PCR技术培训教材.docx
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PCR技术培训教材
PCR基础理论
一、半保留复制及转录、逆转录
（1）DNA的半保留复制（semiconservativereplication）
DNA是所有原核生物和真核生物遗传的主要物质基础。
在这些生物中遗传信息以遗传密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序,并通过DNA复制（replication）由亲代传给子代。
在DNA合成进行时，以两条亲代DNA链中的每一条链为模板，在DNA指导下的DNA聚合酶催化下，按A与T、G与C碱基配对原则合成子代DNA的过程称DNA的复制。
由于复制合成的子代DNA两条脱氧核糖核苷酸链中有一条来自亲代DNA，另一条是以前者为模板新合成的子代DNA链，所以DNA的这种合成作用又称半保留复制（图1）。
（2）RNA的转录（transcription）过程
以DNA为模板合成RNA的过程称为转录（transcription）。
转录是生物界RNA合成的主要方式，是遗传信息由DNA向RNA传递过程，也是基因表达的开始。
转录也是一种酶促的核苷酸聚合过程，所需的酶叫做依赖DNA的RNA聚合酶（DNA-dependentRNApolynerase,DDRP）。
转录产生初级转录物为RNA前体（RNAprecursor），它们必须经过加工过程变为成熟的RNA，才能表现其生物活性。
RNA的转录合成从化学角度来讲类似于DNA的复制，多核苷酸链的合成都是以5’→3’的方向，在3’-OH末端与加入的核苷酸磷酸二酯键，但是，由于复制和转录的目的不同，转录又具有其特点：
（1）对于一个基因组来说，转录只发生在一部分基因，而且每个基因的转录都受到相对独立的控制；
（2）转录是不对称的。
（3）转录时不需要引物，而且RNA链的合成是连续的。
转录的主要过程分为识别与起始、延长和终止三个阶段。
（3）RNA的逆转录（reversetranscription）过程
以RNA为模板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序（其中U与A配对）合成DNA。
这一过程与一般遗传信息流转录的方向相反，故称为逆转录，催化此过程的DNA聚合酶叫做逆转录酶（reversetranscriptase）。
大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。
①DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。
②RNaseH活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNaseH从RNA5′端水解掉RNA分子。
③DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。
除此之外，有些反转录酶还有DNA内切酶活性。
反转录酶的发现对于基因工程技术起了很大的推动作用，目前它已成为一种重要的工具酶。
二、PCR技术的基本原理与PCR技术的特点
聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）,又称无细胞分子克隆系统或体外酶促基因扩增法。
PCR技术是由KaryBMullis于1985年联合创造的。
该技术可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力，能检测单分子DNA或对每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品。
PCR技术的基本原理
其原理类似于DNA的天然复制过程，PCR由变性－退火－延伸三个基本反应步骤构成。
①模板DNA的变性
模板DNA经加热至93℃左右一段时间后，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；
②模板DNA与引物的退火（复性）
模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸
DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性－退火－延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”,这种新链又可成为下次循环的模板，每完成一个循环需2－4分钟，2－3个小时就能将待扩目标基因扩增放大几百万倍。
PCR反应五要素
参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。
PCR反应条件
