人们普遍关注，随着社会的发展，人们对环境和食品安全的要求越来越高。

因此，植物保护科学研究工作者开发出高效、低毒、低残留的药剂，有效控制有害生物危害农林作物为害，降低农药对环境及食品的污染已成为首要目标。

植物源农药作为生物农药的一种成为近来的研究热点[1]。

我国具有丰富的植物资源，从植物中提取出杀虫活性成分已有较多成功报道。

从楝科植物印楝中开发的印楝杀虫剂是当今世界公认的最优秀的生物农药之一,其国际影响与市场空间日益扩大[2]。

吴文君等[3]对传统杀虫植物苦皮藤的化学成分、衍生合成、作用机理、制剂加工、应用技术等进行了系统研究，研制出的0.2%苦皮藤素乳油于2001年投入批量生产,取得明显的经济效益和环境生态效益。

曾东强等[4]报道了山石榴果实提取物对小菜蛾的拒食作用，研究表明其甲醇提取物对小菜蛾的拒食活性高，24h非选择性拒食率达82%。

曾宪儒等[5]筛选了广西6种植物提取物对蔬菜害虫的生物活性，发现葫蔓藤对桃蚜、萝卜蚜和小菜蛾3龄幼虫具有较好的触杀活性。

Georgesetal[6]以三齿骚扰蚊（Ochlerotatustriseriatus）、烟粉虱（Bemisiatabacci）成虫为研究对象，测定了采自布基纳法索的8种植物的杀虫活性，并通过活性跟踪从C.nigricans叶片提取物中分离出大黄素、citreorosein、emodicacid和毛地黄黄酮，其中大黄素活性最明显。

岩木瓜（Ficus tsiangii Merr.exCorner）为桑科榕属植物，为我国特有物种，在湖南发现其大量具有茎花现象[7]。

到目前为止国内外对其植物提取物及次生代谢产物用于控制病虫草等有害生物发生没有任何相关研究。

基于前期42种药用植物甲醇提取物对病虫草的生物活性的初步测定，发现岩木瓜对家蝇表现出较好的活性。

因此，本研究以家蝇作为活性跟踪靶标，对岩木瓜杀虫活性成分进行了跟踪分离和鉴定，并测定了化合物的生物活性。

1材料与方法

1.1供试材料

1.1.1植物材料

岩木瓜（F.tsiangiiMerr.exCorner），采集于重庆市金佛山自然保护区，由重庆市药用植物栽培研究所易思荣副研究员采集并鉴定。

1.1.2供试昆虫

家蝇（MuscadomesticaVicinaMacquar）：

在室内连续饲养多代，成虫饲料为麦麸+奶粉+糖，幼虫饲料为医用酵母片+麦麸+奶粉。

成虫羽化后放入成虫饲料和水，以羽化3~4天的成虫供试。

1.1.3供试试剂

甲醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷、石油醚等化学试剂（均为AR）：

广州化学试剂厂。

1.1.4主要仪器

EYELAN-1型旋转蒸发仪：

日本理化公司；

101-2型电热恒温鼓风干燥箱：

上海南阳仪器有限公司；

FE-130植物粉碎机：

河北黄晔科学仪器厂；

1702-MP8型电子天平：

德国Startorius公司；

HH.S21-4型水浴锅：

上海悦丰仪器仪表公司。

1.2方法

1.2.1材料的干燥与提取

将采集的植物在自然状况下风干，然后用白瓷盘盛装放入真空干燥箱内烘干，设置箱内温度为55℃，压力为0.05Pa，直到植物样品完全干燥为止。

然后用粉碎机进行粉碎，得到60目筛的植物样品粉末。

采用冷浸法[8]进行提取，称取50g干粉样品装入大型广口瓶，然后加入500mL甲醇进行提取，每天振荡一次，5天后滤出浸提液，重复3次，将滤出液合并，在55℃下减压蒸馏，得到植物甲醇提取物浸膏，称重。

1.2.2化学成分的初步分离

岩木瓜干粉经95%甲醇冷浸提取并依次经石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取后，得到石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物和水萃取物，并称重。

