超声波提取野菊花总黄酮及含量测定.docx

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超声波提取野菊花总黄酮及含量测定

毕业设计（论文）

2011届

题目超声波提取野菊花

总黄酮及含量测定

专业制药工程

学生姓名李明艳

学号07092206

指导教师肖莉

论文字数

完成日期20年月日

湖州师范学院教务处印

超声波提取野菊花总黄酮及含量测定

07092206李明艳

（湖州师范学院生命科学学院，湖州313000）

摘要：

本实验主要利用超声波提取技术提取野菊花中的总黄酮，用有机溶剂乙醇提取野菊花总黄酮的工艺路线，对所提取的总黄酮进行验证，并用分光光度计法测定其含量。

在单因素提取的基础上，采取正交优化试验，探讨乙醇体积分数、液料比、提取时间对野菊花总黄酮提取工艺的影响，结果表明，影响野菊花总黄酮超声提取的主要因素为提取时间，其次为液料比、乙醇体积分数。

最佳提取工艺条件为乙醇体积分数60％，液料比25:

1，提取时间80min，测得野菊花总黄酮为5.62%。

在优选的工艺条件下进行提取，并利用紫外可见分光光度法对野菊花总黄酮的含量进行测定。

该提取工艺简单，易操作。

关键词：

野菊花，总黄酮，超声波，提取

Extractionoftotalflavonoidsfromchrysanthemumbyultrasonicandcontentdetermination

07092206LiMingYan

（SchoolofLifeScience，HuzhouTeachersCollege，Huzhou313000）

Abstract：

Thisexperimentusingultrasonictechnologytoextracttheflavonoidinwildchrysanthemum.Thisprocessrouteisusingorganicsolventofethanoltoextracttheflavonoidsinwildchrysanthemum,toverifytheextractingflavonoids,anditscontentdeterminedbyspectrophtometry.Onthebasisofsinglefactorextractionorthogonaltestbetaken.TheoptimumextractionparametersoftotalflavonoidsfromChrysanthemumindicumbyultrasonicwereinvestigatedincluding,theratioofliquidandmaterial,extractiontime．Itwasfoundthattheordersofparametersaffectingextractionefficiencywereextractiontime，theratioofmaterialandliquidandalcoholcontent.Theoptimalextractionconditionswereobtainedasfollowed：

alcoholcontent60％,theratioofliquidandmaterial25:

1andtime80min．Undertheseconditions,thecontentofflavonoidsreached5.62％.Extractionintheoptimalprocessconditions,andusedtheUltravioletspectrophotometryfordeterminationthecontentoftheflavonoidinwildchrysanthemum.Theextractionprocessissimpleandeasytooperate.

Keywords：

chrysanthemumindicum；totalflavonoids；ultrasonic；extraction

1引言1

1.1野菊花简介1

1.1.1野菊花物化性质

1.1.2野菊花药理作用

1.1.3野菊花的临床应用

1.1.4野菊花的不良反应

1.2黄酮类化合物1

1.2.1黄酮类化合物简介

1.2.2黄酮类化合物的理化性质

1.2.3黄酮类化合物的药理活性

1.3超声波简介3

1.3.1超声波提取技术

1.3.2超声波提取的原理

1.3.3超声波提取的优点

1.4野菊花总黄酮提取方法研究概况4

1.4.1热水提取法

1.4.2有机溶剂提取法

1.4.3碱液提取法

1.4.4微波辅助提取法

1.4.5超声波辅助提取法

1.4.6大孔树脂吸附法

2材料与方法5

2.1实验材料5

2.1.1试剂与仪器

2.2实验方法的确定5

2.2.1对照品及对比实验溶液的制备

2.2.2标准曲线的制作

2.2.3供试液含量的测定

2.2.4对比实验结果分析

2.3实验方法与评价指标7

2.3.1实验具体操作方法

2.3.2实验评价指标

3实验结果与讨论7

3.1提取中主要影响因素的确定7

3.1.1乙醇体积分数对总黄酮含量的影响

3.1.2乙醇体积对总黄酮含量的影响

3.1.3超声波提取时间对总黄酮含量的影响

3.2正交实验设计10

3.2.1考察因素及水平

3.2.2试验与结果

3.2.3小结

3.3稳定性考察（验证实验）11

4总结与展望12

4.1总结12

4.1.1溶剂的选择

4.1.2实验方法的选择

4.1.3实验流程

4.1.4各实验条件确定

4.1.5实验条件优势

4.2展望12

参考文献13

致谢15

1引言

1.1野菊花简介

1.1.1野菊花物化性质

野菊花为菊科植物野菊（ChrysanthemumindicumL）、北野菊（ChrysanthemumborealeMak）或岩香菊（ChrysanthemumlavandulaefoliumFisch／Mak）的头状花序[1]，别名为野黄菊花、苦薏、山菊花、甘菊花。

