制药大实验报告东方学院讲解.docx

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制药大实验报告东方学院讲解

生物制药大实验

题目：

乳酸菌分离鉴定及乳酸菌素片的制备

学生姓名

学号

专业

班级

学部

食品与环境工程

同组人

一、实验目的

1.掌握培养基的配制方法

2.掌握菌种的分离方法

3.了解乳酸菌的生产特征

4.学会制作乳酸菌素片的方法

二、实验原理

1、乳酸菌的简介

凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸的细菌统称为乳酸菌。

乳酸菌能够将碳水化合物发酵成乳酸，因而得名。

乳酸菌是一种存在于人类体内的益生菌为原核生物，它们在自然界分布极为广泛而且具有丰富的物种多样性，目前至少可分为18个属，共有200多种。

它们不仅是研究分类、生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料，在理论上具有重要的学术价值，而且在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值也极高。

乳酸菌也广泛存在于畜、禽肠道、许多食品、物料及少数临床样品中。

乳酸菌不仅可以提高食品的营养价值，改善食品风味，提高食品保藏性和附加值，而且乳酸菌的特殊生理活性和营养功能，正日益引起人们的重视。

大量研究表明，乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，控制内毒素，抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生，制造营养物质，刺激组织发育，从而对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和突然的应急反应等产生作用。

由此可见，乳酸菌的生理功能与机体的生命活动息息相关。

可以说，如果乳酸菌停止生长，人和动物就很难健康生存。

也正因为如此，乳酸菌被广泛用于轻工业、食品、医药及饲料工业等许多行业上。

长期科学研究结果表明，以乳酸菌为代表的益生菌是人体必不可少的且具有重要生理功能的有益菌，它们数量的多和少，直接影响到人的健康与否，直接影响到人的寿命长短，科学家长期研究的结果证明，乳酸菌对人的健康与长寿非常重要。

而人体肠道内乳酸菌拥有的数量，随着人的年龄增长会逐渐减少，当人到老年或生病时，乳酸菌数量可能下降100至1000倍，直到老年人临终完全消失。

在平时，健康人比病人多50倍，长寿老人比普通老人多60倍。

因此，人体内乳酸菌数量的实际状况，已经成为检验人们是否健康长寿的重要指标。

由于广谱和强力的抗菌素的广泛应用，使人体肠道内以乳酸菌为主的益生菌遭受到严重破坏，抵抗力逐步下降，导致疾病越治越多，健康受到极大的威胁。

所以，有意增加人体肠道内乳酸菌的数量就显得非常重要。

国际上公认的乳酸菌，被认为是最安全的菌种，也是最具代表性的肠内益生菌，人体肠道内以乳酸菌为代表的益生菌数量越多越好。

也完全符合诺贝尔得奖者生物学家梅契尼柯夫“长寿学说”里所得出的结论，乳酸菌=益生菌=长寿菌。

2、革兰氏染色法

革兰氏染色法是1884年由丹麦医师Gram创立的。

此法法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：

染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。

细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。

革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，

在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。

   革兰氏染色需用四种不同的溶液：

碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。

碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。

媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。

脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精。

复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。

3、牛津杯抑菌实验

抑菌试验方法主要有两种，即扩散法和稀释法。

其中扩散法属手工测试方法，通过测试药物纸片或者牛津杯在固体培养基上的抑菌圈的大小，判断细菌对该种药物是否敏感而稀释法包括试管稀释法和微量稀释法，通过测试细菌在含不同浓度药物培养基内的生长情况，判断其最低抑菌浓度（MIC）。

