熏肉中亚硝酸盐的测定设计实验报告.docx

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熏肉中亚硝酸盐的测定设计实验报告

一、实验题目：

熏肉制品中亚硝酸盐含量的测定

二、

1．摘要：

以α-萘胺为显色剂,利用紫外可见分光光度计,测定了广州市售的熏肉中亚硝酸盐的含量。

本实验进一步探究了实验的最佳条件:

最大吸收波长、参比溶液、酸度、显色剂的用量和显色时间。

结果表明:

pH值在3~4之间,参比溶液为去离子水时,显色剂用量为2mL/50mL试液,显色时间在15min时,显色稳定,样品吸光度达到最大值,实验能达到较理想的效果。

2．关键词：

熏肉;亚硝酸盐;紫外-可见分光光度法

三、引言

亚硝酸盐作为一种食品添加剂被广泛用于肉制品加工中。

它的发色、防腐、抗微生物作用至今仍无法用其它的物质所替代。

但它对于人体健康的危害是众所周知的。

为了有效的控制其毒性,检测其在食品中的残留量,目前常采用的测定方法主要有光度法、色谱法、电化学法。

其中光度法又分为盐酸萘乙二胺法、格里试剂比色法、催化光度法、紫外光度法；色谱法中有离子色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法；电化学法又分为示波极谱法、伏安法。

还有一些新的方法如化学发光法、荧光法、原子吸收光谱法等。

而分光光度法以其设备简单、操作快捷、灵敏度高、结果直观的优点,深受欢迎[1]。

本实验研究了以α-萘胺为显色剂,利用紫外可见分光光度计测定肉制品中的亚硝酸盐的含量的方法。

结果证明,此方法简单、快捷、准确,是一种食品检测的好方法。

1、光度法

1．1盐酸萘乙二胺法

在弱酸性溶液中，NO2-与对氨基苯磺酸反应生成重氮化合物后，再与盐酸萘乙二胺偶联生成紫红色的偶氮染料，用分光光度法在540nm处测定，与标准曲线比较定量。

1．2格里试剂比色法

GB5009．033—2003测定方法中，其中一种方法就是格里试剂比色法，其原理是在弱碱性条件下，用热水从样品中提取NO2-，然后用亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀蛋白，过滤后，在弱酸条件下，NO2-与对氨基苯磺酸发生重氮化后，再和N—1—萘基乙二胺耦合形成红色偶氮染料，最大吸收波长为538nm，所选择的显色剂不一样，最大吸收波长也有所不同。

针对卫生标准的规定和工艺的不同，以及检测过程中pH、温度、放置时间对显色的影响，在检测肉制品中NO2-时，格里试剂比色法的准确性和稳定性均高于盐酸萘乙二胺法。

另外用对氨基苯磺酰胺代替对氨基苯磺酸，其灵敏度、精密度均得到提高。

1．3催化分光光度法

主要原理是在一定的温度和酸性条件下，NO2-对KBO3氧化染料（或指示剂）而褪色的反应具有较明显的催化作用，且在一定NO2-的浓度范围内，吸光度变化与NO2-浓度成较好的线性关系，因此，可用该原理定量溶液中NO2-的浓度。

1．4紫外分光光度法

在稀盐酸介质中，NO2-与碱性品红发生重氮反应，用8—羟基喹啉作偶联剂，在弱碱性条件下，生成茶红色偶氮染料来定量测定NO2-含量。

光度法是测定NO2-的经典方法，其检测所需费用较低，灵敏度较高，不经分离可直接同时测定样品中NO3-和NO2-，具有较好的选择性，操作简便。

2、色谱法

2．1离子色谱法

主要原理是当淋洗液携带样品进入分离柱后，样品离子便与离子交换功能基的平衡离子争夺树脂的离子交换位置。

经过多次竞争达到交换平衡。

由于不同离子对树脂固定相的亲和力不同，通过淋洗液的不断淋洗，各种离子便先后从色谱柱上被洗脱下来，实现了分离。

通过检测器，即可经检测器检测各种离子，得到

一个个色谱峰，然后与标准进行比较，根据保留时间定性，根据峰面积或峰高定量。

用紫外检测离子色谱法对酱腌菜中的NO3-与NO2-进行定量分析。

样品经过超声提取后，以1.8mmol/LNaCO3及1.7mmol/LNaHCO3为淋洗液，经DIONEXIonpacAS4A—SC分析柱分离，于210nm处紫外检测。

