酵母高产γ氨基丁酸发酵条件的优化.docx

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酵母高产γ氨基丁酸发酵条件的优化

酵母高产γ-氨基丁酸发酵条件的优化

STUDIESONFERMENTATIONCONDITIONSFORTHEPRODUCTIONOFGABAFROM　SACCHAROMYCES　CEREVISIAE　STRAIN

目　录

摘要………………………………………………………………………………………………1

关键词……………………………………………………………………………………………1

1前言……………………………………………………………………………………………2

2材料和方法………………………………………………………………………………………4

2.1材料……………………………………………………………………………………………4

2.1.1菌种…………………………………………………………………………………………4

2.1.2培养基………………………………………………………………………………………4

2.1.3主要的药品和设备…………………………………………………………………………4

2.2实验方法……………………………………………………………………………………4

2.2.1菌种活化……………………………………………………………………………………4

2.2.2种子培养……………………………………………………………………………………4

2.2.3发酵液中γ-氨基丁酸的含量测定…………………………………………………………5

2.2.4培养基优化…………………………………………………………………………………5

2.2.5发酵条件优化…………………………………………………………………5

3结果与分析…………………………………………………………………………6

3.1发酵液中γ-氨基丁酸的含量测定……………………………………………6

3.2培养基的优化……………………………………………………………………6

3.2.1碳源对菌体发酵的影响……………………………………………………6

3.2.2有机氮源对菌株发酵的影响…………………………………………………7

3.2.3无机氮源对菌株发酵的影响………………………………………………8

3.2.4无机盐对菌体发酵的影响…………………………………………………9

3.2.5培养基组成的优化…………………………………………………………10

3.3发酵条件的优化………………………………………………………………11

3.3.1初始pH对发酵……………………………………………………………11

3.3.2培养温度对发酵的影响…………………………………………………11

3.3.3摇床转速对发酵的影响……………………………………………………12

3.3.4种龄对发酵的影响…………………………………………………………12

3.3.5接种量对发酵的影响………………………………………………………13

3.3.6培养时间对发酵的影响……………………………………………………13

3.3.7优化发酵条件下菌株产γ-氨基丁酸特性鉴定…………………………14

4讨论…………………………………………………………………………………14

5结论…………………………………………………………………………………15

参考文献……………………………………………………………………………15

致谢…………………………………………………………………………………17

酵母产γ-氨基丁酸发酵条件的研究

学生：

吴辉

指导老师：

黄丽华

（湖南农业大学东方科技学院，长沙410128）

摘要：

γ-氨基丁酸（GABA）是一种具有许多生理功能的非蛋白氨基酸，主要通过微生物发酵生产。

本论文以诱变获得的高产γ—氨基丁酸酵母菌株为材料，对其发酵生产γ—氨基丁酸的培养基成分和培养条件进行了探讨。

结果表明，发酵的合适培养基为3%葡萄糖，3%蛋白胨，0.3%（NH4）2SO4和0.1%KH2PO4；适宜的摇瓶发酵条件为：

培养温度30℃，培养基起始pH值为5.5，摇床转速220r/min，接种量4%，种龄为2d的种子菌，培养时间4d。

在此发酵条件下，变异菌发酵液中γ-氨基丁酸含量可达2.590g/L。

关键词：

酵母；γ-氨基丁酸；发酵条件

StudiesonFermentationConditionsforthe　production　of　GABA　from　Saccharomyces　cerevisiae　strain

Student:

WuHui

Tutor:

HuangLiHua

（OrientalScience＆TechnologyCollegeofHunanAgriculturalUniversity,Changsha410128）

Abstract:

Gamma-aminobutyricacid（GABA）wasannon-proteinaminoacidwhichplayedanimportantroleinthephysiologicalactivities.AlargenumberofGABAproductswereproducedbythemicroorganismfermentation.Inthispaper,thefermentationconditionsforGABAproductionbySaccharomycescerevisiaestrainweretestedinshaking-flaskculture.Somefactorssuchascarbonsources,nitrogensources,inorganicsalt,initialpH,cuturetemperatureandtime,rotationspeed,seedage,andsoon,affectedtheproductionofGABA.Theoptimalculturemediaare:

3%glutathione,3%peptone,0.3%（NH4）2SO4,0.1%KH2PO4;Theoptimalfermentationconditionswereasfollows:

initialpH5.5,cuturetemperature30℃,rotationspeed220r/min,seedage2d,inoculumsize4%andculturetime4d.Inthiscondition,theyieldingcapacityofGABAbythemutantwas2.590g/l.