由于扩散法操作简单，成本低，已经被大多数实验室和基层单位所采用。

扩散法又包括纸片法、牛津杯法和打孔法。

下面将介绍本次实验所采用的牛津杯法实验原理:

a、将培养基平板置培养箱中培养，一方面试验菌（指示菌）开始生长繁殖；另一方面乳酸菌呈球面扩散，形成递减的梯度浓度，离杯越近，乳酸菌浓度越大，离杯越远乳酸菌浓度越小。

b、在牛津杯周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。

c、抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度或药物对指示细菌的抑菌程度。

d、乳酸菌浓度越高，抑菌圈越大。

e、在抑菌圈的边缘处，琼脂培养基中所含抑菌物质的浓度即为该菌悬液中对该种指示菌的最低抑菌浓度（MIC）。

4、片剂的制备

片剂系指药物与适宜的辅料均匀混合，通过制剂技术压制而成片状的固体制剂。

片剂是医疗中应用最广泛的剂型之一，它具有剂量准确，质量稳定。

服用方便、成本低等优点。

片剂由药物和辅料二部分组成。

辅料是指片剂中除主药外一切物质的总称，亦称赋形剂，为非治疗性物质。

加入辅料的目的是使药物在制备过程中具有良好的流动性和可压性；有一定的黏结性；遇体液能迅速崩解、溶解、吸收而产生疗效。

辅料应为“惰性物质”，性质稳定，不与主药发生反应，无生理活性，不影响主药的含量测定，对药物的溶出和吸收无不良影响。

但是，实际上完全惰性的辅料很少，辅料对片剂的性质甚至药效有时可产生很大的影响，因此，要重视辅料的选择。

片剂中常用的辅料包括填充剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂及润滑剂等。

通常片剂的制备包括制粒压片法和直接压片法二种，前者根据制颗粒方法不同，又可分为湿法制粒压片和干法制粒压片，其中湿法制粒压片较为常用。

湿法制粒，欲制好颗粒，首先必须根据主药的性质选好粘合剂或润湿剂，制软材时要控制粘给剂或润湿的用量，使之“握之成团，轻压即散”，并握后掌上不沾粉为度。

过筛制得的颗粒一般要求较完整，可有一部分小颗粒，如果颗粒中含细粉过多，说明粘合剂量太少；若呈现条状，则说明粘合剂用量太多，这两种情况制出的颗粒烘干后，往往出现太松各太硬，都不能符合压片的颗粒要求，从而不得制好片剂。