该法可以采用其他类型的色谱柱进行分离，所用的检测器也可选用化学抑制型电导检测器（可大幅度降低淋洗液的电导值）。

离子色谱法所用的化学试剂较少，并且实验耗时相对来说较少。

2．2高效液相色谱法

食品中NO2-含量的重氮化耦合高效液相色谱法测定方法是将食品样品中蛋白质、脂肪除去后，NO2-与对氨基苯磺酸重氮化，再与N一1一萘乙二胺耦合之后，进行HPLC分析。

若采用反相高效液相色谱法一二极管阵列检测器法测定卤肉制品中NO3-及NO2-的含量，则该方法选择四丁基溴化铵作为离子对试剂，与NO3-和NO2-阴离子形成中性缔合物，在甲醇一混合磷酸盐流动相中，被非极性键合相柱（ODS）分离并定量检测。

该方法灵敏度高，并且样品中其他成分如色素、动物性蛋白等对检测不构成干扰。

2．3气相色谱法

在硫酸介质中，NO2-与环己基磺酸钠反应生成环己醇亚硝酸钠，环己醇亚硝酸钠在常温下成气态，顶空进样，用FID检测器进行检测。

该方法的取样量较少、简单快速，抗其他离子干扰的能力强，提高了灵敏度和准确度。

也可利用NO2-用KMnO4氧化为NO3-，用酸作催化剂，控制一定温度，使NO3-与苯发生反应生成硝基苯，萃取，然后利用选择性强的电子捕获检测器检测该生成物，从而测出样品中NO2-的含量。

3、电化学法

3．1示波极谱法

GB5009．033—2003测定方法中，另外一种方法是示波极谱法，试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸性的条件下，NO2-与对氨基苯磺酸重氮化后，在弱碱性条件下再与8—羟基喹啉耦合形成橙色染料，该染料在汞电极上还原产生电流，电流与NO2-的浓度呈线性关系，可与标准曲线比较定量。

3．2伏安法

伏安法是在酸性介质中以玻碳电极（GCE）为工作电极的铁氰化钾电催化还原亚硝酸盐的电化学行为及电分析方法。

当K3Fe（CN）6浓度一定时，电催化还原峰电流与NO2-浓度在4.0×10-7～1.0×10-4mol/L范围时有良好的线性关系，运用方波伏安法在优化条件下测定了水样中亚硝酸盐含量，测定结果令人满意。

4、原子吸收光谱

该方法是一种用原子吸收光谱法间接测定腌制食品和熏制食品中亚硝酸盐含量的方法.在酸性条件下,用高锰酸钾将食品中的亚硝酸盐先转化成二氧化锰沉淀,再用硫酸溶解沉淀,以原子吸收光谱法测定锰的吸光度,从而间接得到亚硝酸盐的含量,回收率在97.6%～105.2%之间.此方法简捷快速,适用于腌制食品和熏制食品中亚硝酸盐含量的测定.

目前，还有一些新的方法已应用于食品中NO2-含量的测定：

如化学发光法、荧光法、原子吸收光谱法等。

光度法所用仪器设备简单、价廉、灵敏度较高，具有实用性和可操作性。

由于NO2-在固体电极（如GCE，Au和Pt等）上氧化（或还原）一般需要较高的过电位，因而不易直接发生电化学氧化（或还原）反应，故电化学方法的使用范围不如光度法使用范围广。

荧光法、化学发光法、原子吸收光谱法等对仪器的要求较高。

综上所述我们选定紫外分光光度法来测定熏肉中亚硝酸盐的含量。

实验原理如下：

样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应生成重氮盐，此重氮盐再与α-萘胺试剂发生偶合反应，生成紫红色偶氮化合物，其最大吸收波长为547nm，可测定吸光度并与标准曲线比较定量。

反应式如下：

肉制品中亚硝酸盐含量==

（mg/kg）

式中：

X为由测得的吸光度计在标准曲线上对应的亚硝酸钠质量浓度（μg/mL）；m为样品质量（g）。

四、实验部分

㈠实验仪器和试剂

1、仪器

①菜刀一把、砧板一个，②UV1700紫外-可见分光光度计，③分析天平，台秤④1mL、2mL、5mL、20mL移液管各1支，⑤50mL烧杯6个，100mL烧杯1个，⑥25mL容量瓶1个，⑦500mL容量瓶4个，⑧50mL容量瓶8个，100mL容量瓶4个，⑨滤纸、过滤装置一套,⑩比色皿2个。

2、试剂

1亚铁氰化钾溶液：

称取10.6190克亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6·3H2O]溶于水，并稀释至100.00mL。

