多壁碳纳米管修饰铂基片石英晶体微天平研究白细胞介素6与其受体的相互作用.docx

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多壁碳纳米管修饰铂基片石英晶体微天平研究白细胞介素6与其受体的相互作用

多壁碳纳米管修饰铂基片石英晶体微天平研究白细胞介素-6与其受体的相互作用

　　摘要在pH7.4、室温条件下，用多壁碳纳米管（MWCNTs）修饰石英晶体微天平（QCM）Pt基片，经过EDC/NHS活化后固定白细胞介素-6（IL-6），检测不同浓度可溶性白细胞介素-6受体（sIL-6R）与IL-6的结合所引起响应信号的变化，并用Origin软件对数据进行拟合分析，构建了一种高性能实时监测IL-6与sIL-6R之间相互作用的亲和型生物传感器。

实验表明:

随着sIL-6R浓度的增加，其结合量呈线性增长，相关系数（R2）为0.997。

IL-6与sIL-6R之间相互作用的结合平衡常数（K?

?

A）和解离平衡常数（K?

?

D）分别为3.37×106L/mol和2.97×10－7mol/L。

验证了通过MWCNTs修饰的PtQCM能够高效监测IL-6与sIL-6R间相互作用及动力学过程，有助于阐明二者的生物学功能。

　　关键词多壁碳纳米管；Pt基片；石英晶体微天平；白细胞介素-6；可溶性白细胞介素-6受体

　　2010-12-08收稿；2011-04-12接受

　　本文系国家自然科学基金（Nos.30870665,30772746,90709038）和天津市自然科学基金（Nos.08JCZDJC20600,09ZCGHHZ00100）资助项目

　　*E-mail:

qiangchen@

　　1引言?

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　　白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）是一种多功能细胞因子，在免疫应答、造血系统调控和肿瘤细胞生长等方面发挥重要的生物学效应［1］。

IL-6的生物学功能是通过与白细胞介素-6受体（Interleukin-6receptor,IL-6R）相结合，从而触发胞内信号转导来实现的。

IL-6R有两种，一种分布在细胞膜表面，另一种分布在体液中的可溶性IL-6R（Solubleinterleukin-6receptor,sIL-6R）中。

研究表明，sIL-6R可作为IL-6介导生理应答反应的高效增强剂发挥作用［2,3］。

?

?

　　IL-6和sIL-6R之间的相互作用监测通常采用放射免疫技术或酶联免疫法等，但是利用这些检测方法很难对其进行动力学分析，并且操作繁琐、耗时［4］。

压电石英晶体微天平（QCM）具有轻便、简单、成本低等特点，并能够实时监测生物大分子间相互作用的动力学过程，因此被广泛应用于生物分析、临床诊断以及环境监测中［5,6］。

碳纳米管（Carbonnanotubes,CNTs）是日本科学家Iijima于1991年发现的一种新型碳材料［7,8］。

由于CNTs具有优异的导电性能、较强的吸附能力和良好的生物相容性等［9,10］，被广泛应用于药物投递、细胞运输、骨骼诱导等体系中［11～13］。

由于生物体系中存在大量Cl－，而Pt基片在此体系中可以保持高稳定性，因此使PtQCM表现出很多独特性质［14,15］和高抗干扰能力［16］。

由于Pt基片很难通过常规的酰胺化方法与生物大分子相连，因此PtQCM很少应用于监测蛋白、抗体或生物组织等大分子中［17］。

本实验将羧基化的MWCNTs修饰在Pt基片表面，经过EDC/NHS活化后固定IL-6，制备了一种监测IL-6和sIL-6R相互作用动力学过程的高性能的新型生物传感器。

　　2实验部分

　　2.1仪器与试剂?

?

　　SEIKOQCA917型石英晶体微天平（Quartzcrystalmicrobalance,QCM，EG＆G公司）；AT-切割石英晶体铂金基片（表面积为（0.19±0.01）cm2），工作频率为9MHz；KQ-218型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；QUANTA200型扫描电子显微镜（SEM，FEI公司）。

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?

　　1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙酸）碳二亚胺（1-Ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodimide,EDC）、N-羟琥珀酰亚胺（N-Hydroxysuccinimide,NHS）、牛血清白蛋白（BSA，MW66000）,均购自Sigma公司;重组人IL-6及sIL-6R（Peprotech公司）;MWCNTs（O.D.＝8～12nm，Length＝0.5～1.0

　　m，中国科学院成都有机化学有限公司，纯度＞95%）。

0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）。

其它试剂均为分析纯。

实验用水为Milli-Q去离子二次蒸馏水;实验温度为25℃。

　　2.2碳纳米管的预处理?

?

　　利用浓H?

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2SO?

?

4-浓HNO?

?

3（3∶1，V/V）的混和酸将MWCNTs溶解，超声振荡4h。

以去离子水为清洗剂，将酸处理的MWCNTs多次离心、洗涤，调节pH值至中性，即得到羧基化的MWCNTs（图1a）。

将干燥后的MWCNTs超声分散于去离子水中，配成1g/L溶液。

　　2.3Pt基片表面活化与IL-6在基片表面的固定?

?