Keywords:

Saccharomycescerevisiaemutagenicity;Gamma-aminobutyricacid（GABA）;fermentationconditions

1前言

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，GABA），又名4-氨基丁酸（4-Aminobutanoicaid，4-AB），γ-氨酪酸，是以游离态或结合态存在于植物、动物、细菌、真菌、藻类、藓类、蕨类等生物体中的一种非蛋白质氨基酸，其结构式如图1所示[1]。

GABA在脊椎动物中枢神经系统中作为一种重要的抑制性神经递质起作用，具有降血压、抗惊厥、增加神经营养、改善脑机能、促进长期记忆、促进生长激素分泌及活化肝肾功能等生理功能[2~3]。

植物体内GABA具有的生理作用还不十分清楚。

已有的研究表明，它可能参与植物抵御逆境胁迫反应[4~5]和对病、虫害的保卫反应[6~7]等。

由于γ-氨基丁酸对人和动植物的生长发育、新陈代谢起着非常重要的作用，因而被广泛应用于医药、食品和饲料等诸多方面。

GABA应用研究进展很快，已发现不少的用途，如作为饲料添加剂，植物激素等，特别是在医药方面作用，其药理，临床实验都有很深入的报道。

图1GABA的结构

Fig1ThestructureofGABA

目前获得GABA的主要途径包括化学合成方法，从高等植物中富集以及微生物发酵生成。

（i）化学合成法

合成γ-氨基丁酸的化学方法主要包含以下几种：

（1）以邻苯二甲酰亚氨钾和7-氯丁氰或丁内酯为原料在强烈条件下反应，所得产物与浓硫酸作用后再经过水解制得产品GABA[8]；

（2）以吡咯烷酮为起始原料，经氢氧化钙、碳酸氢铵水解开环制得产品GABA；

（3）以丁酸和氨水为原料，在γ射线照射条件下，可以得到GABA；

（4）以丙胺和甲酸为原料，经辉光放电电解可以合成出GABA；

（5）以溴代乙酸甲酯和乙烯为原料，经聚合反应得到4-溴丁酸甲酯，再经氨解和水解可制得GABA。

化学方法合成GABA的成本较高，反应条件不易控制，且有化学物质的残留，安全性较差。

生产的产品主要应用于化工领域。

（ii）从高等植物富集GABA

GABA的天然存在量低，很难进行大规模的提取。

因此不少研究者尝试先将GABA富集，使其含量提高。

在植物体内，GABA的积累是植物体对外界温度、机械力等物理条件激烈变化时应急反应的产物，而GABA是谷氨酸在谷氨酸脱羧酶的作用下形成的，所以谷氨酸脱羧酶和γ-氨基丁酸转氨酶的钝化均有利于GABA的积累。

因此可以用机械的方法使细胞组织损坏，在被损坏的细胞组织上，GABA会大量产生；也可以采用迅速降温的方法，导致植物组织细胞内的隔室化，同时谷氨酸脱羧酶等的活性也会增加，从而导致GABA的增加[9~10]。

米胚芽中谷氨酸含量丰富，在内源性蛋白酶和谷氨酸脱羧酶的作用下，可以产生GABA，因此米胚芽是GABA的良好来源[11~13]。

张晖等在谷氨酸脱羧酶最佳反应条件下，利用米胚芽中的谷氨酸脱羧酶将外加的谷氨酸全部转化为GABA[14]。

松本恭郎等把辣椒、南瓜、茄子、番茄和蜜柑等新鲜果品、蔬菜切碎、磨细，添加谷氨酸钠后，在真空条件下嫌气处理，果蔬中GABA生成量是处理前的2.532倍不等，从而可使果蔬加工深度得到提升，提高果蔬的附加值[15]。

