DPPH法测定胡萝卜素的抗氧化活性.docx

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DPPH法测定胡萝卜素的抗氧化活性

摘要-1-

Abstract-2-

第一章绪论-3-

1.1果蔬的主要抗氧化活性物质-3-

1.1.1茄红素-3-

1.1.2类黃酮-3-

1.1.3花青素-4-

1.2果蔬抗氧化作用机理-4-

1.3果蔬抗氧化活性的评价方法-5-

131Rancimat法对果蔬提取物进行抗氧化活性研究-5-

1.3.2卩-胡萝卜素-亚油酸乳化液氧化法-5-

1.3.3二苯代苦味酰基自由基（DPPH）法-6-

1.3.4硫代巴比妥酸反应物（TBAS）值法-7-

1.3.5FRAP（ferricreducing/antioxidantpowerassay）法-7-

1.4本研究的意义和内容-7-

141本研究的意义-7-

1.4.2本研究的内容-8-

第二章实验材料和内容-9-

2」材料与仪器-9-

2.1.1实验材料-9-

2.1.2实验仪器-9-

2.1.3试剂-9-

2.2实验内容-9-

2.2.1胡萝卜素的提取-9-

2.2.2在DPPH体系中测定抗氧化性-10-

第三章实验结果与讨论-12-

3」胡萝卜素提取液的抗氧化性-12-

3.2卩-胡萝卜素的抗氧化性-12-

3.3茶多酚的抗氧化性-13-

3.4维生素C的抗氧化性-14-

3.5维生素E的抗氧化性-15-

第四章结论-17-

展望-18-

参考文献-19-

致谢-21-

附录-22-

DPPH法测定胡萝卜素的抗氧化活性

摘要：

胡萝卜中含有大量的卜胡萝卜素，摄入人体消化器官后，可以转化成维生素A,是目前最安全补充维生素A的产品。

本文中将新鲜胡萝卜打碎并冷冻干燥后浸提得到胡萝卜素，蒸发浓缩至89.15pg/ml。

用DPPH・法测左胡萝卜素的抗氧化活性，对DPPH・自由基的淸除率为55.07%。

比较提取的胡萝卜素与卜胡萝卜素、维生素C、维生素E、茶多酚标准样品对DPPH-自由基的淸除率，结果表明：

它们都具有抗氧化活性，提取的胡萝卜素对DPPH•自由基的淸除能力一般，而维生素C、茶多酚的抗氧化活性都很强。

关键词：

胡萝卜素；1，1•二苯代苦味酰基自由基（DPPH・）：

抗氧化性

-1-

AntioxidantactivityofcaroteneassayedbyDPPH・method

Abstract：

Carrotscontainlargeamountsofp-carotenewhichintakebyhumandigestivesystem,canbeconvertedintovitaminA,iscurrentlythemostsecureproductsofvitaminAsupplementation.Inthisarticleweextractcarotenefrombrokenfreeze-driedfreshcarrot,andconcentratedbyevaporationto89.15pg/ml・TheantioxidantactivitywasassayedbyusingtheDPPH・method,andtheDPPH・radicalscavengingratewas55.07%・ComparingtheclearanceratetofreeradicalsmDPPH*ofextractedcaroteneandstandardsampleofbeta-carotene,vitaminC,vitaminE,polyphenols,itwasfoundthattheyallhaveantioxidantactivity,andtheabilityoftheclearanceratetofreeradicalsinDPPH・wasordinarytotheextractedcarotene,whiletheantioxidantactivitywashightothevitaminCandpolyphenols,respectively.

Keywords:

carotene;1,1-diphenyl-2-pierylhydrazy（DPPH）;antioxidantactivity

・2・

第一章绪论

I.1果蔬的主要抗氧化活性物质

果蔬中含有许多不同的抗氧化物质，可清除含氧自由基，这些物质除了维生素E（生育酚）、维生素C（抗坏血酸）、卩-胡萝卜素、类胡萝卜素外，最近的研究发现番茄红素（lycopene）x类黄酮（Flavonoids）、花青素（anthocyanin）及儿茶素（Catechin）等可能含有更高的抗氧化活性。

