杀菌率试验规程.docx
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杀菌率试验规程
Q/KM
ZJ—
2008
液体洗涤剂杀菌试验规程
（内部使用）
2008
年月日内部执行
质量管理中心实验室
引用标准
1、GB15979-2002一次性使用卫生用品卫生标准
2、QB/T2738-2005日化产品抗菌抑菌效果的评价方法
3、QB/T2850-2007抗菌抑菌型洗涤剂
4、2002年版《消毒技术规范》（中华人民共和国卫生部）
5、2001年版《药品微生物学检验手册》（科技出版社）
杀菌率试验规程
1、试验菌、试验温度、作用时间、试液浓度试验菌种：
金黄色葡萄球菌（ATCC653）8，大肠杆菌（8099或ATCC2592）2，白色念珠菌。
试验温度：
20C±1°C。
作用时间：
最短不得小于30s。
常规作用时间为2min、5min、10min、20min。
试液浓度：
中和剂鉴定用试液浓度应为正式杀菌试验最高浓度。
菌悬液用量：
正式杀菌试验用菌悬液的浓度、取量应与中和剂鉴定中1组、2组所用菌悬液的浓度、取量相同。
2、细菌繁殖体悬液、菌片的制备程序：
2.1菌悬液的制备
⑴取冻干菌种管，在无菌操作下，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吸吹数次，使菌种融化分散。
取含5.0ml-10.0ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置
型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37C培养18h〜24h,即为第3代培养物（放在4C左右冰箱中保藏
每隔2-3个月移种一次，继续保藏。
）。
18h〜24h培养），用5.0ml吸管吸取
⑵取第3代〜14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（经
37C培养18h〜24h（或适宜时间）。
作为原菌液。
（源于《药
3.0ml-5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。
随后，用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中，在手掌上振敲80次（力度适中，勿溅出），以使细菌悬液均匀。
或从新鲜菌种斜面沾取少量菌苔，接种在适合试验菌生长的培养基中，
品微生物学检验手册》211页）
⑶细菌繁殖体悬液应保存在4C冰箱备用。
尽量减少在室温下放置时间，以减少细菌的自然死亡。
应当
天使用不得过夜。
44
回收菌数为1X10〜9X10cfu/ml用PBS液配置GB15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》
回收菌数为1X108—5X108cfu/ml用TSB营养肉汤配置一2002《消毒技术规范》
2.2、菌片的制备程序：
《消毒技术规范》
⑴取冻干菌种管，在无菌操作下，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吸吹数次，使菌种融化分散。
取含5.0ml-10.0ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37C培养18h〜24h。
用接种环取第1
代培养的菌悬液，划线于营养琼脂培养基平板上，于37C培养18h〜24h。
挑取上述第2代培养物中典
型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37C培养18h〜24h,即为第3代培养物。
⑵取第3代〜14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（经18h〜24h培养），用5.0ml吸管吸取
3.0ml-5.0mlTSB营养肉汤加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。
