高通量筛选方法与应用..pptx

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图1高通量筛选示意图,Experimentalproblem,Generationoftheworklist,Preparationofsamples,Fabricationofthespecimen,Incubation,Detection,Analysisandreporing,Loadingofthebio-chips,Preparationofdataanddisseminationofinformation,Gatheringandprocessingofinformation,Inspectionbymeansofsoftware,图2高通量筛选系统15年的发展情况,高通量筛选特点,每一个检测仅需微量的样品高通量筛选具有较高的特异性由同一化合物用不同模型筛选的活性数据，以及由对同一模型不同化合物的活性数据归纳出的结构活性关系，可以为药物发现等过程提供极为有价值的信息每天可以对数十甚至数百块微孔板进行分析，对数千乃至数万的样品进行检测,高通量筛选系统组成,高通量筛选检测方法,图3体外生化检测方法,体外生化检测,均相检测,异相检测,放射性检测,非放射性检测,SPA微粒,SPA微孔板,显色反应检测,吸收光检测,荧光检测,微粒方法检测,放射性检测,非放射性检测,过滤方法检测,吸收方法检测,沉淀方法检测,放射免疫,ELISA检测,高通量检测方法,细胞水平检测,均相检测,异相检测,微生物检测,哺乳动物细胞检测,放射性检测,非放射性功能检测,混合检测,放射性检测,非放射性检测,过滤方法检测,细胞毒性和细胞增殖检测,放射免疫,ELISA检测,存活检测,生长/生长抑制检测,双杂交检测,报告基因检测,报告基因检测,图4细胞水平检测,2、高通量筛选常用技术,生物芯片,生物芯片技术通过微加工和微电子技术在固体芯片表面构建微型生物化学分析系统，即通过缩微技术将生命科学研究中许多不连续的分析过程集成于硅片、玻璃片或陶片等固相密质载体上，形成生物分子点阵，在待分析样品中的生物分子与生物芯片的探针分子发生相互作用后，对作用信号进行检测和分析。

将生命科学研究中所涉及的许多分析步骤，利用微电子、微机械、化学、物理技术、传感器技术、计算机技术，使样品检测、分析过程连续化、集成化、微型化。

样品处理,目标分子富集,转录,文库准备,扩增,标记,芯片制作,配体点阵及固定化,检测,放射显影光化学电化学活性酶促反应,数据处理,综合信息分析,分子间反应或杂交,洗涤,图5生物芯片分析步骤,微孔板/微阵列技术,微孔板技术的发展主要表现在板孔数的增加。

目前，使用最多的是96孔及384孔板，也有人使用1536孔、3456孔、甚至9600孔板。

微阵列技术是将微孔板技术进一步微型化。

化合物微阵列芯片技术与基于微珠体的固相组合会成技术相结合为高通量药物筛选带来了一条新的途径，将对高通量药物筛选技术的发展产生积极的影响。

微流控芯片技术,以毛细管为基础技术发展起来的芯片毛细管电泳，即现在的微流控芯片由于具有高通量、大规模、平行性等特点，在化学合成、新药筛选和开发等领域日趋活跃。

这一技术可以大规模地比较各种合成路线和条件，筛选催化剂和药物有效成分，检测病原体、微生物的耐药性，这样就省略大量的合成初步试验和动物实验，从而加快了新化合物和药物研究开发进程。

分子阵列技术,小分子阵列（smallmoleculemicroarrays,SMMs），又称化学阵列（chemicalmicroarrays）、化合物阵列（chemicalcompoundmicroarrays），是一种高通量、小型化的筛选工具。