II.1茄红素

茄红素在红番茄、西瓜及红葡萄等中较丰富，其中以红番茄的含量最高（50-90mg/kg）,其构成为一个特殊的长链分子，含13个双键，是类胡萝卜素中双键含量最高的。

这一构造使其具有比卩-胡萝卜素及其类胡萝卜素更强的清除自山基及终止单线态氧活性的能力。

其顺式异构物的吸收比反式更容易2）流行病学研究显示患有膀胱及胰腺癌患者，其血浆中茄红素含量较低。

在一个为期7年包括4.8万人为对象的实验中，发现摄入来自番茄食品的茄红素可减少前列腺癌，其他的类胡萝卜素则无相关性。

"'Kohlmeier等测试两组男性脂肪样品中的类胡萝卜素，认为茄红素是最强的心脏保护指标。

⑶

1丄2类黄酮

果蔬中的类黃酮主要包括黃酮（Flavones）、黄烷酮（Flavanones）、黃酮醇（Flavonols）、黄烷醇（Flavanols）、异黄酮（Isoflavones）以及花青素配基（Anthocyanidins）等，通常以糖昔形式存在。

⑷据估计，美国人每天类黄酮的摄入量大于100mg/人，荷兰人为25.9mg/人，主要来源为茶（61%）、洋葱（13%）及水果（10%）o⑷类黃酮的抗氧化机制包括去除自山基及活性氧分子；利用螯合能力抑制金属离子，与蛋口质形成复合物，还原氧化的维生素E或维生素C以显示加乘效果。

类黃酮可以经山螯合方式连结一个或二个铜原子而抑制含铜酶如抗坏血酸氧化酶、多酚氧化酶等。

⑴不同类型的果蔬都含有其特殊的类黃酮,如柑桔类主要是黃烷酮；葡萄则属黄烷醇，主要为儿茶素及表儿茶酚。

⑴Crozier利用HPLC探讨季节、品种及烹煮对番茄、洋葱、芹菜及萬苣中类黄酮含量的影响，结果显示樱桃番茄含有13-203mg/kg鲜重的懈皮酮，一般番茄只有2.1-1lmg/kgo洋葱的桝皮酮含量为185-634mg/kg,品种间差异较少，季节性差异较大。

烹煮会减少洋葱及番茄中榔皮酮含量。

不同萬苣品种撇皮酮含量差异十分明显，变幅为11-91lmg/kgo芹菜所含两种黄酮Luteolin（40mg/kg）及Apigen（191mg/kg）亦受品种差异影响含量。

⑹

-3-

1丄3花青素

花青素是属于黄酮家族的天然色素，广泛存在于水果、蔬菜之中。

西方人常吃的葡萄其加工产品可能是花青素的最重要来源。

花青素为水溶性，与糖类形成糖昔。

Wang等探讨14种花青素的抗氧化活性发现Kuromanin（cyanidin-3-glucoside）S性最高，约为维生素E的3.5倍。

"I桑柩含有大量的矢车菊素（cyanin）及花翠素（dlephinin）,其萃取液可用于治疗微血管疾病以及维持正常的血管渗透性，亦可防止胆固醇引起的动脉硬化。

⑻不同品种葡萄所含总酚类物质的差异相当大，从口色及浅色葡萄的169-272mg/L到深色葡萄的497-1215mg/L。

山于深色葡萄品种的黃酮类物质含量较高，其抗氧化活性也较口色及浅口色葡萄为高。

因此，红葡萄酒对LDL氧化的抑制效果也比口葡萄酒高出许多。

⑼Saito等最近发现葡萄的萃取液及其所含的Procyanidin具有防止胃溃疡的生理功能。

冋究其原因可能在于Procyanidin低聚合物具有清除自山基的抗氧化活性，可使胃壁不受自山基引起的伤害；同时Procyanidin可与蛋白质紧密结合而具保护胃壁的功能。