　　将Pt基片用去离子水清洗，再用纯甲醇浸泡30min，然后以去离子水冲洗3次，超声波清洗3min，用N?

?

2吹干。

在处理好的Pt基片表面滴加20

　　LMWCNTs溶液，用PBS冲洗3次，以除去未吸附的MWCNTs，形成一层致密的MWCNTs薄膜（图1b）。

加入EDC/NHS混合液（0.4mol/LEDC和0.1mol/LNHS）反应约30min，用于活化MWCNTs的羧基（图1c）。

活化的羧基可与IL-6的氨基以酰胺键共价结合，从而将IL-6固定于Pt基片表面（图1d）。

　　分析化学第39卷

　　第9期房钰鑫等:

多壁碳纳米管修饰铂基片石英晶体微天平研究白细胞介素-6与其受体的相互作用

　　图1MWCNTs的预处理及IL-6在基片上的固定

　　Fig．1SchematicdiagramforpretreatmentofMWCNTsandimmobilizationofinterleukin（IL-6）onPtelectrodeofquartzcrystalmicrobalance（QCM）

　　（a）MWCNTs的羧基化（CarboxylationofMWCNTsbyH?

?

2SO?

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4andHNO?

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3）;（b）MWCNTs在基片表面的固定（ModificationofMWCNTsonPtelectrodeofQCM）;（c）EDC/NHS活化（ActivatedMWCNTsby1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodimide/N-hydroxysuccinimide）EDC/NHS）;（d）IL-6的固定（ImmobilizationofIL-6onPtelectrodeofQCM）。

　　2.4IL-6和sIL-6R的结合?

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　　将IL-6包被的Pt基片用PBS冲洗3次，待基线达到平衡后，分别加入一定浓度（3.13,6.25,12.5和25.0mg/L）的sIL-6R，使之与IL-6充分反应达到平衡。

用PBS反复冲洗，以除去非特异吸附的sIL-6R。

　　3结果与讨论

　　3.1MWCNTs修饰Pt基片的扫描电镜表征?

?

　　将分散的MWCNTs悬浮液滴在Pt基片表面，形成致密的MWCNTs薄膜。

由滴加MWCNTs前后Pt基片的扫描电镜图（图2）可见，MWCNTs比较均匀地吸附在Pt基片表面。

　　图2（A）空白Pt基片扫描电子显微镜图，（B）修饰有MWCNTs的Pt基片扫描电子显微镜图

　　Fig．2（A）SEMimageofbarePtelectrode,（B）SEMimageofPtelectrodemodifiedwithMWCNTs

　　3.2sIL-6R的固定?

?

　　由于QCM是一种能够连续、实时监测蛋白间相互作用的仪器，因此可以进行蛋白间动力学监测分析。

QCM响应频率的变化值与沉积在基片表面物质的质量之间关系符合Sauerbrey方程［18］:

　　ΔF＝－2.26×10－6F?

?

02Δm/A

（1）

　　式中，Δm为基片表面结合物质的质量（g），ΔF为结合物质所引起的频率变化（Hz），A为基片的有效面积（cm2），F?

?

0为基片固有的振动频率（Hz）。

不同浓度（3.13,6.25,12.5和25.0mg/L）的sIL-6R与IL-6之间特异性结合所引起的频率变化见图3。

随着sIL-6R浓度的增加，基片的振动频率逐渐降低。

当加入高浓度样品时，振动频率有一个明显的瞬间直降，这可能是由于加样对基片的机械扰动引起的。

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?

　　为了验证IL-6与其受体sIL-6R在基片表面的特异性结合,以及排除非特异性蛋白的干扰，引入了BSA作为对照。

如图4所示，在IL-6修饰基片后，分别加入相同浓度（25.0mg/L）的BSA和sIL-6R。

加入BSA后，基片振动频率下降，但是用PBS冲洗后，振动频率又恢复到初始基线状态；而sIL-6R的加入引起了显著的频率变化。

由此可见，IL-6与sIL-6R的结合具有特异性，其它蛋白（例如BSA）与IL-6的非特异性相互作用是可以忽略不计的。

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　　图3不同浓度的sIL-6R与IL-6之间特异性结合所引起的频率变化曲线

　　Fig．3Individualbindingcurvesofsolubleinterleukih-6receptor（sIL-6R）invariousconcentrationsonIL-6-1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodimide/n-hydroxysuc-cinimide（EDC/NHS）-MWCNTsactivatedPtQCM

　　sIL-6Rconcentration:

（a）3.13mg/L;（b）6.25mg/L;（c）12.50mg/L;（d）25.00mg/L.

　　图4（a）25.0mg/L非特异性蛋白（BSA）在修饰后基片表面的吸附；（b）25.0mg/LsIL-6R在修饰后基片表面的特异性吸附

　　Fig．4（a）Nonspecificadsorptionof25.0mg/LBSAonthemodifiedelectrode,（b）specificadsorptionof25.0mg/LsIL-6Ronmodifiedelectrode

　　根据公式

（1）可计算出不同浓度下的sIL-6R结合在基片上的质量。

图5表示结合在基片上sIL-6R的质量与sIL-6R溶液浓度之间的关系。

随着sIL-6R浓度（c，mg/L）的增加，结合在基片上的sIL-6R的质量（Δm，ng）呈线性增长，其线性关系符合Δm＝4.23c＋11.9（R2＝0.997）。

　　3.3IL-6与sIL-6R相互作用的动力学分析?

