广防己配伍黄芪肾毒性的代谢组学研究.docx

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广防己配伍黄芪肾毒性的代谢组学研究

广防己配伍黄芪肾毒性的代谢组学研究

作者：

梁琦　谢鸣　倪诚　颜贤忠　张艳霞

【摘要】利用代谢组学技术研究大鼠口服广防己及其配伍黄芪水煎液后尿液代谢图谱的转变，探讨黄芪配伍广防己对肾脏的减毒作用。

［方式］雄性wistar鼠24只随机分为正常对照组、广防己组、广芪组，每组8只。

广防己组按kg，广芪组按kg灌胃给药，正常对照组灌服等体积蒸馏水。

持续给药4w后，搜集大鼠24h尿液，测定尿液1HNMR谱；取血做BUN、SCr检测；取肾脏行组织病理学检查。

［结果］给药4w时，广防己组BUN、SCr显著升高（P<），肾组织呈现明显的病理改变；广芪组SCr水平较广防己组明显降低（P<），肾组织病变范围及程度较广防己组轻。

尿代谢图谱经主成份分析表明，广防己组尿中柠檬酸、2酮戊二酸、马尿酸盐、葡萄糖含量降低；TMAO、肌酸·肌酐含量升高。

广芪组上述代谢物的转变呈不同程度地减小。

［结论］广防己给药4w可造成肾功能的明显损害，配伍黄芪有必然的对抗其损伤的作用。

【关键词】广防己；黄芪；中药配伍；肾毒性；代谢组学；核磁共振；模式识别

［Objective］StudythemetabonomicsprofileofintheurinesamplesofratdosedwithdecoctionsofAristolochiafangchiandit’scompatiblewithAstragaliradix.TofoundthattheinhibitioneffectonNephrotoxicityofAristolochiaefangchibycompatiblewithAstragaliradix.［Method］24MaleWistarratsweredividedtothreegroups,theGgroupwereadministratedbykg-1ofAristolochiafangchi,theGQgroupwereadministratedbykg-1ofAristolochiafangchicompatiblewithAstragaliradix,andthecontrolgroupbyequalvolumeofdistilledwaterfor4weeks.Onthe4thweekend,urinewascollectedandtheir1HNMRspectrawereacquired,andthensubjectedtodataprocessandprincipalcomponentanalysis（PCA,PLSDAorOSC）.Bloodbiochemicalanalysisandhistopathologicalexaminationwerecarriedout.［Results］TheBUNandSCrofGgroupweremarkedlyhigherthanthoseofthecontrolgroup（P<withpathologicalinkidney.MatchingwithAstragaliradixdecreasedtheSCr（P<andmitigatedthekidneypathologicalofGgroup,comparedtocontrolgroup,theurinaryconcentrationsofcitrate,2oxoglutarate,Hippurate,GlucoseinGgroupdecreased,whiletheTMAOandCreatinine/Creatineincreased.ThosechangesofmetabolitesinGQgroupwerelighterthanthatintheGgroup.［Conclusion］TheAristolochiafangchicaninducerenallesionasrevealedbythemetabonomicanalysisofraturinesamplesaswellasbloodbiochemicalanalysisandhistopathologicalexaminations.CompatiblewithAstragaliradixhassomeinhibitioneffectonrenaltoxicityofAristolochiaefangchi.

　　Keywords:

AristolochiaFangchi;Astragaliradix;compatibility;nephrotoxicity;metabonomics;nuclearmagneticresonace（NMR）;patternrecognition

在常规毒理研究的基础上，运用代谢组学技术手腕，比较观察了广防己及其配伍黄芪的肾毒性，以观察黄芪配伍广防己可能具有的减毒作用。

　　1材料

　　动物

　　SD大鼠，雄性，SPF级，体重（130±10）g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

北京中医药大学动物饲养房（屏障系统）饲养，自然明暗周期,室温24℃,湿度：

55％，动物提前1w购入，常规饲养，自由摄食、饮水。

　　药材

　　广防己购自广东省广州市中药材批发市场，黄芪购自北京同仁堂药材有限公司，均由北京中医药大学中药学院生药学系刘春生教授鉴定，广防己为马兜铃科广防己Aristolochiafangchiexet的干燥根。

采用HPLC方式测得马兜铃酸含量为g。

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus（Fisch.）mongholicus（Bge.）Hsiao的干燥根，HPLC方式测得黄芪甲苷g。

　　水煎剂

　　取广防己药材2000g，标记为药材a，另取广防己药材2000g，黄芪药材250g，归并标记为药材b。

别离将药材a、b别离置于提取罐中，加相当于药材10倍体积的冷水浸泡1h，加热至沸腾，煎煮1h，倾出药液，残渣加入9倍体积的水，煎煮1h后取药液，归并2次药液，过滤。

其中水煎剂a减压浓缩至2469ml药液，相当于1ml含生药，采用HPLC方式测得其马兜铃酸含量为ml；水煎剂b减压浓缩至2473ml药液，相当于1ml含生药，采用HPLC方式测得其马兜铃酸含量为ml。