•3'Larrauri研究证明，干燥温度对葡萄皮中多酚含量及抗氧化活性有一定影响，温度愈高,酚类物质及抗氧化活性降低愈明显。

⑴）

1.2果蔬抗氧化作用机理

研究表明，山活性氧引发的自山基会使人体内的脂质与蛋口质发生链式氧化反应。

这些自由基寻找生物分子的不饱和位点进行进攻，对有机分子产生一些不应有的修饰和损伤，这些大分子有蛋白质、碳水化合物、脂类物质和核酸。

如果在正常细胞代谢中产生的自山基的量超过了保护机能所能承受的限度，就会引起细胞代谢的紊乱，导致细胞膜、组织、酶和基因的损害，以至发生衰老或疾病。

ZiRosenbtrgZ指出柑橘（Cites）类水果及黃绿色蔬菜富含抗氧化维生C、维生素E和胡萝卜素，能够预防白内障的发生。

有研究认为萬笋（Asparaguslettuce）叶中富含黄酮类和多酚类物质，能够增强胃液和消化液分泌，增进胆汁分泌。

李绍家和刘风书等口1指出滇橄榄（Phyllanthusemblica）富含维生素C,并含有18种氨基酸和人体必需的多种常量元素和微量元素。

老年人饮用滇橄榄汁2个月后，血液中红细胞超氧化物歧化酶（SOD）活力提高1.3倍，血浆中脂质过氧化物（LPO）含量下降11%。

因此，不少学者认为，水果蔬菜防治衰老和老年性疾病可能源于其抗氧化作用。

现归纳如下：

（1）清除活性氧自曲基。

已有大量证据证明，水果蔬菜均有一定的清除氧自由基的能力，这可能是其抗氧化作用的第一道防线。

（2）增强抗氧化酶活性。

水果蔬菜可通过增强抗氧化酶活性而保护机体免受氧化损伤。

主要证据有：

黃刺玫果汁可增强大鼠血GSH-Px活力；卷心菜可提高小鼠肝谷胱甘肽还原酶（GR）及谷胱甘肽硫转移酶（GST）活力；大蒜可增加啮齿动物脑和肝中GST和SOD活性；能提高SOD活性的水果蔬菜还有芥蓝、胡萝卜、灯笼椒、西番莲、狒猴桃、刺玫果、余甘果等。

（3）阻断脂质过氧化链式反应，减少膜脂质过氧化损伤。

不少水果蔬菜可抑制过氧化产物MDA及脂褐素的生成，如沙棘、芥蓝、胡萝卜、灯笼椒、刺玫果、山楂、余甘果、西番莲等。

杨琦等研究证实，沙棘能够增加大鼠红细胞膜疏基含量，提高大鼠红细胞膜Na+-K+-ATP酶活力。

喂饲含花菜的混合饲料后，大鼠结肠粘膜GSH水平明显升高,并呈现剂量效应。

⑷减少DNA损伤。

自由基学说认为，过剩的自由基可以攻击DNA,引起DNA损伤，从而引发多种疾病。

对果蔬抗氧化作用的研究LI前已有个别深入到DNA分子水平。

Stohs等对卷心菜的研究表明，喂饲含卷心菜的饲料可明显减少老年小鼠DNA单链断裂。

问

13果蔬抗氧化活性的评价方法

自从果蔬抗氧化活性对于预防癌症、心血管疾病以及抗衰老等方面有很重要的生理功能被提出后，研究果蔬抗氧化活性已成为热门课题。

果蔬抗氧化活性的评价方法也随着科学技术的发展和设备的更新而不断地发展和改变。

这里简单介绍儿种LI前常用的评价方法及其采用这些方法所得的研究结果。

1.3.1Ranciinat法对果蔬提取物进行抗氧化活性研究

Rancimat法测果蔬提取物的抗氧化活性是使用Rancimat脂肪酸败测定仪来测定的。

其工作原理为：

在高温条件下通入空气使油脂发生氧化作用，将氧化产生的挥发性小分子醛、酮、酸等物质用硅胶管导入盛有蒸镭水的试管内，使蒸馆水的电导率随时间而变化。

用计算机记录试管内水的电导率变化情况，然后再讣算出电导率对时间变化曲线二次导数的最大值，可得出油脂氧化初期一诱导期的数值。

同时与空口对照组比较，就可得出抗氧化剂的保护系数。

然后，以保护系数比较抗氧化剂的抗氧化活性。

杨安树等I⑹采用Rancimat法对藜蒿（Artemisiaselengensis）提取物的抗氧化活性进行了探讨。

他们的研究表明：

藜蒿提取物对油脂具有明显的抗氧化作用且具有剂量效应关系；在乳化体系中提取物的抗氧化效果比在油体系中强；提取物与丁基瓮基屮苯（BHT）和没食子酸丙酯（PG）相比较，提取物浓度达0.10%时，抗氧化活性超过0.02%BHT,而小于0.02%PG；柠檬酸、酒石酸、抗坏血酸对藜蒿提取物表现出较强的协同增效作用。

