973课题的结题总结报告-农业.doc

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国家重点基础发展规划项目

课题结题总结报告

项目编号：

G1998010200

项目名称：

农作物资源核心种质构建、重要新基因发掘与有效利用研究

首席科学家：

贾继增张启发

课题编号：

G1998010207

课题名称：

水稻抗病基因克隆

课题负责人：

翟文学

子课题负责人：

翟文学彭开蔓（王石平）

承担单位：

中国科学院遗传所，华中农业大学

电子信箱：

wxzhai@,

swang@

2003年9月30日

一、计划任务完成情况

本课题的预期目标是分离克隆2个水稻抗病基因。

我们已经按计划开展了研究工作，分别对水稻抗白叶枯病基因Xa3、Xa4、xa5、xa13、Xa25（t）和Xa26以及抗稻瘟病相关基因进行了克隆研究。

目前已克隆并证实了Xa26基因；已克隆Xa4和xa5基因，即将证实其功能；精细定位了Xa3、xa13和Xa25（t）基因；获得了3个抗稻瘟病相关基因。

基本达到预期研究目标。

具体工作与取得的进展如下:

1.精细定位了水稻抗白叶枯病基因Xa4和Xa26

我们利用F2大群体，分别对水稻抗白叶枯病基因Xa4和Xa26进行了遗传分析和精细遗传定位。

这两个基因都位于第11号染色体的长臂末端并紧密连锁。

涉及Xa4基因（Sunetal.,2003,Theor.Appl.Genet.106:

683-687）和Xa26基因（Yangetal.,2003,Theor.Appl.Genet.106:

1467-1472）遗传分析的工作已发表。

2.分离克隆了水稻抗白叶枯病基因Xa26

我们采用图位克隆法从水稻品种明恢63中分离克隆了Xa26基因（专利申请号：

02139212.9）。

序列分析发现这该基因编码LRR受体激酶类蛋白质。

研究还发现，无论是在苗期还是成株期携带Xa26基因的转基因水稻的抗谱比Xa26基因的供体水稻品种（明恢63）的抗谱显著增宽，抗性明显增强，说明遗传背景可能影响抗病主效基因的作用。

分离克隆Xa26基因的工作正在发表印刷之中（Sunetal.,2003,PlantJ.,inpress）。

另外，研究还发现携带抗白叶枯病基因Xa3的近等基因系IRBB3和携带抗白叶枯病基因Xa22（t）的云南地方稻品种扎昌龙也携带Xa26基因。

因为Xa3和Xa22（t）基因也被他人定位于第11号染色体长臂末端，推测Xa26、Xa3和Xa22（t）是同一个基因，这部分验证工作正在进行之中。

3.分离克隆了水稻抗白叶枯病基因Xa4

我们采用图位克隆法从水稻近等基因系IRBB4中分离克隆了Xa4基因（专利申请号：

02139257.9）。

序列分析发现这该基因也编码LRR受体激酶类蛋白质。

Xa4和Xa26属于同一个基因家族的不同成员。

抗性分析发现发现籼稻品种特青和93-11与IRBB4的抗谱相同，序列分析发现特青和93-11也携带Xa4基因。

转基因初步实验结果显示遗传背景可能也影响Xa4基因的抗性。

目前，这部分工作正在完善之中。

4.分析了Xa4和Xa26所属基因家族的进化

Xa4和Xa26基因所属家族（命名：

Xa26基因家族）包括10个成员。

我们对水稻品种明恢63和特青包含Xa26基因家族的大约100kb区段进行了测序，对比公共数据库中的水稻品种日本晴和93-11的同源区段的序列，分析了抗病基因的进化模式。

涉及这部分工作的论文正在撰写之中。

5.鉴定并精细定位了一个水稻抗白叶枯病新基因Xa25（t）

在杂交水稻恢复系明恢63中鉴定了一个新的抗白叶枯病显性基因Xa25（t）。

该基因在苗期和成株期都能特异性的抗白叶枯病菌生理小种PXO339。

通过分析携带Xa25（t）基因的重组自交系群体，将该基因定位于水稻第12号染色体的着丝粒区。

在该着丝粒区段已经定位了多个水稻抗稻瘟病基因，推测Xa25（t）基因与抗稻瘟病基因紧密连锁或等位。

涉及Xa25（t）基因的研究工作已发表（Chenetal.,2002,Phytopathology92:

750-754）。

6.构建了水稻全生育期平衡化cDNA文库

利用水稻品种明恢63，构建了全生育期平衡化cDNA文库。

该文库由水稻不同生长时期和不同生理状态下的15种不同组织的cDNA组成，包括白叶枯病菌和稻瘟病菌接种诱导后的组织。

该文库包含大约62,000个克隆，平均插入片段为1.4kb（Chuetal.,2003,ChineseScienceBulletin48:

229-235）。

对该文库中的大约4万个cDNA克隆进行了测序，获得两万多个非重复EST序列。

利用该文库我们建立了高效cDNA芯片（包括cDNAarray和cDNAmicroarray）分析体系。

7.发展了一种新的EST聚类方法

我们发展了一种新的计算机分析方法，用于分析大规模EST测序中所产生的大量数据，以获得高质量、非重复表达序列。

该方法在聚类过程中采用MEGABLAST工具对一致序列进行序列同源比较，并用phrap程序对每一EST簇进行拼接检验。

这一聚类策略能降低测序错误带来的影响，有效识别基因家族成员，并避免选择性剪接的干扰。

与NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）的UniGeneclustering方法相比，ESTClustering的聚类结果可以更好地反映表达序列的多样性。

涉及这部分工作的论文已经发表（张利达等，2003,遗传学报30:

147-153）。

8.克隆获得了一批水稻抗性基因同源序列

利用植物NBS－LRR类抗性基因的高度保守区设计PCR引物从水稻基因组中扩增同源序列，经克隆测序确定后获得了23个不同的NBS片段（称为抗性基因同源序列，简记为RS）。

将这些RS序列在窄叶青/京系17的重组自交系（RIL）构建的分子图谱上定位，定位结果表明它们分布在1，3，4，7，8，9，10和11染色体。

其中10个RS位于已知R基因所在的染色体区间。

这些RS标记可以作为图位克隆同一位点上相应抗病基因的起点。

有关结果已发表（Zhengetal，2001,CIENCEINCHINA（SeriesC）,44（3）:

253-262）。

9．构建了含Xa4、xa5和xa13三个抗性基因的IRBB56基因组BAC文库

利用含Xa4、xa5和xa13三个水稻白叶枯病抗性基因的累加系IRBB56构建了一个水稻细菌人工染色体文库。

该文库包含55296个克隆，平均插入片段为132kb。

按水稻基因组为450Mb计，该文库覆盖14倍基因组，筛选出任一水稻基因或序列的概率为99.99％。

用均匀分布的3个叶绿体基因和4个线粒体基因克隆作探针筛选文库，结果显示该文库中含细胞器基因组DNA同源序列的克隆数小于1％。

用分布于水稻3条不同染色体、分别与Xa4、xa5和xa13连锁的DNA标记筛选文库，分别检测出11--106个阳性克隆，为克隆这些基因打下了基础。

该文库对水稻基因组的高度覆盖率和较大的插入片段，非常适合于物理作图和基因的分离和克隆（王文明等，2001，遗传学报,28

（2）：

120－128；Wangetal.,2001,MolecularGeneticsandGenomics,265:

118-125）。

本研究中建立的提取高质量水稻基因组DNA方法和高效转化方法被成功地用于中国超级杂交稻测序（Science,2002,296:

79-92）。

10、克隆了一个NBS-LRR类抗性基因家族

用水稻抗白叶枯病基因Xa4的近等基因系和基因累加系对克隆的NBS-LRR同源序列RS13进行RFLP分析，发现序列RS13来自Xa4基因位点（Wangetal,2000,ChineseScienceBulletin,45（19）:

1779-1782）。

利用克隆的抗病同源序列RS13作为探针，从水稻IR64的BAC文库中筛选到4个阳性克隆，其中一个克隆14E19能够覆盖其余3个克隆。

对14E19进行了全序列测定和分析，获得了73kb的全长DNA序列，基因预测显示其上有4个编码NBS-LRR的基因，分别命名为NL-A－D。

同时,对近等基因系IRBB56同一基因组位置的BAC克隆106P13进行分析，发现其上有10个NL同源拷贝，其中有4个同14E19上的NL一样，说明NL是一个至少有10个成员（分别命名为NL-A—NL-J）的基因家族。

搜索日本晴、93-11、广陆矮4号的序列，发现三者也有多个高度同源的序列。

对NL基因进行RT-PCR和cDNA库筛选分析，发现NL-B能够在含抗白叶枯病基因Xa4水稻品系IRBB4中特异表达，说明NL-B参与了白叶枯病抗性反应。

把这些同源拷贝作为新的抗病基因进行研究，转基因实验正在证实这些同源拷贝的功能。

11、定位克隆了隐性抗白叶枯病基因xa5的候选基因

本研究利用RFLP、CAPS等标记方法对xa5近等基因系IR24和IRBB5构建的F2群体共5000个单株进行群体连锁分析，构建了xa5的精细遗传图谱。

在此基础上我们用与xa5基因紧密连锁的标记筛查含有xa5的水稻累加系IRBB56的BAC文库，构建了包含xa5基因位点的精细物理图谱（Zhongetal,ChineseScienceBulletin,inpress）。

将xa5限定在12kb的片段上，在此区间发现唯一一个候选基因，与已知抗病基因具有不同的结构。

该基因与显性等位基因编码的氨基酸序列有差异。

目前功能互补实验已获得转基因植株。

12．开展了抗白叶枯病基因Xa3和xa13的精细定位与图位克隆

本研究利用IR24与含Xa3基因的近等基因系IRBB3组合构建了约2000单株的F2定位群体，并利用国际水稻基因组和中国超级杂交稻基因组计划所公布的第11染色体长臂上的序列设计出一系列SSLP和CAPS标记，对Xa3进行精细定位，将Xa3基因定位于CAPS标记Y3和SSR标记RM144之间，距Y3约0.25cM，距RM144约1.0cM。

目前，我们又利用日本晴和IRBB3组合构建了约5000单株的F2群体，对Xa3基因作进一步精细定位。

利用xa13的近等基因系构建了包含4000单株的F2群体，将xa13基因界定在第8染色体80Kb的区间。

对这个区间进行DNA测序和基因预测，发现了可能的候选基因，正对这些候选基因进行共分离分析和功能互补分析，有望获得突破。

13、分离克隆了抗稻瘟病相关基因

本研究利用cDNA-AFLP和组池分离分析（BSA）相结合的方法来检测稻瘟病抗池和感池中特异表达的基因。

在大约20122个检测到的位点中，一共获得了12个差异表达的条带（DEBs），8个来自抗池，4个来自感池。

利用水稻的DH群体对它们进行遗传定位结果表明其中的5个DEBs，R1,R8,S9,S16和S17被定位在第一染色体的一个抗稻瘟病的QTL所在的区间。

序列分析和等位分析发现R1和S16，R8和S9分别来自二对等位基因位点，而且R1（S16），S17和R8（S9）分别位于第一染色体上三个紧密相连的BAC/PAC克隆中，这更进一步证实了R1（S16），S17和R8（S9）在第一染色体上QTL包含区间中的紧密连锁关系。

逆向NorthernBlotting和定量RT-PCR分析表明R1（S16），S17和R8（S9）在接种稻瘟病菌后的表达水平都是上调的，这暗示它们都参与了稻瘟病抗性反应过程。

有关结果已投送国际学术刊物。

二、研究水平与创新性

本研究是在基因的水平上发掘水稻的抗病种质，重点是克隆符合“基因对基因”假说的，以过敏性抗病反应为基础的水稻抗病基因。

已克隆的多种植物的抗病基因在序列结构上分为五种类型，而迄今正式见诸于报导的克隆的水稻抗病基因只有4个，即抗白