中国水稻研究所黄大年教授领导的小组历时8年，开发出了一种功能性大米—基尔米。

他们从上万株发生变异的群体中筛选到一株能超量生成GABA的水稻突变株，其GABA含量比一般的水稻品种高出5倍，由此而培育出水稻新品种—基尔-I型水稻。

以基尔一I型水稻为原料，利用高新生物技术活化开发出的基尔米，功能营养成分大幅度提高，特别是GABA的含量是普通糙米的10多倍，是精米的几十倍。

同时，基尔米还含有钾离子、镁离子、维生素、膳食纤维等生理活性物质和营养功能因子，长期食用可以达到强身健体的效果。

目前，基尔米己实现了产业化，现开发出的系列产品有：

基尔米活性全糙型、基尔米留胚型、基尔安米粉、基尔米奶。

（iii）发酵法生产

微生物发酵法是以谷氨酸或其衍生物（谷氨酸钠，或富含谷氨酸的物质等）为原料，利用大肠杆菌、酵母菌、乳酸菌和曲霉菌等微生物发酵制得。

其产品具有成本低、含量高及可安全用于食品的优点，但高效的微生物菌种通常较难获得。

大肠杆菌是一类具有较高GAD活性的微生物，已有许多研究者对利用它来生产GABA进行了探讨。

赵景联用海藻酸钙包埋法将大肠杆菌细胞制成固定化细胞，与1%的谷氨酸溶液进行间歇反应、连续搅拌式反应及连续柱式反应生产GABA。

章汝平等用以同样方法固定的固定化大肠杆菌细胞对后道味精母液提取谷氨酸后的废液进行转化生产GABA，获得的GABA含量达到了98.94%，收率为49.65%。

Plokhov等[16]用具有高活力GAD的基因工程大肠杆菌催化谷氨酸生成GABA，每1g湿细胞可以获得23-25gGABA，反应液中总GABA含量可达到280-300g/L，同时产率高达99%。

其他研究也曾报道，乳酸菌、酵母菌、曲霉菌在GABA类食品的制备中已有应用。

Takahashi等人筛选到了酿酒酵母的GABA转氨酶和唬珀酸半醛脱氢酶缺陷突变型菌株，其发酵液中GABA浓度分别达到了0.4mmol/L和0.42mmol/L。

Nomura等人从生产奶酪的菌株中分离到一株菌株，用于奶酪生产，奶酪中GABA的含量达到了383mg/g。

许建军[17]也从乳酸菌中筛选到了高产GABA的菌株，25L罐发酵72h，发酵液的GABA达到了250mg/100mL。

刘清等[18]也对高产GABA乳酸菌筛选和发酵条件进行了报道，发酵液中的GABA达到3.1g/L。

夏江[19]通过诱变方法得到了一株乳酸菌的高产突变株，对其培养条件优化以后产量最高可达107.5g/L。

总之，化学合成GABA安全性较差，植物富集的GABA含量不高，因此利用微生物发酵生产GABA就显得非常具有开发前景。

微生物发酵是一种复杂的生化过程，其发酵好坏涉及诸多因素。

除了菌种本身的生产性能外，还与培养基的配比，发酵时间、温度和pH值，发酵过程添加物的加入等有密切关系。

因此本论文以诱变获得的高产γ-氨基丁酸菌株为材料，对其发酵生产γ-氨基丁酸的条件进行了探讨，主要模索培养基成分、pH值、发酵温度和发酵时间等对γ-氨基丁酸产量的影响，期望获得较佳的发酵条件，为酵母高效发酵生产γ-氨基丁酸提供参考。

2材料和方法

2.1材料

2.1.1菌种

选育的高产γ-氨基丁酸突变酵母菌株4。

2.1.2培养基

斜面保藏培养基：

YEPD培养基加2%琼脂粉。

种子培养基：

YEPD培养基（葡萄糖2%+酵母膏1%+蛋白胨2%）

发酵培养基：

以YEPD培养基为基础，具体培养基成分根据实验确定。

2.1.3主要的药品和设备

（1）药品

酵母膏、蛋白胨、葡萄搪、琼脂、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、NaOH、HCl、1%尿素、1%牛肉膏、硫酸铵、磷酸铵、氯化铵、硝酸铵、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、NaCl