2乙酸锌溶液：

称取22.0克乙酸锌[Zn（CH3COO）2·2H2O]，加3mL冰醋酸溶于水，并稀释至100.00mL。

3饱和硼砂溶液：

5.0克硼酸钠（Na2BO4·10H2O）溶于100.00mL热水中，冷却备用。

420%的盐酸的配置：

量取225.6mL的37%的浓盐酸于500.00mL容量瓶中定容到刻度。

50.4%对氨基苯磺酸溶液（4g/L）：

称取2.0g对氨基苯磺酸溶于500.00mL20%盐酸中，避光保存。

60.2%α-萘胺溶液（2g/L）：

称取0.1g盐酸萘乙二胺，以水定容50.00mL，避光保存。

7亚硝酸钠标准溶液（200.6μg/mL）：

精确称取0.1003g于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠（优级纯），加水定容到500.00mL。

8亚硝酸钠标准溶液（5.015μg/mL）：

临用前，吸取此溶液2.5mL于100mL容量瓶中，用水定容到100.00mL。

㈡实验步骤

1、样品处理

1）把适量的熏肉依序放在砧板上，用菜刀剁碎。

2）称取经剁碎混合均匀的试样5g于50mL烧杯中，加入硼砂饱和溶液12.5mL，以玻璃棒搅和，继之以70℃左右重蒸馏水约300mL将其洗入500.00mL的容量瓶中，置沸水浴中加热15min，取出，一边转动，一边加入5mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5mL乙酸锌溶液以沉淀蛋白质。

冷却到室温，定容，摇匀，放置片刻，除去上层脂肪，过滤，弃去初滤液30mL，收集滤液备用。

2、实验条件的选择

1）最大吸收波长的确定

吸取浓度为5.015μg/m的亚硝酸钠标准溶液0.80mL,置于50.00mL容量瓶中,加2.0mL0.4%对氨基苯磺酸溶液,摇匀,静置3～5min,再加入2mL0.2%α-萘胺溶液,加水至刻度,混匀,静置15min,于1cm比色杯中,另以蒸馏水代替亚硝酸钠,用同样配制方法的溶液为空白。

在610nm—450nm之间进行扫描，得到最大吸收波长λmax=545nm。

波长/nm

450

460

470

480

490

500

510

520

530

535

吸光度

0.005

0.008

0.011

0.015

0.021

0.029

0.038

0.046

0.053

0.057

波长/nm

540

545

550

555

560

570

580

590

600

吸光度

0.059

0.059

0.059

0.058

0.056

0.049

0.039

0.026

0.014

实验结果曲线图分析：

实验结果表明：

反应生成的紫红色偶氮化合物在450—480nm波长范围内的吸收较小，小于0.020，而在540—550nm波长范围间取得最大吸收波长，在波长为550nm的波长后该偶氮化合物的吸光度又开始下降，故本方法选取545nm为实验中的最大吸收波长。

2）空白溶液的选择

分别对试剂空白（2.00ml对氨基苯磺酸溶液+2.00mlα-萘胺溶液）、5g氯化钠溶液分别加入50.00ml比色管中加水至刻度，在545nm处进行了吸光度测试。

各种溶液的吸光度测定值

溶液

试剂空白

氯化钠

去离子水

吸光度A

0.008

0.024

0.014

实验结果表明：

试剂空白在545nm下的吸光度最低，说明亚硝酸根与α-萘胺试剂的特征显色反应，在545nm波长下光度测定亚硝酸根的方法是合理的，而且该方法具有较好的选择性，实验说明试剂空白和去离子水的吸光度相差不大，对于实验的参比溶液的选择根据实验方便原则选择去离子水为参比溶液。

3）酸度的选取

因为亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应生成重氮盐的反应需要在弱酸条件下反应，实验中分别采用15%、20%、25%的盐酸溶液溶解对氨基苯磺酸，按上述条件测定试样的吸光度，探究酸度对显色反应的影响。

不同酸度对吸光度的影响:

盐酸含量

15%

HCl

２０％HCl

25%HCl

吸光度A

0.058

0.060

0.056

实验结果表明：

酸度对显色反应的影响并不是很明显，但是也有可能是因为，反应在稀释时PH值变化不明显导对显色反应的影响不明显。

实验中用20%的盐酸溶解对氨基苯磺酸测得的吸光度相对较大，所以选取20%的盐酸溶解对氨基苯磺酸。

3）显色剂用量的影响

α-萘胺作为亚硝酸根的显色剂，灵敏度很高，且在反应中显色剂的用量对反应有一定影响，在545nm下，用20%的盐酸溶解对氨基苯磺酸与亚硝酸钠反应，分别加入0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00ml的α-萘胺溶液进行吸光度的比较。

不同显色剂的用量对吸光度的影响:

显色剂用量（mL）

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

吸光度

0.060

0.063

0.063

0.065

0.064

0.065

实验结果表明：

随着显色剂用量的增加，吸光度逐渐升高，在显色剂用量达到2.00mL时，吸光度又下降，但是在显色剂增加到2.00mL时，吸光度又达到最大值0.065，故本实验选取50mL试液中加入2.0mLα-萘胺溶液。

4）显色时间的选取

显色时间影响显色反应效果，为防止紫红色重氮偶合物在放置过程中分解，或发生其他反应使吸光度测定结果不准确，本实验将同一份标液，从加入盐酸萘乙二胺试剂溶液时开始计算，分别静置不同时间后测定其吸光度。

不同放置时间对吸光度的影响:

时间（min）

0

5

10

15

20

25

吸光度A

0.060

0.062

0.063

0.065

0.064

0.064

实验结果表明:

刚加入时，因为显色剂还未与反应物完全反应，测得的吸光度明显较低，随着放置时间的加长，显色剂和反应物逐渐反应，吸光度逐渐增加，在放置时间为15分钟是吸光度达到最大值，但是在15分钟后略有下降并且趋于稳定，可能是因为生成物又进一步反应，但是该反应速率较慢，故其吸光度降低但是不明显。

故本实验选择显色反应时间为15分钟。

3、亚硝酸钠标准曲线的绘制

1用移液管精确吸取亚硝酸钠标准液（5.015μg/mL）0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.50，2.00mL于一组50.00mL容量瓶中，各加水至25mL，分别加2.00mL0.4%对氨基苯磺酸溶液，摇匀，静置3—5min后，各加入2.00mL0.2%α—萘胺溶液，并用水定容到50.00mL，摇匀。

2静置15min后，用1cm比色皿，用分光光度计在545nm波长下测定吸光度，以蒸馏水为空白。

以测得的各比色液的吸光度对应的亚硝酸浓度作曲线。

比色液中亚硝酸钠浓度为0～0.30μg/mL时，两者呈线性关系。

标准溶液测定结果:

本实验中测得的线性相关系数R2=0.9998，线性相关性强，实验中配制的标准溶液浓度较准确，实验结果具有一定的可信度。

加入的NaNO2标准溶液浓度的体积

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.50

2.00

NaNO2标准溶液浓度（ug/mL）

0.00

0.020

0.040

0.060

0.080

0.100

0.150

0.201

吸光度A

0.008

0.021

0.036

0.051

0.066

0.081

0.119

0.155

4、亚硝酸盐的测定

取20mL待测液于25mL容量瓶中，加1mL0.4%对氨基苯磺酸溶液，摇匀。

静置3～5分钟后，加入1.0mL0.2%α—萘胺溶液，定容，摇匀,静置15min。

比色测定，记录吸光度。

根据标准曲线方程算得相应的亚硝酸钠浓度（μg/mL），计算试样中亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）的含量。

五、实验结果与讨论：

1.本次实验探究结果显示，用紫外分光光度法并以α—萘胺溶液为显色剂测定熏肉中亚硝酸盐的含量的最佳条件是:

最大吸收波长545nm，以20%的盐酸为酸度调节剂（溶液最后PH值约为3-4）比较合适，显色剂用量为每50.00mL试液用2.00mL比较合适，显色时间为15分钟比较合适。

由于使用了亚硝酸盐的特效试剂α-萘胺为显色剂,成功的避免了实验中其它阴阳离子的影响,实验能达到较理想的效果。

2.本次实验中，配制标准溶液得到的标准曲线的线性相关系数R2=0.9998，线性相关性强，故而实验中配制的标准溶液浓度较准确，实验结果具有一定的可信度。

3.样品中亚硝酸盐含量测定结果

样品

熏肉

质量（g）

5.001g

吸光度A

0.030

未知样亚硝酸盐含量ug/mL

0.032

熏肉中亚硝酸盐的含量mg/kg

4.0

从本次实验来看，实验中所用熏肉的检验结果（亚硝酸盐含量为0.004g/kg）来看符合国家标准及肉制品中亚硝酸盐添加量<0.05g/kg,残留量<0.03g/kg，所以该类熏肉可以放心食用，对市民健康影响不大，但是最好别长期食用，虽然说熏肉中亚硝酸盐含量在国家要求的合理范围内但是长期大量食用，亚硝酸盐在人体内累积仍会对我们的健康有所损害。

且本次实验测定结果仅供参考，因为测定的熏肉试样溶液并非无色溶液，而是呈淡黄色，该有色物质可能对亚硝酸盐含量有一定影响，故测定结果的准确性有待进一步研究。

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