PCR反应条件为温度、时间和循环次数，温度、时间和循环次数的设置对PCR的成功与否至关重要。
1、温度与时间的设置
基于PCR原理三步骤而设置变性－退火－延伸三个温度点。
在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。
对于较短靶基因（长度为100～300bp）可采用二温度点法，除变性温度外，退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸（此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性）。
①变性温度与时间：
变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。
一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。
此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
②退火（复性）温度与时间：
退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。
变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。
由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。
退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。
对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。
复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间：
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。
3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
循环次数：
循环次数决定PCR扩增程度。
PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。
一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
PCR反应特点
特异性强：
PCR反应的特异性决定因素为：
①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；③TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。
引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。
聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。
再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。
灵敏度高：
PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（ug=-6）水平。
能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。
简便、快速：
PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4小时完成扩增反应。
扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低：
不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。
可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。
三、PCR仪：
随着分子生物学的创立与发展，PCR测定方法作为一门崭新的技术已经在遗传疾病的诊断、临床标本中病原体核酸的检测、激活癌基因中突变情况的分析、法医学上的遗传学鉴定以及分子克隆诸方面得以越来越广泛的应用。
实现这项技术的工具――PCR扩增仪也应运而生。
PCR扩增仪是整个PCR实验关键的仪器，它性能的好坏决定着实验结果的准确性。
而仪器的恒温和变温的性能是决定基因片段完成变性、退火、延伸的最重要的参数。
目前国内用户使用的PCR扩增仪品牌很多，原理和样本载量也不尽相同。
下面测重给大家从恒温和变温两方面介绍各类扩增仪的原理：
1．梯度水浴法：
这种方法一般是水浴槽加上机械臂结构。
仪器上设有3个不同温度的水浴槽，通过机械臂携带样品管在这3个槽中浸泡，完成变性、退火、延伸3个过程。
其优点是温度变化快，时间准确，温度可调，省时省力，价格较低。