二种水煎液均置4℃冷藏，备用。

　　仪器

　　VarianUNITYINOVA600兆超导脉冲傅里叶变换NMR谱仪,美国Varian公司产品；7020全自动生化分析仪,日今日立公司产品。

　　2方式

　　动物分组及处置

　　大鼠随机分为正常对照组、广防己组、广芪组三组，每组8只。

广防己组、广芪组动物均按1ml/kg给以相应药物灌胃，每日1次,持续给药4w。

正常对照组给予等体积蒸馏水。

给药期间,大鼠自由摄食、饮水。

于4w末，别离留取各组大鼠24h尿液，10%的水合氯醛麻醉处杀大鼠，取血浆及肾脏组织。

　　尿液搜集和处置

　　于动物处置前一天，采用代谢笼法，搜集24h尿液，留尿期间动物不摄食，自由饮水。

代谢笼集尿器置于冰上，加入1%NaN3溶液作为防腐剂。

对搜集的尿液进行定量，离心处置，取上清，置-70℃保留，备用。

　　血浆搜集与处置

　　离心制备血浆，全自动生化分析仪测定血尿素氮（BUN）和肌酐（SCr）水平。

　　数据处置

　　所得数据均用均数±标准差（x±s）表示，组间不同采用q查验，由统计软件处置。

　　肾脏病理学检查

　　各组大鼠肾脏用生理盐水冲净后，按HE常规制片，于光镜下观察。

　　代谢组学测定与分析

　　NMR测量前尿样预备

　　各组取5个尿液样本常温解冻，精密吸取300μl尿样，加入300μl缓冲液Na2HPO4/NaH2PO4,,混匀，13000rpm，10min离心，取上清500μl,添加30ul1%TSP；转入5mm样品管中进行测试。

NMR数据收集与分析：

数据在VarianUNITYINOVA600超导脉冲傅里叶变换NMR谱仪上收集。

采用有预饱和的1DNOESY脉冲序列，取如下参数：

谱宽7996Hz，混合时刻，弛豫延迟时刻2s，采样点数64000，累加次数64次；在弛豫延迟期间和混合时刻内采用预饱和方式抑制水峰，谱仪偏置设置在水峰的位置。

FID信号通过傅里叶变换转换为NMR图谱，所用窗函数为线增宽因子。

以TSP为化学位移参考峰的位置，并定为δ0。

利用VNMR软件的宏指令将数据进行FT变换，相位校正，基线校正。

将～范围内的谱图按每段进行分段并积分，同时排除以溶剂峰为中心的部份及包括尿素峰的部份～。

因柠檬酸受pH值影响较大，为保证分析结果一致，将柠檬酸积分δ与δ归并，标示为δ，将δ与δ归并，标示为δ，其余不变。

　　结果分析

　　将所产生的所有积分数据归一化，均以Excel文件格式贮存。

取得的数据文件利用SIMCA软件包（瑞典,UmetricsAB,Umea）进行PCA、PLSDA、OSC等模式识别分析。

　　3结果

　　广防己及其配伍黄芪给药4w大鼠BUN和SCr的转变

　　见表1。

表1给药4w时各组大鼠BUN、SCr的转变（略）

与正常对照组比较，**P<；与广防己组比较，●P<

　　广防己及其配伍黄芪给药4w时大鼠肾脏组织病理学转变

　　结果见图1。

镜下可见，给药4w时正常对照组大鼠肾小球球囊结构完整，无系膜细胞增生，肾小管结构清楚，肾间质无炎性细胞浸润（图1A）。

广防己组大鼠肾小球结构破坏明显，其囊壁与周围组织粘连，肾小管上皮细胞肿胀、溶解坏死，肾间质炎性细胞浸润（图1B）；广芪组大鼠肾间质炎性细胞浸润，肾小管上皮细胞肿胀、坏死，但较广防己组病变范围小、程度轻（图1C）。

　　广防己及其配伍黄芪给药4w时大鼠尿样1HNMR图谱及模式识别分析．

　　广防己及其配伍黄芪给药4w时大鼠尿样1HNMR图谱，结果见图2。

广芪组（GQ）大鼠尿液（u）1HNMR图谱

　　广防己及其配伍黄芪给药4w时大鼠尿样模式识别分析结果，结果见图3。

由图3能够看出，给药4w时，正常对照组、广防己组、广芪组大鼠尿液1HNMR图谱波峰PC积分值互不重叠，能够被区分开来，表明各组大鼠尿液代谢物存在不同。

结合图2能够看出，广芪组较广防己组接近正常对照组。

表明广防己组尿液代谢物较广芪组异样转变明显。

　　4讨论

本研究则在前期发觉广防己水提物按10倍药典高限剂量给药4w可造成大鼠肾脏组织明显病理改变［1］的基础上，进一步引入代谢组学技术，通过比较观察广防己与其配伍黄芪的肾脏毒性，探讨黄芪监制广防己毒副作用的内涵。

结果显示，广防己和广防己配伍黄芪二组给药4w时BUN、SCr较正常对照组均明显升高，肾组织出现不同程度的病理改变；较之广防己组，广芪组SCr明显降低，BUN无明显转变，肾组织病理改变减轻。

结果表明，实验剂量的广防己给药4w具有明显的肾毒性作用；配伍黄芪能减轻广防己的肾毒性，主要表现为对抗广防己的肾滤过功能损伤的作用。

本研究发觉，广防己给药4w尿代谢物出现明显转变，其中柠檬酸、2酮戊二酸、马尿酸盐、葡萄糖的下降，TMAO、肌酸/肌酐含量均升高。

结果提示，广防己对肾脏的损伤涉及到肾小管重吸收、肾小球及肾髓质功能。

广防己配伍黄芪可使广防己组中降低的马尿酸盐、葡萄糖，升高的肌酸/肌酐恢复正常；降低的柠檬酸、2酮戊二酸，升高的TMAO含量接近正常水平，表明黄芪有对抗广防己的肾损害作用。

【参考文献】

1］倪诚.广防己和粉防己及其配伍黄芪的效毒研究［D］.北京中医药大学博士研究生学位论文，2007.