1.2.3正相硅胶柱层析分离

洗脱剂系统的选取：

用两种或三种互溶且极性不同的溶剂配成一系列成极性梯度的混合溶剂，用TLC板对样品进行展开。

选择样品在TLC板上展开后分开的点数多，且多数点的Rf值在0.2-0.6以内的溶剂系统为合适的洗脱系统。

拌样：

在待分离样品中加入少量易挥发且对样品溶解性好的溶剂，稍稍水浴加热使样品完全溶解。

将硅胶（拌样硅胶比柱层析所用硅胶的颗粒较大）加入溶解的样品溶液里，放在水浴上，边加边搅拌，直至溶剂完全挥干。

装柱：

湿法装柱—洗脱剂与适量硅胶搅拌混匀，倒入固定好的层析柱中，用洗耳球在四周轻敲层析柱，使柱面平整。

同时打开活塞，使溶剂缓缓流出，沉降至硅胶填料面不再下降为止。

上样：

用药勺将拌好的硅胶样品均匀洒在装好的硅胶填料上面，轻敲使样品层高度不再下降，然后在样品层上洒上一层石英砂或加一团脱脂棉。

洗脱：

上样后，从层析柱上方加入洗脱溶剂进行洗脱。

根据层析柱装入填料的量和柱直径大小，定量接取流分。

所接流分浓缩后经TLC点样检验，比较各流分组分的异同。

1.2.4SephadexLH-20凝胶分离

先将SephadexLH-20进行预处理，然后根据需要用不同的溶剂反复浸泡，溶剂一般为丙酮、甲醇等。

将浸泡好的SephadexLH-20装入细长的玻璃柱中，用相应的溶剂反复洗脱。

待液面与凝胶平齐时，快速加入经0.45μm微孔滤膜过滤的样品溶液，等样品刚好完全进入凝胶时，加入溶剂进行冲洗，从下端接收。

1.2.5薄层层析（TLC）

薄层层析硅胶板经110℃活化2h后，存放于干燥器中备用。

加样与展开：

待分离样品用溶剂溶解到适量浓度，用直径0.3mm的毛细管点样在距薄层板边缘1cm左右的直线上，挥发干溶剂后放入层析缸中展开。

检测：

展开完成后（距上端20%-40%均可），取出硅胶板，吹干溶剂，先在紫外灯下观察荧光显色情况，后放在碘缸中用碘显色，初步观察样品情况。

1.2.6结构鉴定

结构鉴定主要根据核磁共振（NMR）图谱进行，由核磁共振谱推测C、H原子数及相关的基团，推测出化合物的结构，通过对比文献，对波谱数据进行归属。

1.2.7杀虫活性测定方法

家蝇：

采用胃毒法[8]。

活性跟踪测定时用电子分析天平准确称取0.1g各萃取物于10mL的刻度试管中，用丙酮溶解并定容至10mL刻度配制成10mg/mL溶液。

化合物杀虫活性测定时将分离所得化合物及鱼藤酮（对照药剂）用丙酮分别配制出500µg/mL浓度的药液。

然后称取1g白砂糖于直径为2.5cm，高为7.5cm的指形管中。

用微量进样器准确吸取1mL各种药液转入指形管中，待溶剂自然风干后备用。

挑选羽化后4天整齐一致的家蝇成虫，用乙醚麻醉后，迅速向每管中接入10头家蝇。

每处理设3次重复，每重复10头试虫，丙酮作空白对照。

处理12h、24h、36h、48h后分别记录死亡虫数，计算死亡率和校正死亡率。

1.2.8统计分析

死亡率（%）=

校正死亡率（%）=

利用SPSS10.0（Duncan’s新复极差测定法）及EXCEL2003统计分析不同处理的差异显著性及标准误。

2结果与分析

2.1岩木瓜枝叶提取、初步分离及其对家蝇的毒杀活性

2.1.1提取和初步分离结果

岩木瓜干粉20.3kg经95%甲醇冷提取得到浸膏约1850g，依次经石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取后，得到石油醚萃取物（435.0g）、氯仿萃取物（35.5g）、乙酸乙酯萃取物（57.8g）和水萃取物（975g）。

2.1.2不同萃取物对家蝇的杀虫活性

不同溶剂萃取物的杀虫活性见表1，由表可见各萃取层处理家蝇12小时后校正死亡率不高，均在20%左右；各萃取层处理家蝇24小时后，石油醚萃取物的校正死亡率最高，达到90%；其次是氯仿层，其校正死亡率80%，然后为水层处理，其校正死亡率为43.33%，这三层校正死亡率均与乙酸乙酯萃取物处理差异显著；各萃取层处理家蝇36小时后，石油醚萃取物处理家蝇的校正死亡率最大，达到96.67%，其次为氯仿萃取物，其校正死亡率达到80.00%，而水层处理其校正死亡率为63.33%。