野菊花头状花序类球形，直径1.5~2.5cm，棕黄色。

总苞片4～5层，外层苞片卵形或卵状三角形，长2.5~3mm，外表面中部灰绿色或淡棕色，常被有白毛，边缘膜质；中层苞片卵形；内层苞片长椭圆形。

总苞基部有的残留总花梗。

舌状花l轮，黄色，皱缩卷曲，展平后，舌片长l~1.3cm，先端全缘或2~3齿；筒状花多数，深黄色，气芳香，性味微寒，味苦、辛。

现代药理研究证明：

野菊花富含萜类和挥发油[2]、黄酮类化合物以及绿原酸等。

野菊花尚含有山萮酸甘油酯、棕榈酸、多糖[3]、β-胡萝卜素、蛋白质、氨基酸、嘌呤、胆碱、水苏碱、鞣质、维生素、叶绿素等成分。

另外，不同品种和产地的野菊花都含有人体必需的多种微量元素，而且B、Ca、Mg、Fe的含量比菊花中的高。

1.1.2野菊花药理作用

⑴抗病原微生物作用[4,5]野菊花水提物和挥发油都具有抗菌的活性。

⑵对心血管系统的作用[6]野菊花黄酮具有明显的心脏保护作用。

⑶具有降压作用[7]有一定的降压效果而且降压作用缓慢、持久，是较理想的降血压药物。

⑷对血小板聚集的影响对血小板聚集功能有较强的抑制作用和解聚作用。

⑸抗炎和免疫作用[8,9]野菊花提取物和挥发油都有显著的抗炎、免疫抑制作用。

⑹具有良好的解热作用研究表明野菊花注射液具有良好的解热效果。

1.1.3野菊花的临床应用

目前野菊花具有散风清热、消炎解毒、平肝明目、祛痰止咳、理气止痛、凉血止血、抗菌、抗病毒等功效[10]，临床多用于治疗各种急慢性感染性疾病（包括急慢性呼吸道感染、泌尿生殖系统感染、急性乳腺炎、急性淋巴管炎以及急性感染性肝炎等疾病），亦用于治疗肿瘤、高血压病和高脂血症，以及对感冒、流行性脑膜炎的预防。

此外，野菊花煎液口服或外用治疗皮肤痈毒疖肿疗效显著[11]。

1.1.4野菊花的不良反应

野菊花对心脏、肝肾功能无明显影响，除偶有呕吐现象、胃部不适、食欲减退，肠鸣泄泻等症状，注射剂偶可引起腹泻，阴道后穹窿注射时，有一定刺激作用。

临床不良反应少见。

慢性给药亦无蓄积中毒现象。

1.2黄酮类化合物

1.2.1黄酮类化合物简介

黄酮类化合物广泛分布于植物界，而且生物活性多种多样，引起了国内外的广泛重视，菊花中含有的黄酮类化合物主要包括黄酮及其苷、黄酮醇及其苷，是菊花药用的重要活性部位。

黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环（A-与B-环）通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮（如图1-1）。

黄酮类化合物结构中常连接有酚羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等官能团。

此外，它还常与糖结合成苷。

多数科学家认为黄酮的基本骨架是由三个丙二酰辅酶A和一个桂皮酰辅酶A生物合成而产生的。

经同位素标记实验证明了A环来自于三个丙二酰辅酶A，而B环则来自于桂皮酰辅酶A。

图1-12-苯基色原酮化学结构式

目前发现菊花中所含的黄酮类化合物有香叶木素、木犀草素、芹菜素、香叶木素7-O-β-D-葡萄糖、木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷、金合欢素7-O-β-D-葡萄糖苷、刺槐苷、金合欢素7-O-（6-O-乙酰）-β-D-葡萄糖苷、金合欢素、山奈酚和异泽兰黄素。

1.2.2黄酮类化合物的理化性质

黄酮类化合物多为结晶性固体，少数为无定型粉末。

黄酮类化合物的颜色与分子中存在的交叉共轭体系及助色团（-OH、-CH3）等的类型、数目及取代位置有关。

一般来说，黄酮、黄酮醇及其苷类多呈灰黄至黄色，查尔酮为黄色至橙黄色，而二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮类等因不存在共轭体系或共轭很少，故不显色。