（2）设备

恒温培养箱、紫外可见分光光度计、超净工作台、分析天平、pH计、250mL摇瓶、恒温摇床、烧杯、培养皿、药匙、高压蒸汽灭菌锅

2.2实验方法

2.2.1菌种活化

用接种环从保存的菌种斜面上挑一环菌体接到新鲜的含2%琼脂的YEPD培养基斜面上，30℃培养1d。

2.2.2种子培养

用接种环从新鲜斜面接一环酵母菌于YEPD培养基中，30℃，200r/min摇床培养2d。

2.2.3发酵液中γ-氨基丁酸含量的测定

采用比色法测定γ-氨基丁酸含量。

其原理是利用苯酚和次氯酸钠与游离氨反应，生成蓝色的吲哚酚类。

由于氨基酸存在氨基，对Berthelot反应存在一定的响应。

氨基酸中氨基的位置不同，对Berthelot反应的响应程度也不同，利用这个差异，可以用于GABA的测定。

标准曲线的制作：

将GABA配成0.25g/L、0.50g/L、0.75g/L、1.0g/L、1.25g/L、1.50g/L、1.75g/L、2.0g/L梯度浓度溶液。

分别取0.4mL标准溶液，加入pH10.0硼酸盐缓冲液（0.2mol/L）0.5mL、6%苯酚1mL，混匀，加入NaClO溶液（活性氯5.2%）1mL，混匀后放置4～8min，然后沸水浴l0min，立即冰浴20min，待溶液出现蓝绿色后，加入2.0mL60%乙醇溶液，混匀后于20℃水浴中放置40min。

以蒸馏水进行同样操作作为空白，测定640nm处的吸收值。

以GABA的浓度为横坐标，A640为纵坐标绘制标准曲线。

然后取0.4mL发酵液测定其中的γ-氨基丁酸含量。

2.2.4培养基优化

（1）碳源对菌株发酵产γ-氨基丁酸的影响

分别以2%麦芽糖、乳糖、蔗糖和果糖取代YEPD中的葡萄糖，考察不同碳源对菌株产γ-氨基丁酸性能的影响。

发酵培养条件为：

250mL摇瓶装液量25mL，接种量3%，30℃，200r/min培养3d。

（2）有机氮源对菌株发酵产γ-氨基丁酸的影响

以一定浓度最佳碳源为碳源，在培养基中分别添加2%酵母膏、2%蛋白胨、2%尿素、2%牛肉膏，考察有机氮源对菌株产γ-氨基丁酸性能的影响。

发酵条件同

（1）。

（3）无机氮源对对菌株发酵产γ-氨基丁酸的影响

除有机氮源外，在培养基中分别添加硫酸铵、磷酸铵、氯化铵和硝酸铵，考察无机氮源对菌株产γ-氨基丁酸性能的影响。

发酵条件同

（1）。

（4）无机盐对菌株发酵产γ-氨基丁酸的影响

在培养基中分别加入KH2PO4、MgSO4、CaCl2和NaCl，考察无机盐对菌株发酵产γ-氨基丁酸性能的影响。

发酵条件同

（1）。

（5）培养基组成优化

根据上面实验所确定的氮碳源和无机盐，采用L16（34）正交实验对培养基的整体组成进行优化。

2.2.5发酵条件优化

采用优化配方培养基进行菌株的发酵培养。

改变发酵培养条件如初始pH值、温度、时间、摇床转速等以考察这些因素对菌株产γ-氨基丁酸性能的影响。

3结果与分析

3.1发酵液中γ-氨基丁酸的含量测定

将初筛的诱变菌进行摇瓶发酵实验，采用分光光度法测定发酵液中γ-氨基丁酸含量。

测定发酵液中γ-氨基丁酸含量的标准曲线见图2。

根据此标准曲线确定菌株发酵液中GABA含量。

表1标准γ-氨基丁酸溶液的吸光度

Table1TheA640ofstandardGABA

γ-氨基丁酸（g/L）

A640

0.25

0.361

0.50

0.656

0.75

1.010

1.00

1.439

1.25

1.750

1.50

2.114

1.75

2.482

2.00

2.813

图2γ-氨基丁酸标样标准曲线

Fig2ThestandardcurveofGABA

3.2培养基的优化

3.2.1碳源对菌体发酵的影响

（1）不同碳源的影响

培养基中不同碳源对菌株发酵的影响见表2。

实验结果表明，不同碳源对菌株发酵有一定的影响。

其中葡萄糖作为碳源时，发酵液中γ-氨基丁酸含量相对较高，所以采用较为常用的葡萄糖作为主要碳源。

表2碳源对菌体产γ-氨基丁酸的影响

Table2EffectofcarbonsourceontheGABAproductioninfermentationbrothofstrain

碳源

γ-氨基丁酸含量（g/L）

葡萄糖

1.011

麦芽糖

0.897

蔗糖

0.825

乳糖

0.851

果糖

0.926

（2）葡萄糖浓度的影响

图3结果显示，葡萄糖浓度对菌株发酵生产也有影响。

葡萄糖浓度为3%时，发酵液中γ-氨基丁酸含量最高。

实验中发现葡萄糖浓度为1%时，菌株生长较慢。

因此诱变菌株高产γ-氨基丁酸的优化培养基中葡萄糖的适宜浓度为3%。

图3葡萄糖浓度对菌体产γ-氨基丁酸的影响

Fig3EffectoftheconcentrationofglucoseontheGABAproductioninfermentationbrothofstrain