缺点是以室温温度为下限，不能实施复杂的操作过程。
2．空气驱动循环恒温装置：
本系统用空气作为热传导媒介。
外壳采用商品化的家用对流恒温器（烘箱）的外壳，热源包括两部分：
强热气由热空气枪来提供，大功率风扇为制冷提供外部空气，或由冷室或更复杂设备产生冷空气。
这种装置的优点是不用金属的精密加工，可使成本降低。
整个系统不采用制冷液，安全程度高。
同时以测定管内温度为控温依据，显示温度真实可靠。
缺点是受环境温度影响大，各管的均一性需要严密的设计才能得以保证。
3．变温金属块作恒温装置：
此类扩增仪中心是一个热块，上面均匀分布48或96孔，放专用的样品管，内壁加工精密，保证和反应管紧密接触。
热块由其下部的电阻丝加热升温，并由微机控制恒温。
冷却采用压缩机制冷，可快速制冷，温度变化速率大于1℃/秒。
该系统用微机控制，扩增周期的循环条件可选择或编辑，程序可储存。
该系统如有加热盖，样品管中则无需加入矿物油。
国内常见的PCR扩增仪：
由于各种PCR扩增仪的原理不同，其发热、制冷机制的方式都不尽相同。
国外产品的特点是产品的质量和性能比较稳定。
缺点是价格高，且维修麻烦。
而国内仪器的性价比较高，售后服务快捷及时。
1、9600型DNA扩增仪：
（美国应用生物系统公司产品）
最大样本数：
96孔。
温度范围：
4℃－99℃。
加热冷却速度：
平均为1℃/秒。
温度精度：
35℃－100℃间误差小于0.75℃。
特点：
具有加热盖，可防止样品蒸发，可扩增微量至5ul的反应体积，记忆容量为150个用户文件。
2、PTC-200热循环仪：
（美国MJResearch公司产品）
（1）最大样本数：
96孔。
（2）温度范围：
-5℃－105℃。
（3）加热冷却速度：
平均为3.5℃/秒。
（4）温度精度：
35℃－100℃间误差小于0.3℃。
（5）特点：
采用可调压力和高度加热盖，样品管内无需加石蜡油，三种温控选择：
模块、样本内参或电脑模拟计算。
3、GeneStar9625扩增仪:
（厦门安普利生物有限公司产品）
（1）最大样本数：
96孔。
（2）温度范围：
4℃－100℃。
（3）加热冷却速度：
平均为2℃/秒。
（4）温度精度：
35℃－100℃间误差小于0.1℃。
（5）特点：
具有加热盖，可防止样品蒸发，样品管内无需加石蜡油，全自动门，本机使用全自动智能化门，开始扩增时机门自动关闭，结束后机门自动打开，安全可靠。
本机控制软件，充分考虑到PCR技术的最新进展的需要，允许用户对扩增各步条件任意修改，实现诸如TouchDown功能等。
目前国内比较流行的实时荧光定量PCR仪则是在PCR扩增仪的基础上加入了荧光检测系统，并由微机进行实时监控，使扩增检测一体化，我们将在后面为大家详细介绍PCR实时荧光定量技术。
四、PCR产物分析：
PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。
PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。
①凝胶电泳分析：
PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。
PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预计的大小，这是起码条件。
本方法包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
②酶切分析：
根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。
③分子杂交：
分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变的有效方法。
④Southern印迹杂交：
在两引物之间另合成一条寡核苷酸链（内部寡核苷酸）标记后做探针，与PCR产物杂交。
此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。
⑤斑点杂交：
将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。
⑥核酸序列分析：
是检测PCR产物特异性的最可靠方法。
⑦PCR－ELISA法：
利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。
常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。
⑧荧光定量PCR法：
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：
荧光探针和荧光染料。
（1）荧光探针技术：
在PCR扩增原理的基础上，根据扩增对象的序列，结合两侧引物的特征，在两条引物之间设计一条与扩增对象能特异性识别的荧光探针。
