幽门螺杆菌的毒力基因vacA基因亚型与上消化道疾病关系的研.docx

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幽门螺杆菌的毒力基因vacA基因亚型与上消化道疾病关系的研

中华医院感染学杂志2007年第17游第12期

・1491・

・论著・

幽门螺杆菌的毒力基因、vacA基因亚型与

上消化道疾病关系的研究

曹群奋1,CHENGJF。

,车海斌1,婊勇华1,马海峰1,虞霸辉3,露有名。

(1.宁渡市镇海龙赛医院,渐江宁波315200;2.Sound

Shore

MedicalCenterofWestchester・NY10802

3,浙江大学联学院附属第一医院,浙江抗州310003)

摘氍:

目韵研究镇海地区幽门螺杆菌(Hp)尿素酶基翻(ureA)、细胞毒素相关基嗣(eagA)、空泡细胞毒素墓网(vaeA)及vaeA毖困弧型与上消化道疾病之间的关系。

宵法用普通聚合酶链反应(PCR)技术。

测定84株从。

E漕纯遘疾癍患者翳窦黏膜中分离获得鲍Hp辩ureA毖圜、eagA基嚣、vaeA基嚣、vaeA基疆亚裂。

结果

84撩

Hp中,ureA、cagA、vacA基瑚豹雨性率分躺为100。

00%、90.48%、95.24必,cagA、vacA在胃炎、满亿性溃疡的帑性率高于胃癌(P<0.05);vaeAm2基因的阳性率为79.76%,明冠高于vacAmla(20+24蹦)、vaeAmlh(8.33%)及vaeAmlbin2(4.76“),vaeAm2在胃王琏、消化性溃疡的阳性率高于胃癌(P<O.05),其余3个藏冈亚型阳性举嫠异姆盂缓}}掌露义(琏P>O+05)。

鎏稳镇海遣区Hp辍美蛙上溜诧遵疾癍惠卷惑囊Hp激ureA鞭性、cagA阳性、vacAm2溉型占优势,赶均在消化性溃疡及胃炎中柏检出宰更高。

关键词:

幽门蠓杆菌;基因分型;胃卜二指肠疾病

中黼分类号:

R378,99

文黻标识码:

文章编号:

l005—4529(2007)12—1491-05

RelationshipamongToxicityGeneType,vaeAGene

SubtypesofHpandHp-relatedUpperGastrointestinalDiseases

eAoFen-qun。

,CHENGJF,C壬{EHai—bin,CHENYong-hua,

MAHai—feng,YUZhaohut。

LIYouming

(*ZhenhaiLongsaiHospital,Ningbo,Zhdtang315200,China)

Abstract:

OBJECTIVETo

aSSeSS

the

relationshipamongthe

genes

typesureA,eagA,vacA,genevacAsubtypes

andHelicobacterpylori(Hp)一relateduppergastrointestinaldiseasesinthisstudy+METHODSEightyfourHp

strainswerevaeA+and

identifiedfrombacteriaisolatedandculturedfromthegastricmucosatissue.GeBesureA.tagA,

vacAsubtypes

gene

gF£ye

gene

typedusingPCR

withspecificprimers。

RESULTSIn84identifiedHpstrai&s,

cagAwas

cancer

thepositiveratioofpositiveratiopositiveratio

ureAwRs100.00弼,of

gene

90。

48妊}and。

fgenevaeAwas95

thaniagastritisandpeptic

24强,The

of

geneseagA

andvacAwasloweringastriculcer(P<0.OS),the

ofvaeAm2was79。

76%,significantlyhigherthanvacAmla(90.Z4蹦),vaeAmth(8.33%)aM

vaeAmlbmg(4.76嚣),Thepositiveratioof

vacAm2ms

significantlyloweringastriccancer,andwithsignificant

not

differenceingastritisandpepticulcer(P<005):

theotherthreesubtypeswere

gastric

significantlydifferentinthe

are

diseases(P>0.05).CONCLUSIONSure+,eagA+andvacAm2subtypesofHp

uppergastrointestinal

diseasesin

Zhenhai

predominantin

are

patientswithDistrict,Ningbo,ZhejiangProvince.They

more

co.mortinpatientswithgastriculcerandgastritis,

Key

words:

Hellcobacterpriori;Moleculartyping;Gastrointestinaldiseases

1983年澳太剥豫学者Warren和Marshall首次放入鬻黏摸组织币发现和分离培养到幽f1螺杆菌(Hp),从此开始了众多有关幽门螺杆菌的实验研究和临床滩察,目前国际医学界融公认,幽门螺杆菌是

收稿日期:

2007—06-09{修回日期:

2007—08—15基金项且;浙江省医药卫生科学研究基金(20068121)

慢性胃炎、潢诧性溃疡龅最主要巍羁,是胃癌帮霉淋巴癌发生麴重要因素之一n]。

龋门螺秆菡照酱翦世界上最常见的细菌感染,中国不同地区的人群中,Hp的感染率>50.oO蹦o]。

但融赢研究表明,不是辑寿器Hp感染都会发病,整筏步数感染者接理不同程度的临床症状,而有些消化道疾病并未感染Hp,提示不同Hp基因型与疾病结局有关。

本研究

万方数据 

・1d92・

调查宁波镇海地区Hp的主鼙毒力基因urea、ca—gA、vacA基因型的分布,并对不同基因型别与上消化道疾病关系进行研究。

1材料与方法

1.1实验用茵株取自2005年12月1日一2006年io嚣l毽燕受奄予霉镜硷蠢瓣瞳渗殛娆靛的嚣、十二指肠疾病患者,经内镜检蠢确诊胃、t’=指肠溃疡、胃炎投胃癌共146例,其中男9l例,女s5例。

稼本取鑫距喹门2cm霉窦枣蛮缀织2块。

霉嚣貘标本经i=£增菌接种子Hp分离培养基,在徽需氧环境(Oz5%、COz10蹦、Nz85%),于恒温培养箱37℃壤嚣3~7d。

撼取可疑鼓落涂片镜捻,并对菌株经尿索酶试验、融酶试验、氧佗蒋试验藕辇兰染色显微镜下形态学检旋鉴定后置予Hp冷冻保存液中--80℃保存。

共采集菌株84株,其中59株消化性溃疡,18绦霉炎、?

橼髯瘗。

1.2

Hp基因的制静采用PromegGenomeDNA

ExtractionKit,提取HP基因组DNA。

gl辫辣最赞及务成首先鼓Genl3ank上蕉我到

Hp全序判及cagA、vacA及urea3个基因序列,然后钟对vacA基因设诗了嚣分囊型m2、rata、mlb和司合成,PCR扩增威应总体积504。

包括dTNPs

(2

nmlol/L)4#l、10×PCR缓冲液5出、Taq黼0,54

(2u/{A)、DNA模板1.0“l、;l秘1.0正、无豫去离子求35.5一。

PCR反应条件:

94℃预变性5min,后94℃s,55℃退火lmin,72口c延伸lrain共35个循ne廷释5min。

{l穆窍舞觅表1。

表l

Hp基因分础引物;l秘名嚣

}|秘痔剜(57啼3’)

片怒度

cagA

正向:

ACCCTAGTCGGTAATGGG300

反向:

GCAATTTTGTTAATcc(;GTcvacA正}u】;ATGGAAATAcAACAAACAcAC

259/289

覆疑:

CTGCT%AATGeG∞AAAC

L.reA

正向:

GCCAATGGTAAATTAGTTCC411

反向;CTCCTTAATTGTTrrTAcATm2』下向:

G(;AG()cCCAGGAAACATTG

352

爱彝:

cA姒AeTAo墨X)e孵GCAC

rn]&

正南:

GGTCAAAATGCGGTTeATGGZ90

反向:

CCATTGGTACCTGTAGAAACmlb正向:

GGOCCCAATGcAGTCATGGAT

240~270

反巍二GcT6r㈨TGoCTAAAGAACx?

