多糖化学结构鉴定方案总结.docx

多糖化学结构鉴定方案总结.docx

《多糖化学结构鉴定方案总结.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《多糖化学结构鉴定方案总结.docx（24页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

多糖化学结构鉴定方案总结

经过分级纯化的多糖在测定结构前须检查其纯度及测定分子量。

检查纯度最常用的判断方法：

（1）用GC、HPLC测定组成多糖的单糖的摩尔比是否恒定。

用不同的柱型测定结果更为可靠。

（2）电泳只出现一条带。

如可用聚丙烯酰胺凝胶电泳、乙酸纤维素薄膜电泳及玻璃纤维纸电泳。

对于中性多糖可采用高压电泳，以硼酸盐为缓冲液，可增大其迁移速度。

（3）凝胶柱层析图呈现对称的单峰。

若有“拖尾”现象，说明其均一性不够好。

阴离子交换层析纯化

用DEAE一纤维素52（2.6x100cm）柱层析,0.lmol/LNaCl洗脱,流速6ml/h,按2ml一管分部收集,苯酚一硫酸法逐管检测,绘制收集体积与糖含量之间的关系曲线。

看是否有单一对称峰。

按照Ye等报道,采用DEAE一52一纤维素交换柱层析法（2.6x30cm）对鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖进行初步分离。

DEAE一纤维素凝胶预处理:

称取DEAE一52一纤维素凝胶干粉,加入约10倍体积质量比（ml/g）的0.5mol/LNa0H溶液浸泡30分钟,倒出上清液,用大量去离子水反复浸洗至pH值近中性;再用相同体积的0.5mol/LHCI溶液浸泡30分钟,倒出上清液,用大量去离子水反复浸洗至pH值近中性;最后用相同体积的0.5mol/lNaOH溶液再浸泡30分钟,用大量去离子水反复浸洗至pH值中性。

处理完毕后,进行湿法装柱,用去离子水0.5mol/LNaCl溶液,去离子水依次分别平衡（流速1.0ml/min）2一3个柱体积备用.

糖样100mg溶于5ml的去离子水中,离心除去不溶物,上样于DEAE一52一纤维素阴离子层析柱（2.6x30cm,Cl-1型）,分别采用去离子水0.1和0.3mol/LNaCI溶液进行分段梯度洗脱,流速1.0ml/min,自动收集器分部收集（10ml/管）,每梯度20管。

用硫酸一苯酚法跟踪检测各管多糖含量（490nm处吸收值）,以收集的管数为横坐标。

吸光值（490nm）为纵坐标绘制DEAE一52一纤维素色谱柱洗脱曲线。

依据洗脱峰型,合并相同组分,50℃旋转蒸发浓缩,对去离子水透析48h以去除NaCI及小分子杂质,最后将透析内液冷冻干燥,得初步纯化产品。

初步纯化多糖得率计算公式:

多糖得率（%）=纯化多糖质量/粗多糖质量x100%

葡聚糖凝胶层析纯化

采用SephadexG-100凝胶层析法对DEAE-52一纤维素初步纯化的不同组分的多糖样品进一步纯化。

葡聚糖凝胶（sephadexG一100）的预处理:

称取sephadexG一100凝胶干粉,加入30倍体积质量比（ml/g）的去离子水,沸水浴5小时使其溶胀。

冷却后用去离子水反复浸洗,减压脱气后进行湿法装柱,用0.1MNa2SO4;溶液平衡（流速0.25ml/min）2一3个柱体积备用。

分别称取经DEAE一纤维素一52初步纯化的各多糖组分样品20mg,溶于2ml0.1M

Na2SO4溶液中,上样于SephadexG一100层析柱（2.6x60cm）用0.1MNa2SO4溶液溶液洗脱,流速0.25ml/min,分步收集（5ml/管）。

用硫酸一苯酚法跟踪检测各管多糖含量（490nm处吸收值）,以收集的管数为横坐标。

吸光值（490nm）为纵坐标绘制sePhadexG一100色谱柱洗脱曲线。

依据洗脱峰型,合并相同组分,50℃旋转蒸发浓缩,对去离子水透析48h以去除Na2SO4;及小分子杂质,最后将透析内液冷冻干燥,得不同纯化产品。

纯化多糖得率计算公式:

纯化多糖得率（%）=纯化多糖质量/粗多糖质量x100%

（鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖）

（4）纸层析法呈单一集中斑点。

取0.5%的多糖样品溶液50ul,点样于新华中速滤纸（3cmx20cm）距端点1cm处的中部,以正丁醇:

浓氨水:

水（4O:

50:

5）为展开剂,饱和2小时以上,在室温下展开6h,取出吹干,用0.5%甲苯胺蓝液染色,立即用95%乙醇漂洗至背景褪色,看是否只有一个清晰的斑点。

（5）琼脂糖（Agarose）凝胶电泳法

在琼脂糖板（厚度为0.2cm）上点样3一5ul采用浓度为0.075mol/L,pH8.6的巴比妥缓冲液,电泳1-1.5h,电压为64一80V,甲苯胺蓝（浓度为1%）染色,醋酸乙醇混合溶液（醋酸:

乙醇:

水=0.1:

5:

5）脱色。

多糖纯品经电泳展开后,看是否呈现单一斑点,斑点是否清晰。

（6）紫外分光光度法

将多糖PWZ加0.9%NaCI溶液溶解,配成浓度为1mg/ml的溶液,采用UV一16OA紫外可见光谱仪扫描（200nm一30Onm）观察260nm、280nm处是否有吸收峰。

多糖的分子量测定：

过去用超速离心沉降法、光散射法、渗透压法、粘度法等，这些方法操作复杂且误差较大，现已少用。

现在较常用的方法有凝胶过滤法和高效凝胶液相色谱法，这两种方法须先用已知分子量的标准多糖对照测定样品的分子量。

一般来说，多糖结构分析包括以下几点：

（1）单糖组成分析：

研究确定单糖的种类及摩尔比；

完全酸水解后用高效液相色谱方法（HPLC）或气相色谱方法测定。

（2）糖苷键类型：

研究确定糖苷键及支链点连接位置；

甲基化分析方法

高碘酸氧化法与Smith降解法

（3）糖环大小：

研究确定糖苷键为呋喃糖或吡喃糖；

红外光谱

（4）异头碳构型：

研究确定糖苷残基的a-或P-构型；

2DNMR.（TwodimensionalNuclearMagneticResonance）光谱分析方法测

（5）确定单糖残基和重复单元的序列

甲基化分析方法与磁共振光谱分析方法结合分析，一般会参考多糖的单糖组成及摩尔比信息以利于解析多糖结构。

高碘酸氧化法

薄层层析（TLc）——定性，

气相色谱法

（6）取代基团位点：

研究0H-修饰基团的种类和取代位点，如0-磷酸化，乙醜基取代，0-硫酷化等；

比色分析方法

（7）多糖分子量分布的研究。

紫外光谱

定性与定量方法

薄层层析：

残基定性

气相色谱：

残基定量

气质联用：

残基定量

高效阴离子色谱法：

残基定量

鉴定结构常用物理化学方法：

高效液相色谱:

确定单糖组分和相对分子量

红外光谱分析:

测定多糖的官能团，不仅可以检测酮糖、酵糖的耻喃糖环或呋喃糖环的构象和糖苷键的构型

核磁共振:

α-构型与β-构型残基的比例；判断异头碳构型；推断主链和支链连接键型

鉴定结构复合方法：

甲基化分析:

推断出多糖样品中糖基的连接方式及各种连接键型的比例

高碘酸氧化法与Smith降解法:

判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度及支链多糖的分支数目

糖睛乙酸酷衍生物的气相色谱法:

单糖组成和摩尔比

各种多糖化学结构鉴定方法的具体实施方案

1、酸水解

（1）完全酸水解

称取20mg样品,加入2mL2mol·L-1的H2SO4于安培管中沸水浴水解8h,水解液用BaCO3中和至pH=7,离心,取上清夜置冰箱冷藏备测。

（阿魏侧耳子实体多糖分离纯化及其化学结构的初步研究）

（2）部分酸水解

称取糖样70mg，80℃条件下，0.05M三氟乙酸水解2h。

降至室温后，离心（4000r/min，10min），将沉淀干燥，留做GC分析。

上清用无水乙醇除酸至中性（pH为6∼7），蒸馏水透析48h：

将袋外透析液浓缩，真空干燥，留做GC分析；袋内液浓缩至5ml左右，加10倍体积无水乙醇，醇沉过夜，离心（4000r/min，10min），沉淀常规干燥，作GC分析；上清浓缩，真空干燥，留做GC分析。