花色素及其苷元的颜色，因pH的不同而变，一般呈红（pH<7）、紫（7<8.5）、蓝（pH>8.5）等颜色。

黄酮苷元一般难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂，易溶于稀碱液。

黄酮类化合物的羟基糖苷化后，水溶性相应加大，而在有机溶剂中的溶解度相应减少。

黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、吡啶等溶剂，难溶于乙醚、三氯甲烷、苯等有机溶剂。

黄酮类化合物因分子中多有酚羟基而呈酸性，故可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中。

1.2.3黄酮类化合物的药理活性

⑴心血管系统活性[12-14]

不少治疗冠心病有效的中成药均含黄酮类化合物，研究发现芦丁、槲皮素、葛根素以及人工合成的立可定（recordil）等均有明显的扩冠作用；槲皮素、芦丁、金丝桃苷、葛根素、灯盏花素、葛根总黄酮、银杏叶总黄酮对缺血性脑损伤有保护作用；金丝桃苷、水飞蓟素、木犀草素、沙棘总黄酮对心肌缺血性损伤有保护作用；银杏叶总黄酮、葛根素、大豆苷元等对心肌缺氧性损伤有明显保护作用。

此外，沙棘总黄酮、苦参总黄酮、甘草黄酮（主要为甘草素和异甘草素）具有抗心律失常作用。

⑵抗菌及抗病毒活性

木犀草素、黄岑苷、黄岑素等均有一定的抗菌作用；槲皮素、二氢槲皮素、桑色素、山柰酚等具有抗病毒作用；从菊花、獐牙菜中分离得到的黄酮单体对HIV病毒有较强抑制作用，大豆苷元、染料木素、鸡豆黄素A对HIV病毒也有一定抑制作用。

⑶抗肿瘤活性

黄酮类化合物的抗肿瘤机制多种多样[15]，如槲皮素的抗肿瘤活性与其抗氧化作用、抑制相关酶的活性、降低肿瘤细胞耐药性、诱导肿瘤细胞凋亡及雌激素样作用等有关；水飞蓟素的抗肿瘤活性与其抗氧化作用、抑制相关酶活性、诱导细胞周期阻滞等有关。

⑷抗氧化自由基活性[17,18]

大多数黄酮类化合物均有较强的抗氧化自由基作用，是一类极具开发前景的天然有机抗氧化剂[16]，而黄酮类化合物的一些药理活性也往往与其抗氧化自由基相关[12-14]。

⑸抗炎[19]、镇痛活性

芦丁、羟基芦丁、二氢槲皮素等对角叉菜胶、5-HT及PGE诱发的大鼠足爪水肿、甲醛引起的关节炎及棉球肉芽肿等均有明显抑制作用；金荞麦中的双聚原矢车菊苷元有抗炎、解热、祛痰等作用；金丝桃苷、芦丁、槲皮素及银杏叶总黄酮等有良好的镇痛作用。

⑹保肝活性

水飞蓟素对中毒性肝损伤、急慢性肝炎、肝硬化等有良好的治疗作用；淫羊藿黄酮、黄岑素、黄岑苷能抑制肝组织脂质过氧化、提高肝脏SOD活性、减少肝组织脂褐素形成，对肝脏有保护作用；甘草黄酮可保护乙醇所致肝细胞超微结构的损伤等。

⑺其他

此外，大量研究表明黄酮类化合物还具有降压、降血脂、抗衰老、提高机体免疫力、泻下、镇咳、祛痰、解痉及抗变态等药理活性[12-14]。

1.3超声波简介

1.3.1超声波提取技术

超声波是指频率为20千赫~50兆赫左右的电磁波，它是一种机械波，需要能量载体－介质来进行传播。

超声波在传递过程中存在着的正负压强交变周期，在正相位时，对介质分子产生挤压，增加介质原来的密度；负相位时，介质分子稀疏、离散，介质密度减小。

也就是说，超声波并不能使样品内的分子产生极化，而是在溶剂和样品之间产生声波空化作用，导致溶液内气泡的形成、增长和爆破压缩，从而使固体样品分散，增大样品与萃取溶剂之间的接触面积，提高目标物从固相转移到液相的传质速率。

在工业应用方面，利用超声波进行清洗、干燥、杀菌、雾化及无损检测等，是一种非常成熟且有广泛应用的技术。

超声波提取（也称为萃取）以其提取温度低、提取率高、提取时间短的独特优势被应用于中药材和各种动、植物有效含量的提取[20]（包括提取植物中的生物碱、苷类、生物活性物质、动物组织浆的毒质等[21-23]），是替代传统工艺方法实现高效、节能、环保式提取的现代高新技术手段。