颗粒的大小根据片剂大小由筛网孔径来控制，一般大片（0.3~0.5g）选用14~16目。

小片（0.3g以下）选用18~20目筛制粒。

干燥、整粒过程，将已制备好的湿粒应尽快通风干燥，温度控制在40~60℃。

注意颗粒不要铺得太厚，以免干燥时间过长，药物易被破坏。

干燥后的颗粒若粘连结团则需过筛整粒。

整粒后加入润滑剂混合均匀后方可进行压片操作。

制成的片剂需按照中国药典规定的片剂质量标准进行检查。

检查的项目，除片剂的外观完整、光洁、色泽均匀、硬度适当、含量准确外，必须检查重量差异和崩解时限。

对有些片剂产品，药典还规定检查溶出度和含量均匀度，应规定凡检查溶出度的片剂，不在检查崩解时限，凡检查含量均匀度的片剂，不在检查重量差异。

另外，在片剂的制备过程中，所施加的压片力不同，所用的润滑剂、崩解剂等的种类不同，都会对片剂的硬度或崩解时限产生影响。

5、压片机制片的原理

压片机可分为单冲压片机和多冲旋转式压片机。

单冲压片机是通过凸轮（或偏心轮）连杆机构（类似冲床的工作原理），使上、下冲产生相对运动而压制药片。

单冲式并不一定只有一副冲模工作，也可以有两副或更多，但多副冲模同时冲压，由此引起机构的稳定性及可靠性要求严格，结构复杂，不多采用。

单冲压片机是间歇式生产，间歇加料，间歇出片，生产效率较低，适用于试验室和大尺寸片剂生产。

多冲旋转式压片机是将多副冲模呈圆周状装置在工作转盘上，各上、下冲的尾部由固定不动的升降导轨控制。

当上、下冲随工作转盘同步旋转时，又受导轨控制做轴向的升降运动，从而完成压片过程。

这时压片机的工艺过程是连续的，连续加料、连续出片。

就整机来看，受力较为均匀平稳，在正式生产中被广泛使用。

多冲旋转式压片机多按冲模数目来编制机器型号，如俗称19冲、33冲压片机等。

实验室所用的单冲压片机制片原理如下：

（1）剂量的控制

各种片剂有不同的剂量要求，大的剂量调节是通过选择不同冲头直径的冲模来实现的。

在选定冲模尺寸之后，微小的剂量调节是通过调节下冲伸入中模孔的深度，从而改变封底后的中模孔的实际长度，达到调节模孔中药物的填充体积的目的。

因此，在压片机上应具有调节下冲在模孔中的原始位置的机构，以满足剂量调节要求。

（2）药片厚度及压实程度控制

药物的剂量是根据处方及药典确定的，不可更改。

为了贮运、保存和崩解时限要求，压片时对一定剂量的压力也是有要求的，它也将影响药片的实际厚度和外观。

压片时的压力调节是必不可少的。

这是通过调节上冲在模孔中的下行量来实现的。

有的压片机在压片过程中不单有上冲下行动作，同时也可有下冲的上行动作，由上、下冲相对运动共同完成压片过程。

但压力调节多是通过调节上冲下行量的机构来实现压力调节与控制的。

三、实验材料及仪器设备

1、实验材料

酸奶

蛋白胨5.0g、牛肉膏5.0g、酵母提取物2.5g、柠檬酸氢二铵1.0g、K2HPO41.0g、乙酸钠2.5g、葡萄糖10.0g、吐温801.0g、MgSO4﹒7H2O0.3g、MnSO4﹒4H2O0.1g-0.2g、碳酸钙15g、琼脂2.5g、蒸馏水500mL、大肠杆菌

草酸铵结晶紫、生理盐水、碘液、95%乙醇、番红染液

糖粉20.2g、糊精9.2g、淀粉20g、50%乙醇8.8mL、硬脂酸镁0.23g、可可粉2g、

2、实验仪器设备

普通光学显微镜、高压蒸汽灭菌锅、烘干箱、培养箱、微波炉、离心机、单冲压片机、电子天平、片剂四用测定仪

四、实验方法

1.在称量纸上称取蛋白胨5.0g、牛肉膏5.0g、酵母提取物2.5g、柠檬酸氢二铵1.0g、K2HPO41.0g、乙酸钠2.5g、葡萄糖10.0g、吐温801.0g、MgSO4﹒7H2O0.3g、MnSO4﹒4H2O0.1g-0.2g放入到1000mL的烧杯中，在烧杯中加入500mL蒸馏水，用玻璃棒搅拌，再加入碳酸钙15g，至完全溶解，并迅速分别倒入四个锥形瓶中各125mL，在四个锥形瓶中各加入2.5g的琼脂，盖上塞用牛皮纸包好，拿到高压蒸汽灭菌锅里灭菌，同时包好15个平皿、10个1mL的移液管和10支4.5mL的无菌水包好一起送去高压蒸汽灭菌锅里灭菌1h。

2.取回灭菌锅里的MRS固体培养基以及培养皿、移液管和无菌水，待培养基放到室温时进行无菌操作分别倒入六个平皿中。

3.梯度稀释：

从酸奶中吸取0.5mL放到原液里，再从原液里用移液管吸取0.5mL液体到10-2中，再从10-2中用移液管吸取0.5m液体L到10-4中，再从10-4中用移液管吸取0.5mL液体到10-6中。

4.从10-2中吸取0.1mL的菌液滴入到培养皿中，并用涂布棒涂布，从10-4中吸取0.1mL的菌液滴入到培养皿上，涂布，再从10-6中吸取0.1mL的菌液滴入到培养皿中，涂布，每一个分别坐两组并记好标记,放到培养箱里培养12h。