1.3.2B■胡萝卜素•亚油酸乳化液氧化法

-5-

0-胡萝卜素是一种多烯色素，易被氧化而褪去黄色。

在反应介质溶液中，由亚油酸氧化产生的过氧化物等能使卩-胡萝卜素漂口，随时间的延长吸光度越来越小。

当以吸光度对时间作图时可得到一条下降曲线。

不同原料的溶剂提取物，按其抗氧化活性的大小不同而使卩-胡萝卜素漂口的速度各异。

抗氧化能力越强，吸光度下降越慢。

因而不同的曲线有不同的斜率。

抗氧化能力越强的，曲线斜率绝对值越小。

洪庆慈等M以卩-胡萝卜素漂口法测定8种粮食材料提取物的抗氧化活性，并比较各提取物的抗氧化活性的I苛低。

他们的实验结果表明，大麦（Hordeumvulgare）籽和燕麦（Avenasativa）籽的石油瞇提取物都有较高的抗氧化活性，而稻壳和花生壳的石油瞇提取物只有微小的抗氧化活性。

而8种粮食的屮醇提取物都具有一定的抗氧化活性，其中以花生壳、稻壳和黃豆壳提取物的抗氧化活性比较强。

VonGadow«>«i用卩-胡萝卜素掺入实验测定抗氧化活性，实验时在亚油酸中加入卩-胡萝卜素，随着亚油酸氧化产物的产生，卩-胡萝卜被氧化，在两者共存的体系中，加入用氧饱和的蒸憎水以加速氧化。

在470nm处测吸光度，根据吸光度值的变化判断抗氧化活性。

田迪英等㈣利用卩-胡萝卜素-亚油酸乳化液氧化法对杭州市场上常见的41种果蔬进行了抗氧化活性的研究，并测定其总酚的含量。

他们的实验结果表明：

大多数果蔬具有一定的抗氧化活性，其中香椿（Toonasinensis）、藜蒿、萬笋叶、水芹（Oenanthejavanica）等抗氧化活性较强，其总酚含量也较高，说明果蔬抗氧化活性的强弱与果蔬所含的酚类物质有一定的关联性。

这为以后天然抗氧化剂的提取和制备提供了一定实验数据。

1.3.3二苯代苦味酰基自由基（DPPH・）法

DPPH•在有机溶剂中是一种稳定的自山基，其结构中含有3个苯环，1个氮原子上有1个孤对电子，呈紫色，在517nm有强吸收。

呦有自由基清除剂存在时,DPPH•的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度变小，而且这种颜色变浅的程度与配对电子数是成化学剂量关系的。

因此，在此波长处的吸收可用于检测自山基的清除情况，从而评价实验样品的抗氧化能力。

张立新等㈣利用DPPH彳去对青岛地区21种常见蔬菜的乙醇提取液进行了抗氧化活性研究。

研究得出：

茄子（SolanaceaemeIongena）^0番茄（Lycopersiconesculentum）等蔬菜的抗氧化活性较强，其中茄子皮尤为突出。

丰永红等困也用DPPH•法测定了甘蔗（Sacchanimofficinarum）制糖过程中各种原料的抗氧化活性，同时探讨了pH、加热温度、加热时间对自山基清除率的影响。

他们的实验结果表明，各种原料均具有较强的抗氧化活性；pH值对抗氧化活性影响很大，而加热时间、温度对抗氧化活性无显著影响。

初步推断该活性物质属酚类。

-6-

1・3.4硫代巴比妥酸反应物（TBAS）值法

硫代巴比妥酸反应物（TBAS）值法是评价油脂的氧化程度最常用的方法。

氧化的油脂多生成丙二醛，一分子的丙二醛可同两分子的硫代巴比妥酸（TBA）作用生成有色化合物,该有色化合物在530nm左右有吸收。

因此，可通过测定丙二醛的量来评价油脂的氧化程度，也可测定抗氧化剂活性。

Das等㈣用椰子（Cocosnucifera）油为基质，以持续吹入氧气和80°C水浴为条件，加速氧化40min后测定终产物丙二醛含量，即利用TBAS法测定抗氧化剂抗氧化能力。