1.3.2超声波提取的原理

超声波提取中药材的优越性，是基于超声波的特殊物理性质。

主要是主要通过压电换能器产生的快速机械振动波来减少目标萃取物与样品基体之间的作用力从而实现固—液萃取分离。

⑴加速介质质点运动。

高于20KHz声波频率的超声波的连续介质（例如水）中传播时，根据惠更斯波动原理，在其传播的波阵面上将引起介质质点（包括药材重要效成分的质点）的运动，使介质质点运动获行巨大的加速度和动能。

质点的加速度经计算一般可达重力加速度的二千倍以上。

由于介质质点将超声波能量作用于药材中药效成分质点上而使之获得巨大的加速度和动能，迅速逸出药材基体而游离于水中。

⑵空化作用。

超声波在液体介质中传播产生特殊的“空化效应”，“空化效应”不断产生无数内部压力达到上千个大气压的微气穴并不断“爆破”产生微观上的强大冲击波作用在中药材上，使其中药材成分物质被“轰击”逸出，并使得药材基体被不断剥蚀，其中不属于植物结构的药效成分不断被分离出来。

加速植物有效成份的浸出提取。

⑶超声波的振动匀化（Sonication）使样品介质内各点受到的作用一致，使整个样品萃取更均匀。

中药材中的药效物质在超声波场作用下不但作为介质质点获得自身的巨大加速度和动能，而且通过“空化效应”获得强大的外力冲击，所以能高效率并充分分离出来。

1.3.3超声波提取的优点

适用于中药材有效成份的萃取，是中药制药彻底改变传统的水煮醇沉萃取方法的新方法、新工艺。

与水煮、醇沉工艺相比，超声波萃取具有如下突出优点：

⑴提取效率高：

超声波独具的物理特性能促使植物细胞组织破壁或变形，使中药有效成分提取更充分，提取率比传统工艺显著提高达50~500%；

⑵提取时间短：

超声波强化中药提取通常在24~40分钟即可获得最佳提取率，提取时间较传统方法大大缩短2/3以上，药材原材料处理量大；

⑶提取温度低[22]：

超声提取中药材的最佳温度在40~60℃，对遇热不稳定、易水解或氧化的药材中有效成分具有保护作用；

⑷常压提取，安全性好，操作简单易行，维护保养方便；

⑸适应性广：

超声提取中药材不受成分极性、分子量大小的限制，适用于绝大多数种类中药材和各类成分的提取；

⑹超声波萃取对溶剂和目标萃取物的性质（如极性）关系不大。

因此，可供选择的萃取溶剂种类多、目标萃取物范围广泛；

⑺减少能耗。

由于超声萃取无需加热或加热温度低，萃取时间短，因此大大降低能耗；

⑻提取药液杂质少，有效成分易于分离、纯化；

⑼提取工艺运行成本低，综合经济效益显著；

⑽操作简单易行，设备维护、保养方便。

1.4野菊花总黄酮提取方法研究概况

目前提取总黄酮的方法有：

热水提取法、有机溶剂提取法、碱液提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法、大孔树脂吸附法等[21]。

1.4.1热水提取法

由于该方法成本低廉，目前，国内厂家对野菊花总黄酮的提取多采用沸水提取法，其提取条件因素已各有不同[22]。

1.4.2有机溶剂提取法

黄酮苷、黄酮苷元均易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，根据这一原理进行有机溶剂提取法。

1.4.3碱液提取法

黄酮类化合物因分子中多有酚羟基而呈酸性，故可溶于碱性水溶液。

此法就是根据这一原理对野菊花黄酮类化合物进行提取的。

1.4.4微波辅助提取法

微波是一种超高速电磁波，具有很强的穿透作用，使植物细胞中的水分或有机溶剂迅速升温升压，细胞壁穿孔，使成分从细胞中溶出，而且微波电磁场使分子运动短时间内加剧，从而缩短了提取时间，提高了提取率。

所以微波提取法与常规方法相比具有高效性和强选择性，操作简便，产率高，副产物少，产物易于纯化等[26-28]。

此法已广泛应用于多种天然产物的提取，但对野菊花中黄酮类化合物微波提取工艺鲜见报道。

1.4.5超声波辅助提取法

近年来，超声技术应用于提取植物中的生物碱、苷类、生物活性物质、动物组织浆的毒质等研究已有报道，表明其具有能耗低、效率高、不破坏有效成分的特点。

很多研究表明，利用超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，可加速植物材料中的有效成分进入溶剂。