5.从培养箱中取出培养好的酵母菌的培养皿，进行革兰氏染色。

（1）涂片：

取灭菌后的载玻片于实验台上，用胶头滴管吸取一滴生理盐水滴在载玻片的中央，用烧红冷却后的接种环挑去酵母菌并涂布成一均匀薄层，涂布面积不宜过大。

（2）干燥和固定：

将标本面向上，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2到3次，共约2到3秒，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜，放置待冷后，进行染色。

（3）初染：

在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1-2min。

（4）水洗：

斜置载玻片，用蒸馏水的小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

（5）媒染：

用胶头滴管滴取1-2滴碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1-2min。

（6）水洗：

斜置载玻片，用蒸馏水的小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

（7）脱色：

斜置载玻片，用胶头滴管滴加20滴95%的乙醇脱色，至流出的乙醇不在出现紫色为止，随即水洗。

（8）复染：

在涂片薄膜上滴加石碳酸染液1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1-2min。

（9）水洗：

斜置载玻片，用蒸馏水的小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

（10）干燥、观察：

用吸水纸洗掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目标后用油镜观察酵母菌的形态及颜色。

6.在经过以上的步骤配置好四瓶液体培养基，放入到高压蒸汽灭菌锅里灭菌。

7.将灭菌后的培养基放到室温，并将培养后的酵母菌用灭菌后的接种环挑取放入到液体培养基中，放到培养箱中进行培养两天。

8.抑菌实验

把之前配好的固体培养基取出一瓶拿到微波炉里面加热使之溶化成液体，待到大约40-50℃时，用灭菌后的移液管吸取适量的大肠杆菌的菌液加入到培养基中，轻微摇均后，倒入两个平皿中，待平皿中的培养基凝固时，把牛津杯放入乙醇中经酒精灯上灼烧，灭菌后放到平皿中，用移液管吸取之前液体培养基里的乳酸菌至牛津杯中，最后，轻拿到培养箱中进行培养一天，并观察结果，是否出现抑菌圈。

9.将液体培养基里培养的乳酸菌倒入到四个离心管中，放在离心机中离心4000r/min、4min，取出并倒出上清液，在加入蒸馏水在离心一次，并弃去上清液，在倒入到平皿中放入烘干箱中烘干，待烘干后，最后，刮取成粉末。

10.在称量纸上称取糖粉20.2g、糊精9.2g、淀粉20g、可可粉2g、乳酸菌素2g（不够用糊精补齐）放到搪瓷盘上混匀，并带手套边混匀边喷50%乙醇，喷至大约8.8ml，待“握之成团，轻压即散”即可，经80目筛筛取颗粒，铺开放入到烘干箱中烘干，最后称取硬脂酸镁0.23g，放到颗粒中混匀。