3.2.2有机氮源对菌株发酵的影响

（1）不同有机氮源的影响

实验结果表明，不同有机氮源对菌株发酵生产γ-氨基丁酸有影响（见表3）。

以蛋白胨作为有机氮源时，发酵液中γ-氨基丁酸含量最高。

因此选择蛋白胨为有机氮源。

表3有机氮源对菌体产γ-氨基丁酸的影响

Table3EffectoforganicnitrogensourcesontheGABAproductioninfermentationbrothofstrain

有机氮源

γ-氨基丁酸含量（g/L）

牛肉膏

0.761

酵母膏

0.826

蛋白胨

1.199

尿素

0.534

（2）蛋白胨浓度的影响

蛋白胨浓度对菌体发酵产γ-氨基丁酸性能的影响结果见图4。

蛋白胨浓度为3%时，发酵液中γ-氨基丁酸含量最高，所以确定培养基中蛋白胨浓度为3%。

图4蛋白胨浓度对菌体产γ-氨基丁酸的影响

Fig4EffectoftheconcentrationofpeptoneontheGABAproductioninfermentationbrothofstrain

3.2.3无机氮源对菌株发酵的影响

（1）无机氮源种类的影响

以3%蛋白胨为有机氮源，在培养中添加无机氮源，发酵液中γ-氨基丁酸含量提高，其中硫酸铵的影响最大。

因此发酵培养基中以蛋白胨和硫酸铵为复合氮源（表4）。

表4无机氮源对菌体产γ-氨基丁酸的影响

Table4EffectofinorganicnitrogensourcesontheGABAproductioninfermentationbrothofstrain

无机氮源

γ-氨基丁酸含量（g/L）

硫酸铵

1.453

磷酸铵

1.403

氯化铵

1.386

硝酸铵

1.398

（2）硫酸铵浓度的影响

硫酸铵浓度对菌体发酵产γ-氨基丁酸性能的影响结果见下表。

硫酸铵浓度为0.2%时，发酵液中γ-氨基丁酸含量最高，所以确定发酵培养基中添加0.2%的硫酸铵。

表5硫酸铵浓度对菌体产γ-氨基丁酸的影响

Table5Effectoftheconcentrationof（NH4）2SO4ontheGABAproductioninfermentationbrothofstrain

硫酸铵浓度（%）

γ-氨基丁酸含量（g/L）

0.1

1.393

0.2

1.484

0.3

1.427

0.4

1.415

0.5

1.385

3.2.4无机盐对菌体发酵的影响

（1）无机盐种类的影响

考察了KH2PO4、MgSO4、CaCl2、NaCl对菌株发酵生产γ-氨基丁酸的影响，结果如表6所示。

几种无机盐均能不同程度的提高发酵液中γ-氨基丁酸的含量。

其中KH2PO4的效果最明显。

表6无机盐对菌体产γ-氨基丁酸的影响

Table6EffectofinorganicsaltontheGABAproductioninfermentationbrothofstrain

无机盐

γ-氨基丁酸含量（g/L）

KH2PO4

1.601

MgSO4

1.543

CaCl2

1.501

NaCl

1.497

（2）KH2PO4浓度的影响

KH2PO4浓度对菌体发酵生产γ-氨基丁酸的性能有一定的影响，但影响的幅度不大（表7）。

表7KH2PO4浓度对菌体产γ-氨基丁酸的影响

Table7EffectoftheconcentrationofKH2PO4ontheGABAproductioninfermentationbrothofstrain

KH2PO4浓度（%）

γ-氨基丁酸含量（g/L）

0.1

1.605

0.2

1.613

0.3

1.598

0.4

1.598

0.5

1.602

3.2.5培养基组成的优化

根据上面实验所确定的氮碳源及无机盐，对培养基的整体组成进行优化，采用L16（34）正交实验，因素和水平设计如表8所示，实验结果如表9、10所示。

表8正交设计表

Table8orthogonalexperi