随后，用5.0ml吸管将洗液移至另一
无菌试管中，在手掌上振敲80次，以使细菌悬液均匀，含菌量1X108—5xi08cfu/ml。
⑶用无菌镊子夹住已灭菌10mm*10mm纸一角，一面朝上，注入10ul菌悬液，放到无菌平板内，37C温箱中干燥20min-30min，（或在室温自然阴干后使用）制成菌片。
每个菌片回收菌落，按活菌培养计数所得结果，应为5X105—5X106cfu/片。
）
⑷细菌繁殖体悬液和菌片，用毕应随时保存在4C冰箱内。
尽量减少在室温下放置时间，以减少细菌的
自然死亡。
（应当天使用不得过夜。
）
3、操作程序
3.1、悬液定量法杀菌试验操作程序
⑴、样品用无菌标准硬水稀释至同中和剂鉴定用试液浓度，或低于中和剂鉴定用试液浓度，制成（稀释液）
试验样液。
⑵、将试管按需要数量分别排列于试管架上，各组由左向右，排序、标记。
44
⑶、配制菌悬液，浓度为1X10〜9X10cfu/ml—GB15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》或1
88
X10—5X10cfu/ml—2002《消毒技术规范》
⑷、取杀菌试验用无菌大试管，先加入0.5ml试验用菌悬液，再加入0.5ml有机干扰物质，混匀，置20±C5min，用无菌吸管吸取步骤1中的试验样液4.0ml注入其中，立即开启计时器，并迅速混匀
（在手掌上振摇80次）。
-见《消毒技术规范》或吸取试验用菌悬液0.1ml，加入
到含5ml样液的试管中，立即开启计时器，并迅速混匀（在手掌上振摇80次）。
-见QB/T2738-2005
⑸、作用2min、5min、10min、20min,即刻用无菌吸管吸取0.5ml移入鉴定合格的4.5ml中和剂溶液中
（中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同）充分混匀，中和作用10min后，取样液、10
倍系列稀释液0.5ml（见GB15979-200）2或分别吸取1.0ml（-见《消毒技术规范》）
（见图四），置于2个灭菌平皿，用凉至40〜45C营养琼脂培养基或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15ml作
倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，35C±2C培养48h（细菌）或（酵母菌）
25C±2C培养72h,作活菌菌落计数。
⑹、同时用稀释液代替样液进行平行试验，作为阳性对照管。
⑺、阴性对照组：
分别吸取试验用相关溶液和培养基进行培养，观察有无污染。
⑻、计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。
以菌落数在15cfu〜300cfu的平板为准，每
个稀释度3个平板生长菌落数全部合乎上述标准，则以该3个平板的菌落平均值作为结果；若有2个符合合乎上述标准，则以该合格的2个平板菌落的平均值作为结果。
⑼、试验重复3次，求其平均值。
根据各组活菌浓度（cfu/ml），计算杀菌率，见计算公式1。
或根据各组活菌浓度换算为对数值（N）,计算杀灭对数值，见计算公式2。
3.2载体法杀菌试验操作程序
⑴、试验样品用无菌标准硬水（过滤除菌）稀释至规定浓度，制成（稀释液）试验样液。
⑵、吸取样液5.0ml放入灭菌平皿，另吸取PBS5.0ml注入平皿中，作为阳性对照皿。
每皿用无菌镊子夹住菌片一角放入试样皿和阳性对照皿。
（3）、作用至设定时间后，即刻用无菌镊子夹住菌片一角，投入含5.0ml中和剂的试管中（中和剂的浓
度与容量应与鉴定试验结果规定的相同）充分混匀计时。
（见图三）
⑷、中和10min后，取样液或10倍系列稀释液1.0ml（（见图四），置于两个灭菌平皿，接种凉至40〜
45C营养琼脂培养基或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15ml，转动平皿10-20下，使其充分均匀，凝固
后，于35C±2C培养48h（细菌）或72h（酵母菌），作活菌菌落计数。
⑸、试验重复3次，求其平均值。
⑹、阴性对照组：