AT

m!

bmZ

芷盎:

GGOCCeAATGe矗f;㈨矗TGG矗T

250

反向:

CATAACTAGcGCCTTGCAC

万 

方数据Chin

JNosocomlolV01.17No。

122007

1.4

PCR扩增产转凝胶电泳PCR产穆经2%琼

脂糖凝胶电泳,以50bp标志物为参照,在凝胶分析系统中观察电泳结果并摄像。

1。

s涮蓐验证h述扩增产物震wiz&rd

PCR

Preps

DNA

Purification

System纯化后,连接到

Pgem—T栽体上,并转化至JMl09大肠埃希菌,37℃壤葵过夜,熬致攀个萤落,酸ET7露SP6;|物进行PCR筛选挑取阳性克隆,送大连宝生物有限公司测序验证。

1。

统计学是理勰组数据魄较j{iy2捻验,

P<0.05海差异有统计学意义。

2结果

2.1基驾表这Hp的ure基圜、cagA基闲、vacA基因及vacA基因亚测表达,镇海地区培养黢定的84例Hp髓抹中,ureA基因的阳性率为100.00%,cagA萋戮的弼性辜为§o,48%,vacA基嚣麴粥往率为95.24%。

部分样本DNA的PCR扩增结果见

图1、2、3,

圈1部分样率/li,eA基嗣妻'增结果电泳圈

霪2部分祥零。

agA基翅扩增络果龟渡銎

鼙3部分撵奉wcA幕丽扩螬结果电泳霞

eagA、vacAm2亚型

在霉炎、瀵纯牲溃疡静耀牲率比较差异无统}}学意义(P>o.05),cagA、vaeA其他3个亚型在辫炎、消

化性溃疡的阳性率比较差异嗡统计学意义(均

1,3

依据引物设计原则,参考其他文献01设计引物。

另外,mlbm2的引物。

全部;f裼由宝生物(大连)2K程有限公变性45量i=,最基722.2不同基因型之间的关系

中华医院感染学杂志2007年第17卷第12期

P<0.05),cagA与vacAm2、vacAmla亚型在胃癌

的阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05),cagA与vacAmlb、vacAmlbm2在胃癌中的阳性率比较差异有统计学意义(均P<0.05)。

vacAm2亚型在胃炎、消化性溃疡的阳性率较高(77.8%,86.4%),与cagA(83.3%,96.6%)比较差异元统计学意义(P>O.05)。

vacA其他3个基因亚型在胃炎、消化性溃疡的阳性率均较低,与cagA比较差异有统计学意义(均P<0.05)。

cagA(57.1%)与vacAm2(28.6%)、vacAmla亚删(14.3%)在胃癌的阳性率比较差异无统计学意义(P>0,05)。

cagA与vacAmlb(0)、vacAmlbin2(0)在胃癌中的阳性率比较差异有统计学意义(均P<0.05)。

部分样本DNA的PCR扩增结果见图4。

图4部分样本vacAm2、vacAmla、vacAmlb和

vacAmlbm2

4个基幽扩增结果电泳图

2.3不同基因型别与上消化道疾病的关系

比较

分析各基因组Hp在各疾病组间阳性率为cagA、vacA在胃炎、消化性溃疡的阳性率高于胃癌(P<O.05);vacAm2基凼的阳性率为79.76%;vacAmla基因为20.24%;vacAmlb基因为8.33%;

vacAmlbm24.76%;vacAm2在胃炎、消化性溃疡

的阳性率高于胃癌(P<o.05),其余3个基因亚型阳性率差异均无统计学意义(均P>0.05)。

不同疾病组HP各基因型分布见表2。

2.4

Hp基因型测序验证结果经过BI。

AST同源

分析,PCR鉴定基因型结果与测序结果一致。

PCR产物测序结果见图5。

万 

方数据表2不同疾病组Hp各基因型分布(例数)

3讨论

Hp基因型与上消化道疾病之间的关系是目前国内外研究的热点。

一些研究发现Hp不同cagA、vacA基因型在溃疡、胃癌中的发生率不同。

代敏等“3通过RAPD(随机扩增的多态性DNA)法对50株Hp进行基因分型,结果发现呈现不同的基因图谱,经聚类分析分为3个基因型别,结果T型在非溃疡患者中较多,Ⅲ型在溃疡病患者中较多,2组差异有统计学意义;代敏等又通过聚合酶链反应一限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)对2个基因型别综合分析表明Ⅳ型与溃疡有关,由此说明不同基因型别的Hp与不同疾病有关。