从以上分析结果说明岩木瓜甲醇提取物的活性成分主要集中在石油醚萃取物、氯仿萃取物。

表1岩木瓜甲醇提取物各溶剂萃取物对家蝇的杀虫活性（2000μg/g糖）

Table1InsecticidalactivityofpartitionextractsfromF.tsiangiiagainstMuscadomestica

（2000μg/gsugar）（四川雅安，2008.11）

萃取层Fraction

12h校正死亡率（%）

Thecorrectedmortalityof12h

aftertreatment（%）

24h校正死亡率（%）

Thecorrectedmortalityof24haftertreatment（%）

12h校正死亡率（%）

Thecorrectedmortalityof12h

aftertreatment（%）

石油醚萃取物

Petroleumetherextract

13.33±1.36ab

90.00±0.00a

96.67±1.36a

氯仿萃取物Trichloromethaneextract

13.33.00±0.00ab

80.00±0.00a

80.00±0.00a

乙酸乙酯萃取物Ethlacetateextract

0.00±0.00b

0.00±0.00c

3.33±1.36c

水萃取物Waterextract

20.00±0.00a

43.33±8.92b

63.33±6.80b

CK

0.00±0.00b

0.00±0.00c

0.00±0.00c

1）校正死亡率是三次重复的平均值±SE，同列数字后随相同字母表示在0.05水平上差异不显著（DMRT）

1）Thecorrectedmortalityisaverageofthreereplications±SE;Thosewithinacolumnfollowedbythesameletteraren’tsignificantlydifferentat5%level（DMRT）.

2.2岩木瓜活性成分的分离

2.2.1岩木瓜石油醚层活性成分的分离

2.2.1.1岩木瓜石油醚层各馏分对家蝇的生物活性

采用正相硅胶柱层析对石油醚萃取物（435.0g）中杀虫活性成分进行分离（硅胶为100~200目：

柱规格为85mm×1200mm，用石油醚装柱，以石油醚:

丙酮（98:

2），（95:

5），（90:

10），（85:

15），（80:

20），（70:

30），（60:

40），（50:

50），（40:

60），（30:

70）进行梯度洗脱，最后用甲醇冲柱）得到225个馏分，通过TLC分析将1~2，3~4，5~6，7，9~10，11~16，17~20，21，22~23，24~29，30~40，41~49，50~63，64~79，80~94，95~106，107~118，119~132，133~144，145~154，155~163，164~179，180~205，206~225馏分分别进行合并。

各馏分对家蝇成虫生物活性结果如表2所示。

由表可见岩木瓜石油醚层各馏分处理家蝇12h以后有两个馏分段对家蝇的校正死亡率在70%以上，为F3~4及F11~16馏分，其校正死亡率分别为74.07%及85.89%；各馏分段处理家蝇24h后，有4个馏分段对家蝇的校正死亡率在70%以上，分别为F3~4、F5~6、F11~16及F206~225号馏分，其校正死亡率分别达到87.50%、70.83%、100.00%及79.17%，因此，岩木瓜石油醚萃取物的活性成分主要集中在F3~4、F5~6、F11~16及F206~225号馏分。

表2岩木瓜甲醇提取物石油醚层各馏分对家蝇的杀虫活性（500μg/g糖）

Table2InsecticidalactivityofdifferentfractionsfromPetroleumetherofF.tsiangiiagainstM.domestica（500μg/gsugar）（四川雅安，2008.11）