分别吸取试验用相关溶液和培养基进行培养，观察有无污染。
APBC液（0.03mol/L磷酸盐缓冲液）、
B、无菌标准硬水1ml置于灭菌平皿内、
C、空白平皿，倾注营养琼脂培养基（细菌）或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15ml培养。
⑺、计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。
以菌落数在15cfu〜300cfu的平板为准，每个稀释度3个平板生长菌落数全部合乎上述标准，则以该3个平板的菌落平均值作为结果；若有2个符合合乎上述标准，则以该合格的2个平板菌落的平均值作为结果。
4、计算公式
1、杀菌率X1=（A-B）/A
X100%式中：
X—杀菌率（%；
A--对照样品平均菌落数；
B--被试样品平均菌落数。
2、杀灭对数值（KL）=对照组平均活菌浓度的对数值（Nc）—试验组活菌浓度的对数值（N＞）
备注：
计算杀灭对数值时，取小数点后两位值，可以进行数字修约。
如果消毒试验组消毒处理后平
均生产菌落数，小于等于1时，即大于等于试验前对照组平均活菌浓度的对数值。
5、评价标准
杀菌率》90%,产品有杀菌作用。
悬液定量杀灭试验中，各次的杀灭对数
值》5.00，可判定为消毒合格。
6、操作要点：
（消毒技术规范2002版）
1、对接触消毒剂（杀菌剂）的样本，在达到规定作用时间，即刻取样移入鉴定合格的中和剂
溶液中（中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同）；
2、即刻混匀，并按规定时间吸取样液进行随后的培养检测；
3、在将样本接种培养基以前的操作，应按规定时间内进行，以免微生物与中和剂或中和产物接触过久。
审核编制
中和剂悬液定量鉴定试验操作程序
引用标准：
QB/T2738-2005日化产品抗菌抑菌效果的评价方法（试验菌悬液在1X104—9齐104cfu/ml）
4—9x104GB15979-2002一次性使用卫生用品卫生标准（试验菌悬液在〃门1X10cfu/ml）
—5沟0
2002消毒技术规范（试验菌悬液在1X10cfu/ml）
一、定义和术语
中和剂一在微生物杀灭试验中，试验微生物与杀菌剂作用达到规定时间的终点时，用以中和残留的杀菌剂，使其不在持续抑制和杀灭微生物的试剂。
中和产物一中和剂加杀菌剂（样品）=9:
1，作用10min配置而成。
一、中和剂鉴定试验原理
中和剂鉴定试验原理
试验分组
第1组
第2组
第3组
第4组
第5组
第6组
杀禾剂十禾液
（杀菌剂十
屮和剂十禾液
（杀菌剂十
阳性困数对照
阴性对照。
「培养
菌液）十中
T培养
中和剂）十
t培养
t培养
观察杀菌剂对
观察残留杀菌
观察中和剂是
观察中和产
阳性对照组。
阴性对照组。
试验菌有无杀
剂被中和后,
否抑禾。
物，或未被兀
灭或抑制能力
受到杀菌剂作
全中和的残留
试验目的
用后的试验菌
杀菌剂对试验
是否能恢复生
菌的生长繁殖
长。
是否有影响。
三、中和剂鉴定试验中易出现的问题及解决方法
出现的问题
解决方法
1
'①、②组无菌生长或②组平板上少于5■■个
菌
落，其它组正常。
降低消毒剂浓度或缩短作用时间。
2
①②菌落数较多且数量基本相冋，其它组正常。
提高消毒剂浓度或延长作用时间。
3
③组中和剂菌落数明显少于PBS组菌数
降低中和剂浓度或改变中和剂成分。
4
④组（中和产物）菌落数明显少于PBS组菌数，其它组正常。
提高中和剂浓度或改变中和剂成分。
5
多次更换中和剂均不能得到满意结果。
选用载体法进行中和剂鉴定，杀菌试验同时用载体法进行。
四、1鉴定试验操作程序
取试验样品
40ml加入
取45ml中
取49ml
取45mlPBS
各
对应组
和
剂加入对
应组
中
和产物b加入对应
（稀释液）加
组
入对应
20C±1°C恒温
5min
菌悬液
1.0ml
菌悬液
1.0ml
「」
0.1ml菌悬液
+0.4ml硬
^组
0.1ml菌
悬
液
0.1ml菌悬液
+0.4ml硬水
'混匀.
振敲80次，
作用至试验预定时间，
水混匀
作用10min,
混匀
取0.5ml力卩
组
入下列对应
中和剂.