Hp的毒力与鞭毛、尿素酶、细胞毒素以及黏附蛋白等的各种蛋白的合成与分泌有关。

本研究Hp尿素酶基因为100.00%,Hp能产生大量尿素酶,其产量占整个细菌蛋白的6.00%,这种酶水解尿素为氨气及二氧化碳,改变胃黏膜局部pH值,使细菌更易生长;还能增强H+反流,刺激胃泌素产生,进一步损伤胃黏膜;Hp在体外对酸非常敏感。

因此尿素酶对Hp在胃黏膜下层的定植非常重要,同时它也是造成胃黏膜损伤导致疾病的

重要因素“J。

细胞空泡毒素(vacA)是幽门螺杆菌最重要的毒力因子之一,所有的Hp菌株均含有vacA基因,

但只有50.OO%的Hp表达有空泡毒性的vacA蛋白E6]。

vacA基因全长3

846

bp,编码1287个氨基

酸。

vacA基因由信号区(s)、中间区(m)组成的嵌合体。

vacAS区有4种等位基因:

sla、slb、sic、s2’rrl区有3种等位基因:

ml、m2a、和m2b。

sl/ml菌株空泡毒素活性最强,s2/m2菌株未发现有空泡毒素活性,而sl/m2型菌株的空泡毒素活性介于两者之间,因此,空泡毒素表达与不同基因亚型有关。

vacA基因型的分布有明显的地区性差异口一。

东欧和北欧以sla型为主,而北美及法意等国以sla和slb为主,中南美则以slb为主。

ml型主要分布在

中南、美和日本,而m2型常见于中国和我国台湾地

Cbin

JNO¥OCOmiOlVo[.17No,122007

m,““∞叮目矗㈧■760^:

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图5

Hp基因璎测序结果

锄删黜蝴熵撇徽慨№溅蕊溅抵黜黼i黻黼’毓

区。

日本地区的vacA则以sla/ml型为主。

本研究所捡溺翦84秘Hp撵照中,vacA基因的粥瞧率9§。

24粥,其中vacAm2麓毽静疆往率为?

9。

s籁,vacAmla基因的阳性率为20.24%,vacAmlb熬因型占8.33%,vacAmlbm2基因型占4.76%(4/'84)。

比较分析各基因亚型Hp在各疾病组问存在的差别,vacA基因不能作为本地区患者感染的Hp的毒力强弱的指标。

cagA、vacA在胃炎、消化性溃糖静戮犍率蹇手霉瘗(P<0.05)}基嚣帑蛙辜分裂淹:

VaCAm2鸯79.76%,vacAmla隽20.24%,vacAmlb

90.oo%~100.00%,与疾病并不相关。

中国的许多研究也发理cagA鞠性蓉撩在大群孛瓣流行频率菲常离,奉研究涟实,游江遗嚣Hp分瓷撩中,cagA基因的阳性率>90.00%。

提示cagA器因不能作为本地区Hp毒力强弱的指标。

由于cagA基因存在等位基因的变异,上述情况表明,在中国和欧美国家可能存在不同的蒎因型,对本地区HpcagA基因进行进一步分型可熬籀汞亚型与疾病的关系。

参考文藏;

[1]徐平如。

曼难韩,李俊达,等.幽门螺杆蘸临床分离株耐药性

研究[J]中华脏院感染学杂志,2003.13(5)1

495—496

麓因为8.33%,vacAmlbm2为4.76%,vacAm2在胃炎、消化性溃疡的阳性率高于胃癌(P<o.05),其余3个基因亚型阳性章燕异均无统计学意义(均P>0.05),上述结果提承镇海地区Hp以cagA、vacAm2为优势,且在潢惚性溃疡及胃炎中静嘲谯章羧懑,与蒎学军等”3掇遘缝莱一致。