张英等删用硫代巴比妥酸法测定强化竹叶提取物抗油脂氧化的能力。

实验表明：

强化后的竹叶提取物的抗氧化能力有显著提高。

胡博路和杭瑚3也用硫代巴比妥酸法测定了翅碱蓬（Suaedaheteroptera）提取物的抗氧化作用。

他们的实验表明，翅碱蓬的水、屮醇、正己烷提取物对亚油酸脂质过氧化均有良好的阻断作用，其中以正己烷提取物阻断能力最强。

他们还用同种方法旳测定了核桃壳的抗氧化作用。

核桃壳能有效地抑制脂质过氧化，其正己烷、乙酸乙酯提取物抑制脂质过氧化的效果可与茶多酚相媲美。

1.3.5FRAP（ferrlcreducing/antioxidantpowerassay）法

FRAP原理El为FJ+・三毗陀三卩丫嗪（tripyridyl-triazine,TPTZ,Sigma）可被样品中还原物质还原为二价铁形式，呈现出蓝色，并于593nm处具有最大光吸收，根据吸光度大小计算样品抗氧化活性的强弱。

郭长江等删用FRAP对36种蔬菜、30种水果的抗氧化活性进行了测定比较，并且分析了其抗氧化活性与维生素C含量的关系。

结果表明：

一些蔬菜、水果的抗氧化活性较强，有效成分值得进一步研究开发。

1.4本研究的意义和内容

1.4.1本研究的意义

大量流行病学研究表明富含果蔬的膳食能降低人体心血管系统疾病和患某些肿瘤的危险性。

人们普遍认为产生这些健康效应的成分是膳食中的抗氧化营养素，如维生素E、维生素C、卩一胡萝卜素和硒等。

然而，近年来的研究发现，某些植物中存在的多酚类非营养性成分也可能作为抗氧化剂或以其他方式参与其抗肿瘤作用或心血管保护作用。

另一方面，对食品的质量而言，脂类的氧化是直接造成食品品质下降的化学因素之一，尤其是富含不饱和脂肪酸的食品，很容易氧化生成过氧化脂类，再经过氧化分解和聚合等反应，产生腐败臭，直至出现毒性。

因此，具有抗氧化活性的物质，无论是对食品品质，还是对人体的健康，都具有重大的作用。

-7-

1.4.2本研究的内容

本文主要研究新鲜胡萝卜中提取的胡萝卜素对DPPH-自山基的清除率以确定胡萝卜素的抗氧化活性，并与卩-胡萝卜素、维生素C、维生素E、茶多酚标准样品的抗氧化活性进行对比得出结论。