2、高效液相色谱

确定样品的单糖组成

色谱条件为:

色谱柱为ShodexKS804Sugar（300mm×7.8mm）

柱温40度

流动相为水

流速0.8mL·min-1

检测用410RⅠ示差检测器，数据处理用810GPC软件进行。

同时用鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、木糖、果糖、葡萄糖、岩藻糖8种单糖进行对照,根据峰值确定样品的单糖组成。

分子量的测定以标准分子量的葡聚糖Pulluan作分子量测定标准。

让其通过高压液相色谱柱,条件同上,先以分子量对数与对应的保留时间作标准曲线,从标准葡聚糖Pulluan的工作曲线上可以求得该成分分子量。

例如：

（阿魏侧耳子实体多糖分离纯化及其化学结构的初步研究）

将水解后的多糖样品PW2进行HPLC分析,结果如表所示:

阿魏侧耳子实体多糖PW2经过酸水解后,得到2种单糖:

葡萄糖和半乳糖,摩尔比例1.77∶1。

例如：

经HPLC测定后对照标准曲线得多糖PW2的分子量为3.18×104。

（阿魏侧耳子实体多糖分离纯化及其化学结构的初步研究）

4、甲基化分析

（1）基本原理

先将多糖中各种单糖残基中的游离羟基全部甲基化，然后将多糖中的糖苷键进行完全酸水解，水解后得到的化合物，其羟基所在的位置，即为原来单糖残基的连接点。

同时根据不同甲基化单糖的比例，可以推测出此种连接键型在多糖重复结构中所占的比例。

用此种方法得到的羟基及NaBH4还原醛基后产生的羟基，经乙酰化可得到甲基化的糖醇乙酸酯（此产物易挥发，可进行GC分析），再经GC与GC-MS分析，通过气相色谱的出峰顺序和对质谱谱图的主要离子碎片的分析便可以较准确地确定糖的连接键型。

反应通式如下:

（2）甲基化反应

取充分干燥的多糖样品10mg，溶解在2.0ml的二甲基亚矾（DMSO）中。

在N2保护下快速加入干燥的NaOH粉50mg，用N2排出空气，加盖密封，室温反应1.0h并间歇振荡。

在N2保护下缓慢滴加碘甲烷1.0ml，用N2排出空气，加盖密封，室温继续反应1.0h并间歇振荡，反应完成后加0.5ml水终止反应。

反应液先用自来水流水透析48h，再用蒸馏水透析24h，透析液冷冻干燥得第一次甲基化样品。

第一次甲基化样品继续甲基化，反应步骤同上，得第二次甲基化样品。

如此重复甲基化三次。

甲基化后的样品用红外光谱检测，3700cm-1—3100cm-1，附近无羟基的特征吸收峰，表明甲基化反应完全。

（3）甲基化样品的衍生化

上述完全甲基化多糖样品加入2mol/1的三氟乙酸（TFA）3.0ml,120℃密闭水解2.0h。

冷却后50℃减压蒸发干，加2.0ml甲醇再蒸发干，重复三次，最后蒸发干得完全甲基化多糖的水解产物。

加蒸馏水2.0ml使其溶解，再加硼氢化钠25mg，振荡后室温还原反应2.0h。

反应完后滴加0.1mol/1醋酸分解过量的硼氢化钠并调pH值至5.5~7.0弱酸性。

反应液50℃减压蒸发蒸干，加2.0ml甲醇再蒸干，重复三次，最后蒸发干。

上述蒸发干样品加入1.0ml醋酸酐和1.0ml吡啶，封管后在沸水浴中反应1.0h。

反应液50℃减压蒸发干，加2.0ml甲醇再蒸发干，重复三次，最后蒸发干。

加入丙酮1.0ml，用0.45ul尼龙微孔滤膜过滤，取样进行GC/MS分析。

（4）衍生化样品的GC/MS分析

多糖样品经甲基化、水解、还原、乙酰化后得到甲基化糖醇乙酸酯，进行GC/MS联机分析，根据文献的相对保留时间和不同单糖的主要离子碎片（m/e），推断出多糖样品中糖基的连接方式及各种连接键型的比例。

本实验采用的条件为:

GC（VarianCP3800型）和MS（VarianSatum2200型）气相一质谱联用仪，DB-5MS石英毛细管柱（30mX0.25mmX0.25um）;程序升温，初温80℃，保持1min，以8℃/min升至210℃，保持1min，再以20℃/min升至260℃,保持1min;氦气作载气，进样口温度250℃，分流比1:

50，柱流速1.0ml/min;电子电离源（EI源）70eV，倍增器电压350V，灯丝电流250uA，接口温度260℃,离子源温度180℃，质荷比（m/z）扫描范围30~450，扫描速率2.5scan/sec。

（胞式层孔菌菌丝体多糖分离纯化、结构鉴定及其生物活性研究）

流程图如下：

（MAEP-2a-2b是安络小皮伞菌丝体多糖的某个过程中第某个样品）

例如：

经过甲基化反应的MAEP-2b-2a通过GC-MS分析，结合其各峰位保留时间和质谱

碎片峰，判断样品的结构并计算摩尔百分比。

从表14中，可以看出MAEP-2b-2a中糖部分是以（1→2,1→6）连接的Man（甘露糖）为主链。

（1→2）连接的Man（甘露糖）在其4位上有分枝点,（1→6）连接的Man在其2位上有分枝点。

在这些分枝点上，连接着由Gal和Glu为主组成的侧链。

MAEP-2b-2a的非还原末端是由Gal,Man,Glu组成。

从甲基化结果的摩尔百分比计算，各分枝点摩尔百分比之和低于非还原末端摩尔百分比之和，由PMP衍生化组成糖分析结果可知，MAEP-2b-2a尚含约9%的GalA，糖醛酸在复杂多糖中可能以分枝点的形式存在，故推测在MAEP-2b-2a中还有大量的GalA作为分枝点而存在。

（络小皮伞菌丝体多糖）

（茶源多糖结构鉴定）

5、红外光谱分析

取干燥样品微量,压片,全波段扫描。

例如：

阿魏侧耳子实体多糖分离纯化及其化学结构的初步研究

图中显示在4000cm-1～650cm-1区内的是具有多糖类物质的一般特征。

3372cm-1的吸收峰是O-H和N-H的伸缩振动峰,2931cm-1为C-H的吸收峰,即为-CH和-CH2的共振吸收锋。

这两类是糖类的特征吸收峰。

848cm-1吸收峰表明在PW2（文中提纯的第二种成分）多糖纯品结构中存在α型（即α端基差向异构体）,1026cm-1、1081cm-1和1152cm-1的吸收峰表明PW2中的糖环为吡喃糖环,这是由醚键C-O-C振动而产生的吸收峰;而呋喃糖环在此区间上只有两个强吸收峰。

在890cm-1处有微弱吸收,表明样品中含有少量β型糖苷键,而在810cm-1处没有振动吸收峰表明没有甘露糖的存在。

928cm-1为糖类分子振动吸收峰,即D-吡喃糖的非对称环伸缩振动产生。

而1725cm-1的存在,表明多糖含有糖醛酸基团,即PW2为酸性多糖。

3、核磁共振

将样品10mg,溶于D2O（重水）中,溶解温度80℃,分别在400MHz和500MHz上测定1HNMR和13CNMR。

（阿魏侧耳子实体多糖分离纯化及其化学结构的初步研究）

（1）氢谱分析

例如：

5.39吸收峰表明样品的主要构型为α-构型,由于存在4.97吸收峰的存在,表明存在少量的β-构型（α-构型C-1信号在δ103以下,H-1信号在δ5.0以上;β-构型C-1信号在δ104以上,H-1信号在δ5.0以下）。

且α-构型与β-构型残基的比例为1∶0.2843。

（2）碳谱分析

例如：

由图及表2可以看出:

C-1信号在100.4ppm,即处在90-103之间,表明多糖的异头碳的构型为α-构型,同时可以看到存在一个微弱的117ppm峰,表明样品中有少量的β-构型,峰的相对高度正比于碳的数目,即α-构型与β-构型残基的比例为1∶0.29,这个结果和红外光谱以及氢谱的结论完全吻合。

图中70～76之间的碳共振峰分别是未被取代的C-2、C-3、C-4,其中,α与β两种构型的共振峰重叠严重,由于77.906为被取代的C-4的糖苷键的共振峰,图中可以看出存在重叠峰,这是由于α与β两种构型和两种单糖造成的,（小邱：