11.压片：

把混匀后的颗粒倒入到压片机中进行压片。

12.选择二十片称取平均片重，并取若干片拿到片剂四用测定仪进行崩解并测硬度，记录。

五、实验结果及分析

1.乳酸菌分离鉴定结果。

右图为乳酸菌进行革兰氏染色后的实验结果，呈紫色，单个或成对排列为G+菌。

实验结果分析：

（1）革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。

如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。

脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。

（2）染色过程中勿使染色液干涸。

用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。

2.牛津杯抑菌实验

培养基里出现浑浊，同时在牛津杯附近出现抑菌圈，证明乳酸菌菌对大肠杆菌有抑菌效果。

实验结果分析：

（1）放置牛津杯时，注意与培养皿边缘不能太靠近。

（2）加入牛津杯中的实验菌液应当适量。

（3）实验过程中要进行无菌操作，防止染杂菌，影响抑菌效果。

3.乳酸菌素的重量：

实验所制的乳酸菌素片一共0.5g

实验结果分析：

（1）离心管中的菌体提取时有所残留。

（2）烘干后从平皿中往下刮的过程中会有一定的损失。

4.乳酸菌素片的平均重量：

随机称取20片乳酸菌素片的重量为6.9g而单个乳酸菌素片的重量为0.3g所以平均片重为0.35g。

实验结果分析：

乳酸菌素片的厚度与颗粒的大小以及压片机的冲程有关。

5.乳酸菌素片的硬度：

为19N

实验结果分析：

片剂的制备前期制粒时颗粒不要过大或过小，若颗粒过大则降低了颗粒的内聚力，不易成型，降低了片剂的硬度，若过小，则会造成压片机堵塞不易出片。

6.崩解的时间：

为9min

实验结果分析：

片剂脆碎度与崩解度的解决时常是相互矛盾的，脆碎度合格了硬度又会增大，造成了片剂的崩解迟缓，崩解迟缓又会影响片剂的溶出。

六、思考题

1.通过本实验你学到了什么，发现了哪些自身不足之处？

本实验还有哪些待改进的地方？

答：

通过本实验我学到了大学三年中所学到的专业知识一个系统性的综合运用，进一步更加深刻的掌握了关于乳酸菌的相关知识和各种培养基的制作步骤，加深了对革兰氏染色法的操作步骤的了解，而且通过此次的专业大实验也在一定的程度上培养了我们的团队合作意识，这在今后的生活中是一个不可或缺的生存意识，因为任何一个人的力量都是渺小的，只有融入团队，只有与团队一起奋斗，你才实现个人价值的最大化，你才能成就自己的卓越！

团队，是为了实现一个共同的目标而集合起来的一个团体，需要的是心往一处想，劲往一处使；需要的是分工协作，优势互补；需要的是团结友爱、关怀帮助；需要的是风雨同舟，甘苦与共！

一个想成为卓越的人，仅凭自己的孤军奋战，单打独斗，是不可能成大气候的。

你必须要融入团队，你必须要借助团队的力量才能有所作为。

随着实验的不断进行我也发现自身还有很多的不足之处例如实验的基本原理掌握的不是很清楚，甚至在刚开始的时候不知道自己每天都在做什么，只是很盲目的跟着别的同学做实验，同时有一个更大的问题显现出来那就是觉得自己的专业知识学的特别不好，当涉及到专业知识时很自然的拿手机去XX而不是去冷静的思考，这应该是大部分同学的通病吧，真是书到用时方恨少，在今后的学习生活中一定要认真学习。

此次实验的不足之处在于实验过程稍显复杂，制粒的过程中对学生手法精确度要求颇高还有就是实验室的单冲压片机从老师的实验教学进度和学生的安全角度着想真的该要更换了。

2.通过三年多的大学学习，你喜欢生物制药这个专业吗？

从入学到现在，通过三年多的学习你对这个专业有何新的认识？

如果再有选择专业的机会你还会选择生物制药这个专业吗？

答：

通过大学里三年多的学习，生物制药这四个字逐渐由陌生变得越加的熟悉，刚开始学习的时候真的觉得这专业非常枯燥乏味而且学的东西还特别多都是一些理论的知识，后来随着系统性的深入学习逐渐发现还是很有乐趣的嘛，尤其在做实验的过程中累并快乐着，我觉得生物制药专业现在的就业前景还是很好的是很有优势的，是对传统的制药工程的革新，上升到生物或是微生物制药的平台上，对人体而言更安全更可靠，副作用更少，。

并且这专业在国内的发展刚刚起步，很有发展空间，在国外，就不用说了，有很多新理论新技术。

如果再有选择专业的机会我还会选择生物制药，顾名思义药现在充斥着我们每个人的生活，而且近来人们的健康问题日益备受关注，所以我们更加要学好这门专业课从而为那些受倍受疾病困扰的患者提供更多的帮助。

2015.10.21