第二章实验材料和内容

2.1材料与仪器

2.1.1实验材料

新鲜胡萝卜（购自湘潭某超市），洗净晾干后切小块，用组织捣碎机打碎，在培养皿中铺成薄层冰冻，置于冷冻干燥机中冷冻干燥10h以上后取出，保存于干燥避光处，备用。

2.1.2实验仪器

表2-1实验中使用的主要仪器

实验仪器

型号

生产厂家

电热鼓风干燥箱

101-1AB型

天津市泰斯特仪器有限公司

微量移液器

1000卩1量程

上海荣泰生化工程有限公司

恒温振荡培养箱

SPX-250B-D型

上海博迅实业有限公司医疗设备厂

真空旋转蒸发仪

RE-2000A

上海雅荣生化设备仪器有限公司

紫外分光光度计

2802SUV/VIS

电子分析天平

BSA224SMax

恒温水浴锅

DFD-700

真空冷冻干燥系统

110-4

组织捣碎机

2丄3试剂

二氯甲烷分析纯试剂、无水乙醇分析纯试剂、二苯基苦味酰基自由基（DPPH・）、p-胡萝卜素、维生素C、维生素E、茶多酚

2.2实验内容

2.2.1胡萝卜素的提取（以下操作均在避光条件下进行）

（1）根据提取的时间、温度、浸提溶剂、料液比等条件的不同，提取出来的胡萝卜素含量也不同，通过正交试验条件优化得到最佳提取条件。

（2）用电子分析天平称取500mg干燥过后的胡萝卜置于1000ml的三角烧瓶中，加入500ml二氯甲烷。

（3）将

（2）中的烧瓶置于恒温震荡箱中震荡1.5h,温度为40七，转速为110r/mino

（4）将浸提过后的溶液过滤得到胡萝卜素提取液，再将胡萝卜素提取液用旋转蒸发仪蒸发浓缩至50ml,温度为30°C,转速为80r/mino

（5）以二氯甲烷为空白样，用紫外分光光度计在450nm波长处测定上述胡萝卜素提取液的吸光度为2.598,根据胡萝卜素标准样品的浓度-吸光度曲线（图2-1）,可计算出上述提取液中胡萝卜素的浓度为89.15pg/mlo

（6）将得到的胡萝卜素提取液转移至棕色广口瓶中，密封置于4七干燥环境中保存,备用。

1

0.8梟0.6滋0.4

图2-1胡萝卜素标准样品浓度-吸光度曲线

2.2.2在DPPH体系中测定抗氧化性

2.2.2.1溶液的配制

（1）DPPH-溶液：

用电子分析天平称量6mgDPPH-用无水乙醇溶解，定容于200ml容量瓶，浓度为30Mg/ml,摇匀，备用。

（2）胡萝卜素提取液：

用5ml移液管分别取5ml上述89.15卩g/ml胡萝卜素提取液于5个棕色广口瓶中,分别向其中加入0ml、5mk10mk15mk20ml二氯甲烷,得到5个不同浓度胡萝卜素样品液分别为89.15j.ig/mk44.58j.ig/mk29.72pg/ml、22.29j.ig/mk17.83卩g/ml,封口，摇匀，备用。

（3）p-胡萝卜素标准液：

用电子分析天平称量25mgP-胡萝卜素用无水乙醇溶解，定容于25ml容量瓶，浓度为lmg/ml,摇匀。

用1000u1移液枪分别吸取lmk0.8ml、0.6ml.0.4ml、0.2ml上述卩-胡萝卜素标准液于5个棕色广口瓶中，分别向其中加入9ml、9.2ml、9.4ml、9.6ml、9.8ml无水乙醇，得到5个不同浓度的p-胡萝卜素样品液分别为100pg/ml、80pg/ml、60pg/ml、40pg/ml、20j.ig/ml,封口，摇匀，备用。

⑷茶多酚标准液:

用电子分析天平称量25mg茶多酚用无水乙醇溶解,定容于25ml

-10-容量瓶，浓度为lmg/mL摇匀。

用lOOOpl移液枪分别吸取lml、0.8ml、0.6ml、0.4ml、0.2ml上述茶多酚标准液于5个棕色广口瓶中，分别向其中加入9ml、9.2ml、9.4ml、9.6ml、9.8ml无水乙醇，得到5个不同浓度的茶多酚样品液分别为100ug/ml、80Pg/ml、60ug/mR40Pg/mk20Pg/ml,封口，摇匀，备用。

（5）维生素E标准液：

用电子分析天平称量25mg维生素E用无水乙醇溶解，定容于25ml容量瓶，浓度为lmg/ml,摇匀。

用1000卩1移液枪分别吸取lml、0.8ml、0.6ml.0.4ml、0.2ml±述维生素E标准液于5个棕色广口瓶中，分别向其中加入9ml、9.2ml、9.4ml、9.6ml、9.8ml无水乙醇，得到5个不同浓度的维生素E样品液分别为100pg/ml、80pg/mk60pg/ml、40pg/mR20|.ig/ml,封口，摇匀，备用。

（6）维生素C标准液：

用电子分析天平称量25mg维生素C用无水乙醇溶解，定容于25ml容量瓶，浓度为1mg/ml,摇匀。

用1000j.il移液枪分别吸取lml、0.8ml>0.6ml、0.4ml、0.2ml上述维生素E标准液于5个棕色广口瓶中，分别向其中加入19ml、19.2ml、19.4ml、19.6ml、19.8ml无水乙醇，得到5个不同浓度的维生素E样品液分别为50pg/ml、40jig/mR30pg/mR20pg/ml、10pg/ml,封口，摇匀，备用。

222.2反应液的配制及数据测定

DPPH•在517nm处有强吸收的特性，加入抗氧化剂后，