取0.5m
rH壬□文［
nl加入下列各:
.i~~r壬□亠F乩
对应组
PBS
4.5ml
中和剂
4.5ml
'丨VH丿2'丨VH丿可PDO
4.5ml4.5ml4.5ml
振敲80次、
混
匀
取适宜稀释度悬
/
本）
作用10min
活菌培养计
活菌培养计
/
用中和剂
用中和产物
'倍系列稀释
液1.0ml接种平数数110倍系列稀
0
板（2个/样
《消毒技术规范》
I和剂悬液定量鉴定试验操作程序
用稀释液
10倍系列稀释
PBSr中和
剂
各1.0ml
接种平
板
中和剂鉴定评
价规定
第1组不长
菌或明显少
于第2组
第2组菌
数
大于5且明
显少于第3、
4、5组
中和剂鉴疋合
n
C
>5
格标准中对1、
X（1-10）
>（X+5）
2组菌数要求。
Y（>10）
>1.5
第3、4、5组菌数相似，
误差率＜15%
第6组无
菌
生长
三组间平均菌数=（第3+4+5组菌数）-3;
误
差率%=（三组平均菌数-各组菌落平均数）
的绝对值之和/3＞三组间平均菌数X100
结论
备注
符合上述评价的中和剂表明可消除试验样品对指示菌的作用，中和剂与试验样品的中和产物对指示菌无毒害，鉴定为该试验样品的中和剂。
a菌悬液浓度及制备：
消毒技术规范用PBS（试验菌悬液在1X107—5X107
b中和产物的配置：
先将试验样液IrGml―与中和剂溶液9ml混合，作用10min后制成
四、2鉴定试验操作程序
|和剂鉴定试验操作程序
-载体法
试验分组
用无菌镊子取
菌片加入下列
对应组
吸取试验
样品
于无菌平
吸取试验样品
5.0ml于无菌平
皿内
吸取中和剂
5.0ml于无菌
平皿内
吸取中和产
物5.0ml
无菌平皿内
吸取PBS
5.0ml于无
—
菌
、
、
皿内
试管振打
80次
镊子取出菌
PBS
片移入对应组
中和剂
中和剂
中和产物
稀释液
5.0ml
5.0ml
5.0ml
5.0ml
5.0ml
作用10min
作用10min
/
取原液或稀释
用稀释液
用稀释液10
用中和剂
用中和产物
用稀释液10
稀释液+
倍
10
液1.0ml
接种
10倍系列
系列稀释
倍系列稀释
10倍系列稀
倍系列稀释
中和剂
平板（2
.样
个/
稀释
释
各1.0ml
混匀作用10min，立即用无菌镊子取出菌片移入对应组
接种平板
本）
作用至预定时间，立即用无菌
即刻混匀，并按规定时间接种培养基
操作要点
中和剂鉴定评价
评价规定
第1组不
长菌或明
显少于第
2
组
第2组有且较第
1组为多，较第
3、4、5组为
少的菌数生长，
并
第3、4、5组菌数相似，且其误差率<15%
三组间平均菌数=（第3+4+5组菌数）弋
误差率%=（三组平均菌数-各组菌落平均
数）的绝对值之和/3>三组间平均菌数X
第6组无
菌生长
中和剂鉴定合格标准中对1、
符合下表要求。
0
>5
X（1-10）
>（X+5）
2^组困要求、。
结论
丫（>10）>1.5丫100
符合上述评价的中和剂表明可消除试验样品对指示菌的作用，中和剂与试验样品的中
备注
和产物对指示菌无毒害，鉴定为该试验样品的中和剂。
a菌悬液浓度及制备：
用PBS#指示菌制成1X10〜9X10cfu/ml悬液。
（-GB15979）
消毒技术规范用PBS（试验菌悬液在1X107—5X07
「四3鉴定试验操作程
中和剂悬液定量鉴定试验操作程序-《GB/T15979》
试验分组
第1组
第2组
第3组
‘第4组
第5组
第6
取0.10ml菌悬
液,分别加入
各
取试验样品5.0ml加入各
对应组
取5.0ml中和
剂加入对
应
取5.0ml中
和产物b加入对应组
取5.0mlPBS
（稀释液）加
入对应组
组_
组
振敲80次，
混匀
作用至试验预定时间，