它将化合物直接固定在载体表面，用靶标蛋白或者抗体与其作用。

小分子阵列在小分子和蛋白质相互作用的研究、新药的发现以及临床检测等方面有着广泛的用途。

小分子阵列制备,

（1）体的很

（2）行须（3）不同结构和官能团,体释放以后必须能够位点专一地连接到修饰的表面。

样地点；与,用于和修饰后的载

（1）要根据被固定的反应的带有特殊官能团分子化合物的特点对各种小分子化合物必须表面进行修饰；容易地固相合成；

（2）用机器人自动加与小分子化合物进器将小分子样品均匀选择性反应的官能团必在载体表面进行连接容易地连接到固体表面；（3）加入特异性蛋白,其结合；,进行检测。

三个标准,制备流程小载体,的小分子化合物从图固6体小分载子的制备流（程4）用荧光标记的抗体,荧光检测方法荧光强度分析法（FIA）,优缺点该方法操作简便，适于微量化。

但是由于测定的是总的荧光强度，待测化合物的自身荧光和内滤效应可能会干扰测定的结果，但这种干扰又很难被消除掉。

荧光偏振检测法（FP）,原理依据荧光强度的变化进行检测，如：

在荧光生成检测法及荧光淬灭弛豫检测法中，反应后荧光强度增加；在荧光淬灭检测法中，荧光强度减弱。

一种均相检测技术，其定量依据是在特定的条件下，FP信号与荧光分子的大小正相关。

可用于研究溶液中分子之间相互作用。

荧光共振能量转移检测法（FRET）,FRET指荧光供体受激发后，不发射出光子而将激发的能量转移到荧光受体的现象。

可检测生理状态下相互作用分子之间的距离。

主要用于淬灭分析或淬灭向光分,FP作为一种均相检测方法，反应试剂简单，读数方便，反应速度快，很快就能达到平衡，易于自动化。

FP检测只需一个示踪物，由于测定结果是一个比值，外界干扰、荧光强度及有色化合物均不会影响检测结果。

但也有局限性，不同的荧光素具有不同的荧光寿命，在极化荧光实验中，如果荧光素的荧光寿命太短，则在此荧光寿命内标记荧光素的荧光基团可能没有足够的时间达到旋转松弛时间，导致标记物的起始极化值太高而在一些实验的应用中受到限制。

产生FRET需要满足3个条件：

荧光供体和受体之间距离接近（110nm）；供体的发射光谱与受体的激发光谱有重叠；供体和受体之间迁移偶极子的方向平行。

均相时间分辨荧光检测法（HTRF/LANCE）,HTRF是基于镧系元素如铕（Eu）、钐（Sm）、镝（Dy）等具有较长荧光寿命的特点发展而来的。

该法可以对酶的动力学参数及其抑制剂抑制机制做出形象的描述,荧光报告系统,HTRF/LANCE方法所用的试剂安全稳定，可用微孔板进行检测，且易于自动化，非常适合HTS。