从而增加有效成分的提取率，缩短提取时间，并且还可避免高温对提取成分的影响。

但超声技术应用于提取野菊花中黄酮类物质的研究报道较为少见。

1.4.6大孔树脂吸附法[29,30]

该方法是将菊花提取液经树脂上柱、洗脱、收安洗脱液、浓缩、干燥，获得纯化的菊花总黄酮。

该方法以乙醇为溶剂，既价廉又无毒。

用该方法纯化菊花提取物，其总黄酮转移率可达95%以上，纯化物总黄酮含量可达65%以上，且重现性好，树脂可重复使用。

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1试剂与仪器

⑴试剂

所需试剂如下表2-1所列：

表2-1所需的试剂

名称

级别

产地

菊花

乙醇

亚硝酸钠

硝酸铝

氢氧化钠

芦丁标准品

蒸馏水

95%

分析纯

浙江

安徽安特生物化学有限公司

上海振欣试剂厂

杭州萧山化学试剂厂

中国药品生物制品检定所

实验室制备

⑵仪器

所需的仪器如小标2-2所列：

表2-2所需的仪器

仪器名称及型号

生产公司

WK-200B高速药物粉碎机

FA1104型电子天平

UV-1800PC型紫外可见分光光度计

智能恒温电热套

KQ-100B型超声波清洗器

RE-52A旋转蒸发仪

循环水式多用真空泵

各种玻璃仪器

青州市精诚机械有限公司

上海良平仪器有限公司

上海美谱达仪器有限公司

郑州长城科工贸易有限公司

昆山市超声仪器有限公司

上海亚荣生化仪器厂

昆山市超声仪器有限公司

宁波市化学有限公司

2.2实验方法的确定

2.2.1对照品及对比实验溶液的制备

⑴对照品溶液配制

由于芦丁和黄酮类化合物均是以2-苯基色原酮为母核的结构，具有相同的吸光度测试性质，均于510nm处有最大吸收峰，所以采用芦丁为对照品测定野菊花中总黄酮的含量。

精确称取经120℃干燥至恒重的芦丁对照品25mg，置50mL容量瓶中，加乙醇适量，使充分溶解，放冷，用乙醇稀释至刻度，摇匀。

精密量取20mL，置50mL容量瓶中，用水稀释至刻度。

摇匀，所得溶液每lmL含芦丁对照品0.2mg。

⑵对比实验溶液的配制

①野菊花预处理

取适量野菊花60℃干燥5h，取出粉碎成细粉。

放入干燥瓶中备用。

②加热回流提取法溶液的配制

准确称取1.000g菊花粉末于100mL烧杯中，加入40％乙醇30mL，浸泡24h，50℃加热回流1h，减压抽滤，弃滤渣，滤液加40%的乙醇定容于100mL容量瓶中，精密量取5mL，置25mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为待测液。

③超声波提取法溶液的配制

准确称取1.000g菊花粉末于100mL烧杯中，加入40%乙醇30mL，浸泡24h，在超声波温度为50℃的条件下，提取1h，减压抽滤，弃滤渣，滤液加40%的乙醇定容于100mL容量瓶中，精密量取5mL，置25mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为待测液。

2.2.2标准曲线的制作

精密量取芦丁对照品溶液3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL、7.0mL，分别置于25mL容量瓶中，加5％亚硝酸钠溶液1.0mL，摇匀，放置6min，加10％硝酸铝溶液1.0mL，摇匀，放置6min，加氢氧化钠试液10.0mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min，以相应的试剂溶液为空白，于UV-1800PC型紫外可见分光光度计上进行全波长扫描，得最大吸收波长λmax=510nm，按分光光度法，在510nm处测定吸光度。

应用最小二乘法将芦丁标准液浓度与吸光度值做一元线性回归分析，由MicrosoftExcel获得回归曲线。

结果见图1。

图2-1芦丁吸光度与浓度标准曲线

以对照品溶液浓度C和吸光度A进行线性回归，得回归方程A=0.0127C+0.0098，其中R2=0.9996，可知线性关系良好。

线性范围为8.465～67.384μg/ml。

2.2.3供试液含量的测定

精密吸取各供试品液2mL于25mL容量瓶中，按照标准曲线方法进行操作，显色，在510nm波长处测定吸光度A，由标准曲线方程计算样品中总黄酮的含量。

2.2.4对比实验结果分析

经测量及计算分别得加热回流提取法、超声波提取法吸光度值及总黄酮含量。