取0.5ml加入下列对应
组
作用10min,
取0.5ml加入下列各对应组
组
PBS
中和剂
中和剂
中和产物
PBS
振敲80次、
4.5ml
/
4.5ml
作用10min
4.5ml4.5ml4.5ml
/
混
匀
取适宜稀释度悬
液1.0ml接种
活菌培养计
数
活菌培养计
数
用中和剂10
~倍系列■稀释
用中和产物
10倍系列——
用稀释液
10
PBS-中和剂
各1.0ml接1
a菌悬液浓度及制备：
用PBS将指示菌制成1X104〜9X104cfu/ml悬液。
（-GB15979）
备注消毒技术规范用PBS（试验菌悬液在1X107—5X107
b屮和产物的配置：
先将试验样液TTCml~与屮和剂溶液9ml混合，作用10min后制成
平板（2个/稀释倍系列稀释种平板
样本）
中和剂鉴定评
价规定
中和剂鉴定合格标准中对1、
2组菌数要求。
第1组不长
菌或明显少
于第2组
第2组菌
数
大于5且明
显少于第3、
4、5组
n
C
X（1-10）
>5
>（X+5）
Y（>10）
>1.5
第3、4、5组菌数相似，
误差率＜15%
三组间平均菌数=（第3+4+5组菌数）
差率%=（三组平均菌数-各组菌落平均数）
的绝对值之和/3＞三组间平均菌数X100
第6组无菌
生长
符合上述评价的中和剂表明可消除试验样品对指示菌的作用，中和剂与试验样品的中
结论
和产物对指示菌无毒害，鉴定为该试验样品的中和剂。
备注
a菌悬液浓度及制备：
用PBS将指示菌制成1X104〜9X104cfu/ml悬液。
（-GB15979）
b中和产物的配置：
先将试验样液―与中和剂溶液9ml混合，作用10min后制成
七、消毒剂的常用中和剂的配置
1、用于氯型杀菌剂（有效氯0.1-0.5%）:
硫代硫酸钠
2、用于非氧化型杀菌剂：
a：
磷酸二氢钾1.36g、磷酸氢二钠2.83g、卵磷脂10.0g、甘氨酸10.0g、吐温-8030.0g
蒸馏水
1000ml
b:
磷酸二氢钾1.36g、磷酸氢二钠2.83g、卵磷脂3.0g、吐温-8020.0g、蒸馏水
1000ml3、用于氧型杀菌剂：
吐温-8020.0g、硫代硫酸钠
10.0g、PBS100、m
4、阳离子胍类消毒剂：
卵磷脂3.0%吐温-803.0%的PBS溶液
5、季胺盐类消毒剂（0.1-0.5%）:
吐温-80+卵磷脂（1.0-2.0%）
6、酚类（DP-300）消毒剂（3.0-5.0%）:
吐温-80（0.5-3.0%）
7、复方消毒剂：
吐温-80+卵磷脂+硫代硫酸钠
&过氧乙酸（0.1-0.5%）:
硫代硫酸钠（0.1-1.0%））
9、过氧化氢（1.0-3.0%）:
硫代硫酸钠（0.5-1.0%））
八、附悬液定量杀菌试验示意图、载体法试验杀菌率示意图
审核:
编制：
质量管理中心谷爱军
细菌悬液+有机干扰物质=1:
1
图一、
置20±°C5min后
图二、
1ml
阳性对照管
注入样液4ml
O注入稀释液4.0ml
作用至各预定时间后
经灭菌的中和剂中，
吸取0.5ml混合液加入
4.5ml
1ml
1ml
1ml
1ml
10
-1
10
10
10
10
10
悬液定量杀菌试验示意图
《消毒技术规范》
细菌悬液
图一、
吸取样品稀释液放入一菌片
取10ul滴在
（回收菌数为
10mm0mi无菌滤纸上，干燥、制成菌片
〉44
叨05〜9X106cfu/片-GB/T15979）
5X10—5X10‘
cfu/片一消毒技术规范）
吸取PBS5ml作为阳性对照管放入一菌片
作用至设定时间后，即刻用无菌镊子夹住菌片，投入各含
5.0ml*中和剂的对应管中
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