探针采用双荧光标记技术，其5′端标记有报告基团（Reporter,R），3′端标记有荧光淬灭基团（Quencher,Q）。
当探针完整的条件下会产生荧光能量转移现象，即受激产生的荧光能量会被淬灭基团完全吸收，表现为报告基因受激后不能产生荧光的现象。
而若PCR扩增过程中有特异性靶基因存在，荧光探针在退火过程中与目的基因特异性结合，PCR延伸过程中，当引物延伸到探针位置时，Tag酶便以其5′端的外切酶的活性将探针酶解，从而使5′端的报告基团脱离3′端的淬灭基团的抑制，恢复了荧光特性，在无须打开扩增管的情况下，通过适当的设备检测扩增后的荧光。
该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。
（2）SYBR荧光染料：
在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
五、PCR应用注意事项：
PCR技术具有高度的特异性、选择性、灵敏性，而且快速、简便、易于自动化，因此在临床医学工作中受到广泛的重视及合理的应用。
目前在我国许多基层医疗单位均已相继开展PCR研究应用工作。
PCR技术很简单，原理也很清楚，因此有条件的单位都能较顺利地上马，但毕竟PCR技术是一种新生事物，受到许多条件因素的影响，所以要做得好也不容易。
在PCR技术应用过程中会遇到这样或那样的问题，甚至会得到与事实完成相反的结果。
1、假阳性扩增:
在实验过程中有时会碰到所检验的样本全部阳性，而且扩增产物电泳条带亮度均一，这是扩增系统受到污染时最典型的一种表现，需仔细检查，排除污染源。
试剂污染：
检测方法，可按试剂盒使用说明书将试剂分装好，直接置于PCR仪中扩增（不加阴性对照，可加适量蒸馏水），便可简单而有效地判断试剂是否已受到污染。
实验室污染：
这是最常见的污染源，由于PCR技术可以在几个小时内将模板中某些特异性序列扩增到数百万倍以上，扩增产物可能在电泳等过程中污染移液器、操作台或随着蒸发所形成气溶胶而污染整个实验室。
扩增产物又是最有效的模板，一旦出现产物污染其污染程度都较严重。
判断方法：
可以将实验中最关键步骤如试剂分装、样品处理等转移到一个新的环境中或转移到超净工作台中完成。
当然，所用移液器、吸咀管（离心管）都应彻底更换。
解决方法：
实验室污染是PCR扩增过程中最易出现的现象，而且一旦出现污染，消除污染源又极其困难，往往需对整个实验室及实验器材彻底清洗处理，所以应该以预防为主，实验过程中严格遵守实验基本要求，样品处理与扩增产物及电泳应尽量分开，最好能在两个房间进行。
扩增前处理所用的移液器及扩增后点样用的移液器应严格地分开，不可互换。
PCR室应保持良好的通风、清洁、最好能专用。
采样污染：
在实验过程中，有时会出现一批结果阳性率很高，一批结果阳性率又下降很多，如此反复，这种现象主要是由于收集样本的试管或吸管受到污染所致。
PCR扩增非常敏感，而一般实验室对重复使用的试管所进行的洗涤方法往往不能去除痕量DNA，这些痕量DNA便成为PCR模板，出现阳性扩增结果，由于采样试管受污染程度不一，所以出现忽高忽低的现象解决方法建议使用一次试管及吸咀取样。
2、假阴性扩增：
如果连续几次扩增结果都是阴性，或已知阳性样本出现阴性扩增结果，一般认为这是假阴性，出现这现象有以下几种原因：
仪器故障：
出现全阴结果，首先考虑到仪器运转是否正常。
仪器运转是否正常是PCR扩增最关键的步聚之一。
判断仪器是否正常，首先要测定加热体的温度是否准确，波动范围是否符合要求，各孔之间差异是否符合要求，PCR扩增往往对仪器加热温度及各管间的差异要求有很高的精度，如果误差太大，势必出现假阴性。
试剂失效或无效：
确定所用仪器是正常的，便可对试剂进行检测。
首先要了解试剂是否超过有效期，试存放方法是否达到要求，如果试剂盒在有效期内，贮存方法是正确，那么就应该仔细、慎重地判断试剂是否是无效试剂或称不合格试剂。
可以用已知阳性样本，或试剂盒提供的阳性对照，严格按说明书操作扩增一次，然后把扩增产物用双蒸水稀释1000倍，作为模板进行第二次扩增，判断结果，如果是阴性说明试剂无效或不合格，如果结果阳性那么可用以下方法判定试剂的灵敏度。
试剂的灵敏度：
有时试剂检测的阳性率偏低，所谓阳性率偏率就是指出现假阴性结果，这种现象往往与以下三种因素有关：
①试剂质量不过关；②操作方法不规范；③主观判断标准不科学。
对于试剂质量及操作是否正确这两点是比较容易检查并合理改进。
对试剂敏感度的评价标准应该使用下述方法科学地评价，首先选择标准样本如HBV全序列质粒，标准阳性血清，结核菌菌体等用合适的介质如血清、痰液等进行有限稀释按1：
10、1：
100、1：
1000、1：
10000如此逐步提高稀释度价其试剂的敏感度，一般认为如果标准阳性乙肝的血清用正常血清稀释10000倍以上，结核菌每毫升中在100个左右仍能测出阳性结果时，试剂的敏感度是足够的，判断试剂的灵敏度是足够的，判断试剂的灵敏度后仍需判断试剂的检测覆盖，因为病原微生物有不同的型或变异株，合格的试剂不应漏检。