其局限性在于如果无法使用常规的标记试剂，则相互作用的两个生物分子必须直接结合到供体和受体上，这一点比较复杂和困难；另一局限在于供体和受体的选择范围有限。

具有较好的特异性和稳定性。

荧光激活细胞分选技术促进了带有特异序列的核酸内切酶快速有效的筛选。

然而，除非绿色荧光蛋白是非常高表达或密集的本底化荧光信号，GFP将不可避免地受到内源性细胞或媒体荧光污染，而且有的时候荧光报告检测检出限较高。

荧光关联光谱（FCS）,用荧光关联光谱可以对微量、样间差异大、亲和力低的样品进行有效的检测和分析，实现高通量筛选。

然而，该法并不适用于高浓度荧光或高背景荧光，如有时全细胞中荧光背景高。

荧光成像分析,利用基因融合可以很容易地检测到受体或配体门控性离子通道的激活对大量基因在转录水平上的影响。

报告基因构件中含有可诱导控制报告基因表达的反应元件。

一个通常无活性的强启动子受到受体激活调控反应元件的控制，并被融合到报告蛋白的编码区。

FCS是一种新的统计物理的分析技术，是从分子复合物中处于不规则运动状态的荧光分子中获取定量信息。

FCS可以监测纳升体积中微小浓度分子间的相互作用，运用均相技术可以在纳米范围内检测溶液中细胞表面或细胞中的分子间相互作用，是很有潜力的检测技术。

荧光成像技术的特点是酶标板上所有孔（96、384、1536孔）的数值能由CCD照相机同时读取，在亚秒时间范围内就可以记录动态变化。

酵母双杂交,a.诱饵的真核生物蛋白在酵母这种真核生物中更有可能正确折叠和进行翻译后修饰；,b.酵母细胞体内进行，无需蛋白质的分离、纯化等步骤，,所证实的蛋白质间相互作用在一定程度上代表了细胞内的真实情况；,c.可检测存在于蛋白质之间微弱或暂时的相互作用；d.整个过程仅需基因操作，方法简便、灵敏、高效,图7酵母双杂交系统示意图UAS：

上游活化序列；Promoter：

启动子；Reportgene：

报告基因；Transcription：

转录。

优点,细菌双杂交,图8细菌双杂交系统示意图Bait：

诱饵；Target：

靶蛋白；operator：

操纵子；RNAP：

RNA聚合酶；PlacZ：

lacZ启动子。

a.研究周期短，操作更加简单、快速；b.细菌的转化效率显著高于酵母细胞，更有利于筛选大文库，发现可能的稀有蛋白质作用对；优点c.诱饵和靶蛋白不需要核定位信号；d.细菌与高等真核生物之间具有更大的进化距离，可以避免由酵母内源蛋白所引起的假阳性和假阴性现象，同时也显著降低真核生物蛋白在报告菌株中的毒性作用，以及减少自激活阳性率。

噬菌体展示技术,噬是序并体化反保量,菌体展示技术是一种噬菌体表面表达筛选技术，其原理以噬菌体为载体，将外源核酸片段（一组随机多肽编码列或基因群）克隆至噬菌体外壳蛋白基因中形成融合，以融合蛋白的形式表达于噬菌体表面，众多融合型噬菌便组成了噬菌体展示库。

随后，将噬菌体过柱，用固定的靶分子去筛选与之亲和的噬菌体。

通过与特定的靶标应，不能结合的噬菌体被洗脱掉，而能结合的噬菌体被留下来并通过感染大肠杆菌得以扩增和富集，实现高通筛选。

3、高通量筛选的应用,3.1药物筛选3.1.1反酵母双杂交系统药物筛选模型3.1.2基于细胞的药物筛选模型3.1.3基于动物的药物筛选模型,3.2蛋白质定向进化3.2.1噬菌体展示技术3.2.2核糖体展示技术,3.3其他用途,是在酵母双杂交技术基础上发展起来的药物筛选方法,特定启动子操纵的荧光素酶报告基因；G蛋白偶联受体

（1）建立目的蛋白质基（因GP的CR）-FLIPRtm-Ca2+反,突变体文库;

（2）通过应合体适系的；3.2.3蛋白质定向进化的筛其选他系技统，术快速地从（突3变）体转运蛋白-放射性标记配文库中筛选出符合目基标摄的取蛋系统。

白质。

方法,优点,酵母双杂交,真核生物蛋白可能正确折叠和进行翻译后修饰仅需基因操作，无需蛋白质分离、纯化等步骤可检测蛋白质之间微弱或暂时的相互作用表型和基因型有机结合，可直接获得基因,细菌双杂交,缺点蛋白质相互作用定位于核内，常产生假阳性和假阴性不能研究具有自激活特性的蛋白质以及能与酵母细胞内进化保守蛋白相互作用的蛋白质表达的蛋白质缺乏翻译后修饰，结果存在假阳性和假阴性不能研究具有自激活特性的蛋白质,研究周期短，操作简便、快速仅需基因操作，无需蛋白质分离、纯化等步骤细菌转化效率高，利于筛选大文库，发现稀有蛋白质相互作用对表型和基因型有机结合，可直接获得基因可避免由酵母内源蛋白引起的假阳性和假阴性增加了双杂交筛选的覆盖率和准确率,酵母/细菌相结合的双杂交噬菌体展示技术,蛋白质芯片,适合于研究膜蛋白、转录因子和调节因子筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性表型和基因型有机结合，可直接获得基因快速、