馏分

Fractions

质量（g）

Weight（g）

12h的校正死亡率（%）

Thecorrectedmortalityof

12haftertreatment（%）

24h的校正死亡率（%）

Thecorrectedmortalityof

24haftertreatment（%）

F1~2

32.8

33.33±1.31cd1）

66.67±1.70c

F3~4

15.6

74.07±1.51b

87.50±0.00ab

F5~6

18.1

44.44±1.31c

70.83±0.85bc

F7

15.4

3.70±0.76gh

8.33±1.70fgh

F9~10

10.2

3.70±0.76gh

16.67±3.40efgh

F11~16

7.6

85.89±1.47a

100.00±0.00a

F17~20

3.2

00.00±0.00h

0.00±0.00h

F21

35.8

0.00±0.00h

0.00±0.00h

F22~23

12.4

3.70±0.76gh

12.50±1.47fgh

续表2

馏分

Fractions

质量（g）

Weight（g）

12h的校正死亡率（%）

Thecorrectedmortalityof

12haftertreatment（%）

24h的校正死亡率（%）

Thecorrectedmortalityof

24haftertreatment（%）

F24~29

16.7

0.00±1.47h

0.00±0.00h

F30~40

28.5

22.22±0.00def

20.83±0.85defg

F41~49

13.5

0.00±0.00h

8.33±1.70fgh

F50~63

24.3

0.00±0.76h

0.00±0.00h

F64~79

8.5

0.00±0.00h

29.17±0.85de

F95~106

6.5

0.00±0.00h

4.17±0.85gh

F107~118

10.7

3.70±0.76gh

37.50±1.47d

F119~132

10.2

18.52±0.76ef

25.00±0.00def

F80~94

7.3

3.70±0.00gh

36.59±1.47d

F133~144

5.4

3.70±0.76gh

33.33±0.85de

F145~154

6.1

14.81±0.76fg

20.83±0.85efg

F155~163

10.3

11.11±1.31fgh

38.50±1.47d

F164~179

5.2

3.70±0.76hg

4.17±0.85gh

F180~205

15.4

0.00±0.00h

0.00±0.00h

F206~225

35.8

29.63±0.76de

79.17±0.85bc

CK

0.00±0.00h

0.00±0.00h

1）校正死亡率是三次重复的平均值±SE，同列数字后随字母表示在0.05水平上差异不显著（DMRT）

1）Thecorrectedmortalityisaverageofthreereplications±SE;Thosedatawithinacolumnfollowedbythesameletteraren’tsignificantlydifferentat5%level（DMRT）.

2.2.1.2岩木瓜石油醚层活性成分的分离

F3~4馏分活性成分的分离。

该馏分段含有油酯较多，将其用石油醚反复洗脱，得到白色粉末（50mg），然后用丙酮溶解，多次重结晶后得到白色单一化合物，经1H-NMR,13C-NMR波谱数据确定为化合物YMG-1。

F5~6馏分活性成分的分离。

将该馏分段用石油醚反复洗脱除去油脂状物质，再用丙酮溶解，重结晶得到白色粉末状物质（310mg），再采用正相硅胶柱层析（硅胶：

200-300目，柱规格为20mm×500mm，以石油醚:

丙酮（90:

10）装柱，以（85:

15），（80:

20），（75:

25），（70:

30），（60:

40）进行梯度洗脱）得到5个馏分。

经TLC确定，第3~5馏分为单点，荧光不显色，碘显色，10%硫酸显浅紫色。

经1H-NMR,13C-NMR波谱数据确定为化合物YMG-2。

2.2.2岩木瓜氯仿层活性成分的分离

2.2.2.1岩木瓜氯仿层各馏分对家蝇的生物活性

采用正相硅胶柱层析对氯仿萃取物（35.5g）分离（硅胶：

100-200目，柱规格为45mm×900mm，以氯仿装柱，经氯仿:

甲醇（98:

2），（95:

5），（90:

10），（85:

15），（80:

20），（70:

30），（60:

40）进行梯度洗脱）得到139个馏分。

经TLC确定，将馏分1~5，6~20，21~35，36~47，48~63，64~69，100~105，106~109，110-139分别合并。

各合并馏分段对家蝇的生物测定结果如表3。

结果表明，各馏分处理家蝇12h以后各馏分对家蝇的校正死亡率都低于50%，最高的是F21~35，其校正死亡率为50%。

各馏分处理家蝇24h，F6~20、F21~35及F106~109三个馏分段对家蝇的校正死亡率均超过85%，说明岩木瓜氯仿层的活性成分主要集中在该三馏分段。

表3岩木瓜甲醇提取物氯仿层各馏分对家蝇的杀虫活性（500μg/g糖）

Table3InsecticidalactivityofdifferentfractionsfromTrichloromethaneofF.tsiangiiagainstM.domestica（500μg/gsugar）（四川雅安，2008.11）

Fractions

质量（g）

Weight（g）

12h的校正死亡率（%）

Thecorrectedmortalityof

12haftertreatment（%）

24h的校正死亡率（%）

Thecorrectedmortalityof

24haftertreatment（%）

F1~5

3.2

5.00±0.00c1）

63.33±1.85b

F6~20

1.5

40.00±0.00ab

84.07±2.14a

F21~35

2.1

50.00±0.00a

87.78±1.85a

F36~47

1.8

0.00±0.00d

48.15±1.07c

F48~63

2.2

0.00±0.00d

51.85±2.83bc

F64~69

2.4

0.00±0.00d

51.85±1.07bc

F100~105

4.2

0.00±0.00d

59.26±2.83ab

F106~109

1.5

20.00±0.00ab

86.67±1.85a

F110-139

3.7

0.00±0.00d

59.26±2.14bc

CK

0.00±0.00d

0.00±0.00d

1）校正死亡率是三次重复的平均值±SE，同列数字后随字母表示在0.05水平