最后还要判断试剂盒的异性，一般的实验室可以用不同病原体的样本按说明书操作来判断其对其它病原体扩增时是否也有阳性出现，其特异可达到怎样的精度，经过以上三个方面的研究便可以科学地判断试剂的质量。
3、扩增产物拖尾:
有时扩增产物电泳后出现一个个荧光团（Smear现象）或出现一连串的条带，这些种现象主要与以下几种因素有关：
扩增系统不完善：
这种现象表明出现非特异性扩增，而产生非特异性扩增与扩增系统中镁离子浓度、引物浓度、DNTP浓度有密切关系，需认真调整以期避免这种现象出现。
另外也可以适当提高退火温度，从而提高扩增特异性。
模板处理方法不完善：
PCR扩增技术的原理虽然非常简单，但这一技术的合理应用是极其复杂的，如对PCR主要成分之一DNA聚合酶的影响因素很多，这些因子是怎样作用于聚合酶，其作用机制至今仍不清楚，因此对样本处理不当不妥可能抑制扩增，也可能导致非特异扩增。
一般分泌物样本，应取脱落细胞为主，避免采集过多的脓性分泌物，痰液样本一定要充分液化，等等。
引物设计不合理：
引物与基因组之间的同源性是产生非特异性扩增的最主要原因，而我们一般在设计引物时往往只了解其基因组中的某一段序列，因此我们必须充分利用资料巧妙地设计出一组合理的引物，并通过反复比较、证实，最后才能确定其能否用于检测。
产物电泳单萤光带及多萤光带
一般PCR扩增后，对扩增结果的判断最简单的方法是琼脂糖电泳，溴乙淀染色，在320nm的紫外激发观察其萤光条带，如果有明显和特异性扩增产物，就会在电泳平板预期的位置出现一条清晰的萤光亮带，按标准扩增系统配制的反应液，其引物浓度在0.1－0.5mM，一般经30个循环扩增后，仍有相当数量的游离引物存在，因此在电泳平板就有一条20BP左右（电泳速度较快）的淡淡的引物萤光带，这样每次电泳结果就有两条荥光带，一条在前面的，每个点样样本都有的引物带。
病原体变异，与前面所述一样，我们为得高敏感性经常使用具有重复序列的基因作为引物设计的区段，在有些病原体，比如结核杆菌在治病过程中，会发生严重畸变，也包括其遗传物质的变化，出现染色体的缺失、不等位交换、其它序列的插入等。
如果这些缺失与不等位交换正好发生在我们所选择的扩增序列上，也会出现不同长度的扩增产物，从而产生多条扩增产物带。
PCR基因扩增技术简单易行，应用日趋广泛，但其影响因素很多，在实践过程中时常现现这样或那样的问题，甚至得不到预期的结果，或出现无法解释的现象。
诚然，近年来在大量科学工作者的共同努力下，取得了许多宝贵的经验，使这一技术日趋完善，毕竟PCR是一项近几年才出现的新技术，许多问题至今仍然不能得到很好地解释或解决。
想信随着对PCR的深入研究，在PCR的应用过程中不断总结经验，PCR这一新技术将会为人类的发展作出更大的贡献。
六、PCR模板制备
核酸模板是PCR扩增最重要的成份之一，PCR扩增技术对其模板DNA（RNA）的质量及数量要求不高，常规分子生物学方法对DNA及RNA的制备与纯化都足以达到要求。
在目前临床PCR工作实践中样本大都有一个共同的特点就是微量，因此结合这一实际情况，及PCR扩增系统的特性，我们简单介绍几种临床常见标本的简化处理方法，可以在保证结果的前提下，省去许多繁琐的操作，相当实用。
一、白细胞（WBC）：
对巨细胞病毒（HCMV），免疫缺陷病毒（HIV），等病原微生物的检测，常需提取白细胞中病毒的模板，其处理方法如下：
⑴取200UL含50UL5％EDTA的抗凝血于0.5ml离心管中，1万转/分离心1分钟去上清。
⑵沉淀加入500UL25mMTrisPH7.6、0.5％TritonX-100，1.5万转/分离心1分钟去上清，重复本步聚一次。
⑶于沉淀中加入50UL样品处理液（厦门安普利生物工程有限公司提供），96℃加热10分钟。
⑷1.5万转/分离心10分钟，取上清10UL进行PCR扩增（扩增终体积为30UL）。
二、血清：
对乙肝（HBV），等病原微生物的检测，需要对血清样本进行处理，提取病原体模板。
⑴取100UL血清，加入50UL样品处理液混合。
⑵96℃加热10分钟。
⑶1.5万转/分离心10分钟，取上清10UL进行PCR扩增。
三、痰液：
对结核杆菌（M.TB）等呼吸道感染病原微生物的检测需要取痰液样本。
⑴痰液的液化，取晨起血丝痰或带干酷颗粒的痰样本约1ML，加入等量1NNaOH溶液，充分摇匀室温10-20分钟，若痰液浓稠时，可以适当增加1NNaOH溶液用量并延长时间或37℃水浴20分钟，使痰液充分液化。
⑵取中层液化良好的痰液1ml，1.5万转/分离心15分钟，去上清。
⑶1ml生理盐水或双蒸水将沉淀吹打混悬，充分摇匀，1.5万转/分离心15分钟，去上清。
⑷沉淀加入50UL样品处理液吹打混匀置96℃加热10分钟。
⑸1.5万转/分离心10分钟，取上
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