细胞毒素相关蛋白(CagA)相对分子质蛰(Mr)为130×103,与空泡毒索辩切相关而功能又不清楚。

编码此蛋白的基因成为毒索相关基因(cagA撼因),cag基因只存在于6o_00%Hp中,为单拷贝撼因,cagA基逸全长4

821

[2]孙艳艳,崔雅杰,康熙雄.蛋白芯片技术梭测鹏门螺杆菌感染

的临床价值[J].中华匿院感染学杂志,2006,16(12);1347—

1349。

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tion

Rolepylori

9.

of

urease

in

megasomeIorma—

andHellcobactersurvival

in

macrophages[I].

bp。

开放鼹读框编码l181个

I.eukocBiol,2006,79(6):

1914-1225.

懿麓酸,相对努子囊量搀130×103蛋是凌01。

农题方翻家,Hp分离探审cagA基困的阳性枣约鸯60.oo%,具有cagA基因Hp感染者比无cagA麓箧Hp感染者有更明显的胃炎和胃上皮损伤,胃黏膜活棱标本中IL-la、II,8表选更高,与消化性溃疡和胃腺癞的发生有更显著的相美性。

而亚洲国家的许多磷究发蕊,cagA基因的嗣性率都很高,荔加坡、疆举的一些骚窕发瑾“““一,HpcagA基困戆鞭毪搴薅达

[8]SuzukjY,GabazzaEC,ImamI删e越,Vacuolafingcytoto#JnA

is

associatedwithincreasedthrombin

generation

in

gastric

㈨osa[".Helicohacter,2005,io(4)1323~331

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(转蘩1522委)

万方数据 

ChinJNosoeomiolVol17No.122007

帮置导尿每延长1d,发生尿路感染的危险性增加5%“。

性别不同对医院感染的发生无影响。

3.2

早脱机和撤除各种留置插管。

(4)合理使用抗菌药物。

抗菌药物的使用根据送检标本培养的药敏结果,采用针对性强、广谱高效的抗菌药物。

近年来提倡术前30min行术前诱导预防性用药,这些均是降低医院感染的有效措施。

参考文献:

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忐,2001.8i(5):

314—320

易感因素根据年龄分布,年龄大的患者感染

率相对较高。

住院天数长的患者容易发生感染。

医院是各种微生物流行的场所,患者住院时间越长接触病原体的机会越多。

又因为患者病情多偏重,治疗和检查性的操作频繁集中,更易引起医院感染的发生。

呼吸道机械通气与未机械通气患者,泌尿道插管与未行插管患者,留置深静脉与未留置深静脉患者以卜3组中进行比较。

有侵人性操作和无侵人性操作引起的医院感染明显不同。

留置医用插管时问>7d的患者医院感染率也大大增加。

这凿主要是因为侵入性操作和留置人体内的导管破坏了机体本身的防御屏障,并且把体外的致病莆带人体内,增加了机体感染的概率而致病“。

随着留置导管时间的延跃,导管周围组织被压迫,导致组织缺血、缺氧更易使体外细菌滋生。

受污染的导管病原微生物生长约需7

d,7

12]DettenkoferM,EbnerW,Els

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16(5):

500—

502.

d后细菌进入体内易引起医院感

染。

“。

以往的调查资料显示在长期机械通气患者中,以普通性肺炎发病率最高“J。

3.3防治措施神经科重症监护病房因其患者的特殊性及发病的严重性,需积极有效地采取防治措施控制医院感染。

(1)积极开展患者预防医院感染的宣传和教育,加强医护人员对医院感染的认识,掌握医院感染的发病原因。

(2)重视消毒隔离。

坚持定期对病房进行消毒,保持室内清洁.注意空气流通。

(3)根据引起医院感染的易感因素,采取针对性防治-7。

1“。

积极治疗患者慢性基础性疾病,增强免疫力,避免长期卧床。

减少住院天数。

进行侵袭性操作、护理及治疗时需严格按照无菌规范执行。

接触患者前、后要洗手(或手快速消毒)。

病情好转及

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措施[J3.中华医院感染学杂志,2005.15(2):

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(接第1494页)

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E,Canavez

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