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　　sIL-6R在基片上的吸附过程（ΔF-t曲线）符合Langmuir吸附方程［19］，即

　　f＝k?

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dcF?

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maxk?

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a＋k?

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d{1－exp（k?

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ac＋k?

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d）t}＝F?

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eqexp（－k?

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obst）

（2）

　　式中，k?

?

a为结合速率常数，k?

?

d为解离速率常数，k?

?

obs为表观结合速率常数，c为待测物质浓度，F?

?

max为基片表面吸附的靶分子达到饱和时所引起的频率变化。

用Origin软件对不同浓度的ΔF-t曲线进行非线性拟合，得到相应的k?

?

obs。

图6是对不同浓度的sIL-6R与IL-6结合的表观结合速率常数进行分析的工作曲线。

其拟合的线性回归方程为

　　k?

?

obs＝0.392c＋9.29（R2＝0.988）。

所拟合曲线的斜率与截距比为结合平衡常数（K?

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A），因此，sIL-6R与IL-6的K?

?

A为3.37×106L/mol，而解离平衡常数K?

?

D＝1/K?

?

A，得出K?

?

D为2.97×10－7mol/L。

据文献［17,20］报道，由于反应条件和实验环境的不同，sIL-6R与IL-6之间的解离平衡常数在10－6～10－9mol/L范围内，本研究所得数据符合此范围，故本方法是可靠的。

　　图5sIL-6R的吸附量与sIL-6R浓度之间的关系

　　Fig．5CombinedmassesofsIL-6RinvariousconcentrationsonIL-6-EDC/NHS-MWCNTsactivatedPtQCM.ThecombinedmassesofsIL-6RincreasedlinearlywithincreasingconcentrationofsIL-6R

　　图6表观结合速率常数k?

?

obs与sIL-6R浓度之间的线性关系

　　Fig．6Linearcorrelationbetweentheapparentbindingrateconstantk?

?

obsandconcentrationsofsIL-6R

　　4结论?

?

　　本研究利用MWCNTs修饰QCMPt基片，构建了一种实时监测IL-6与sIL-6R之间相互作用的亲和型生物传感器。

实验表明，通过MWCNTs修饰的PtQCM能够高效监测IL-6与sIL-6R间相互作用及动力学过程，IL-6与sIL-6R之间相互作用的结合平衡常数（K?

?

A）和解离平衡常数（K?

?

D）分别为3.37×106L/mol和2.97×10－7mol/L。

本传感器操作简便、有效。

此外，由于体内IL-6及其受体是活血化瘀中药潜在的作用靶点，因此，研究二者之间结合动力学过程可为探究中药作用机理提供一种新的研究方法。

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　　PtQuartzCrystalMicrobalance

　　FANGYu-Xin1,SHANGHong-Cai2,QINXia1,FANGuan-Wei2,ZHANGDi1,ZHAOWei1,

　　LIZheng-Chun1,ZHANGBo-Li2,CHENQiang*2

　　?

?

1（TheKeyLaboratoryofBioactiveMaterials,MinistryofEducation,

　　CollegeofLifeScience,NankaiUniversity,Tianjin300071）

　　2（InstituteofTraditionalChineseMedicineResearch,TianjinUniversityofTraditional

　　ChineseMedicine,Tianjin300193）?

?

　　AbstractAnaffinitybiosensorusingmulti-walledcarbonnanotubestoactivatePtquartzcrystalmicrobalance（QCM）electrodeandimmobilizinginterleukin-6（IL-6）on1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodimide（EDC）/?

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N?

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-hydroxysuccinimide（NHS）-activatedQCMelectrodewasemployedtorealtimedetecttheinteractionandkineticanalysisofIL-6andsolubleinterleukin-6receptor（sIL-6R）,andtheassociationdatabetweenIL-6andsIL-6RwasfittedbyOriginsoftware.TheresultsshowedthatthecombinedmassesofsIL-6RonIL-6-EDC/NHS-MWCNTsactivatedPtQCMincreasedlinearlywiththeincreaseofconcentrationofsIL-6R,andthelinearcorrelationcoefficientwas0.997.Fortheinteraction,?

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K?

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Awas3.37×106L/mol,and?

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K?

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Dwas2.97×10－7mol/L.Theexperimentprovesthefeasibilityofusingmulti-walledcarbonnanotubesactivatedPtquartzcrystalmicrobalancetomonitortheinteractionandkineticanalysisofIL-6andsIL-6R,itcanhelptoclarifytheimportantbiologicalfunctionofIL-6andsIL-6R.AllexperimentswereperformedinPBS（0.01mol/L,pH7.4）atroomtemperature.

　　KeywordsMulti-walledcarbonnanotubes;Platinumelectrode;Quartzcrystalmicrobalance;Interleukin-6;Solubleinterleukin-6receptor

　　（Received8Dece