不是很明白它的意思，后面推测说应该是C-4上有支链）C-6部分共振峰由61.114向低场移动到69.977表明多糖PW2存在1-6糖苷键,根据峰高比例可以大约看出多糖PW2的主链为1-6糖苷键,存在1-4糖苷键的支链。

由C-1和C-6的峰高比例可以看出多糖PW2的支链不多。

6、高碘酸氧化法与Smith降解法

（1）原理

高碘酸氧化是一种选择性的氧化反应，它只能作用于多糖分子中连二轻基及连三轻基处。

当连二轻基的C-C键被断开后，产生相应的醛;当断裂连三轻基的C-C键时，产生甲酸及相应的醛。

此反应定量进行，每断开1molC-C键，消耗1mol高碘酸，由此可知，每生成1mol甲酸必然对应消耗2mol高碘酸。

因此，通过测定高碘酸消耗量及甲酸生成量，便可以判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度及支链多糖的分支数目等。

高碘酸氧化产物经NaBH4还原，得到的多糖醇用稀酸在温和条件下水解，可发生特异性降解，即Smith降解。

Smith降解的特点是只打断被高碘酸破坏的糖苷键，而未被高碘酸氧化的糖残基仍连在糖链上。

这样，多糖醇经Smith降解，就可以得到小分子的多元醇和未被破坏的多糖或寡糖片段，对这些产物进行分析，便可以推断出糖苷键的键型及其位置。

（2）高碘酸钠标准曲线绘制

各取适量的NaI04（15mmol/L）和NaIO3（15mmol/L）溶液，以5:

0,4:

1,3:

2,2:

3,1:

4和0:

5的体积比分别相混合。

取不同比例的混合液0.1ml稀释250倍至25ml，分光光度计测量各管223nm处的吸光值。

以混合液中的NaI04浓度（mmol/L）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制NaIO4标准曲线。

（3）高碘酸氧化

精确称取多糖样品25mg，用15mmol/1的NaIO4溶液将多糖配成1.0mg/ml〕溶液，振荡使其溶解。

2h后取多糖溶液0.1ml稀释250倍至25ml，分光光度计测量223nm处的吸光值。

多糖溶液置4℃冰箱，暗处反应，并间歇振荡。

间隔6h取样0.1ml稀至25ml，测223mn处吸光值，直至吸光值基本稳定。

根据反应前后的吸光值和NaIO4标准曲线计算出NaIO4消耗量。

加乙二醇1.0ml，静置反应1h以还原过量的高碘酸。

取反应液1.0ml，加50ul酚酞指示剂，用0.5mmol/L的NaOH溶液滴定，计算甲酸的生成量。

反应液加硼氢化钠50mg，静置反应20h以还原多糖醛成稳定的多羟基化合物。

用0.1mol/L的乙酸调反应体系的pH值为5.5-7.0，分解多余的硼氢化钠。

反应液用自来水流水透析48h，再用蒸馏水透析24h。

透析液50℃减压蒸发至干，加入甲醇2.0ml，再蒸干，如此重复3次，最后蒸干获多糖的高碘酸氧化产品待作Smith降解使用。

（4）Smith降解及GC分析

将减压蒸干的多糖高碘酸氧化产品，进行三氟乙酸（TFA）水解，再制备糖腈乙酸酯衍生物，最后用GC进行检测。

7、糖腈乙酸酯衍生物的气相色谱法（鲍氏层孔菌菌丝体多糖的结构分析）

（1）多糖样品水解采用完全酸水解法。

称取多糖样品5mg置安瓶瓶中,加入2mol/1三氟乙酸（TFA）2ml封管,120℃水解2小时。

水解液50℃条件下旋转蒸发至干,加入甲醇约2ml,再蒸发干,如此重复3次,最后蒸干待作衍生化使用。

（2）糖腈乙酸酯衍生物的制备

水解后的糖样中加入10mg盐酸羟胺、5mg肌醇（内标物）、0.6ml吡啶，封口，放入90℃水浴中加热反应30min并振荡。

冷至室温，再加入1.0ml醋酸酐，90℃水浴中继续反应30min，冷却后得糖腈乙酸酯衍生物。

反应产物可直接用于气相色谱分析。

（3）衍生物的气相色谱检测

本实验采用的条件为:

Agilent6890N气相色谱仪，5%苯甲基硅氧烷毛细管色谱柱HP-5，30.0mX320umX0.25um;氢火焰离子检测器（FID）;色谱柱程序升温:

1200C保持3min，以30C/min速度升温至2100C,2100C再保持4min;进样口、检测器温度分250℃、280℃;进样体积1.0ul,氮气、氢气和空气的流速分别是25ml/min,30ml/min,400ml/min。

（4）标准单糖衍生与检测

鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖等标准单糖同样进行糖睛乙酸酷衍生化，然后以同样条件进行气相色谱分析。

根据色谱图中各色谱峰的出峰时间、峰面积以及单糖本身的摩尔质量可知样品的单糖组成和摩尔比。

计算公式:

Wx=（Ax*Wi）/（Ai*f）。

公式中Wx一样品中单糖质量（mg）;

Wi一样品中加入内标的质量（mg）;

AX—样品中单糖的峰面积;

Ai—样品中内标的峰面积;

f—相对校正因子:

f=Wi*As/（Ws*Ai）。

8、薄层层析（TLc）

单糖残基的定性分析

（猴头菌实体多糖）

薄层层析（TLc）：

取2mg多糖样品放入薄壁长试管中,加入2mol/L三氟乙酸（TFA）4mL,在110℃下水解,中性多糖样品水解2h,含糖醛酸样品水解4h。

样品水解溶液减压蒸干（低于40℃）后,加入3mL甲醇再蒸干,重复以上步骤4一5次,以完全除去TFA。

再向样品中加入0.5mL左右的蒸馏水使样品完全溶解,取5uL在纤维素板上进行薄层层析,展开剂采用乙酸乙酯:

吡啶:

醋酸:

水（5:

5:

1:

3）,显色剂为苯胺一邻苯二甲酸,110℃加热10min后显色,以标准单糖样品为对照。

（山药多糖）

9、气相色谱法

（猴头菌体多糖）

（1）标准单糖样品的乙酰化

精密称取等摩尔（2mmol/L）的半乳糖、岩藻糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖和阿拉伯糖，分别溶于3mL蒸馏水中，加入20-30mg硼氢化钠（NaBH4），于室温下，间歇振荡，还原3h，然后用冰醋酸中和过量的NaBH4，至溶液不再产生气泡为止，pH应在4-5之间，加入3mL甲醇，减压浓缩蒸干，重复4-5次，以除去反应副产物硼酸及水分，然后置于真干燥器中过夜。

次日，110℃烘箱中加热15min，充分除去残留的水分后，加入4mL醋配，100℃反应1h，冷却，然后加入3mL甲苯，减压浓缩蒸干，重复4-5次，以除去多余的醋酐。

将乙酰化后的产物用3mL氯仿溶解后转移至分液漏斗，加入少量蒸馏水充分震荡后，除去上层水溶液，如此重复4次。

氯仿层以适量的无水硫酸钠干燥，定容至10mL待GC和GC-MS分析。

（2）样品的乙酰化处理

取2mg多糖样品，放入薄壁长试管中，加入2mol/L的三氟乙酸（TFA）4mL，在110℃水解2h。

将水解液低于40℃减压蒸干，然后加入3mL甲醇蒸干，重复上述操作4-5次，以完全除去TFA。

然后按照上述的方法进行还原、乙酞化，用氯仿定容至5m1，待GC和GC-MS分析。

（3）GC分析及定量

分别用单个单糖的标样按

（1）法处理后用GC测定，确定每个单糖的保留时间。

然后用单糖的混标按

（1）法处理后用GC测定，重复进样6次，确定混合标准样品的气相色谱图和相对标准偏差（RSD1）。

最后按

（1）法平行处理六个混标样品后用GC测定，确定其相对标准偏差（RSD2）。

糖的定量分析:

计算各糖组分的峰面积，利用面积归一法求出各糖组分的百分比例，并计算每种单糖的响应因子。

然后根据等摩尔的标样组分，计算出样品的摩尔比。

（4）色谱条件

气相色谱仪（GC）配备DB-23石英毛细管柱，30mX0.25mmX0.25um。

氢火焰离子化检测器（FID），高纯氮作载气。

程序升温:

柱初温120℃，以15℃/min升至240℃，恒6.5min。

进样口温度250℃，分流比1:

50。

检测器温度250℃氢气35mL/min，空气350mL/min，尾吹气30mL/min。

柱流速为1mL/min。

10、高效阴离子色谱法

（猴头菌体多糖）

取2mg多糖样品