溶菌酶实验实验报告第七组.docx

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溶菌酶实验实验报告第七组

溶菌酶实验-实验报告-第七组

溶菌酶的提取和系列性质测定

实验报告

学院：

生物科学与工程学院

班级：

姓名：

学号：

组别：

第七组

组员：

一、实验内容：

溶菌酶的提取和系列性质测定

在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。

酶的提纯工作往往要求多种方法交替应用，才能得到较为满意的效果。

常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。

酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离提纯效果。

溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。

主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。

溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。

溶菌酶相对分子质量约为1.44×104，是一种强碱性蛋白质，等电点在10.0以上，并对温度和酸不敏感。

在自然界中，普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿液、淋巴液等细胞中，植物卷心菜、萝卜、木瓜等，以蛋清含量最丰富，约为0.3%。

本实验用鸡蛋为原理，通过阳离子交换层析，硫酸铵沉淀，分子筛层析等步骤提取溶菌酶。

二、实验原理：

1蛋白质提取分离技术

以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。

蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。

一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。

在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。

蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：

选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。

微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。

对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：

（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；

（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。

植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。

对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。

另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。

2.柱层析技术

柱层析技术也称柱色谱技术。

一根柱子里先填充不溶性基质形成固定相，将蛋白质混合样品加到柱子上后用特别的溶剂洗脱，溶剂组成流

场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。

　　此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。

具体实验内容

一、实验目的

1、提取鸡蛋清中的溶菌酶

2、测定蛋白质浓度

3、测定溶菌酶的酶活力

二、实验仪器及材料

1、仪器：

柱层析系统（层析柱，恒流泵，紫外监测仪，部分收集器），Sigma高速冷冻离心机，722s分光光度计，透析袋，水浴锅，电泳仪，电泳槽，紫外凝胶成像系统，移液枪（1000ml,200ml,100ml），烧杯，玻璃棒，容量瓶，移液管，洗耳球，

2、材料：

新鲜鸡蛋。

3、试剂：

（1）弱酸性阳离子交换树脂；

（2）磷酸氢二钠；（3）磷酸二氢钠；（4）氯化钠；（5）硫酸铵；（6）氢氧化钠；（7）甘油；（8）盐酸；（9）葡聚糖凝胶G-50；（10）溶壁微球菌干粉；（11）考马斯亮蓝G-250；（12）95%乙醇；（13）85%磷酸；（14）牛血清清蛋白（BSA）；（15）脲；（16）丙烯酰胺（Acr）；（17）甲叉双丙烯酰胺（Bis）；（18）四甲基乙二胺（TEMED）；（19）甘氨酸（Gly）；（20）过硫酸铵（AP）；（21）考马斯亮蓝R-250；（22）三羟甲基氨基甲烷（Tris）；（23）2-β-巯基乙醇；（24）十二烷基磺酸钠（SDS）；（25）溴酚蓝；（26）冰醋酸；（27）标准蛋白：

SDS-低相对分子质量标准蛋白.

4、试剂配制

（1）0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0；

（2）0.5mol/LNaOH；200ml

（3）0.5mol/LHCl；200ml

（4）含50%甘油的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0；200ml，现配。

（5）含0.05mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；现配。

（6）含0.5mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；现配。

（7）含0.1mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；现配。

（8）测活缓冲液：

含30mmol/LNaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0；现配。

（9）底物溶液Ⅰ：

40mg溶壁微球菌干粉溶于100mL测活缓冲液中；现配，公用。

（10）考马斯亮蓝G-250试剂：

考马斯亮蓝G-250100mg溶于50mL95%乙醇中，加入100mL85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤；公用。

（11）标准蛋白质溶液：

用0.1mol/LNaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0配制1mg/ml牛血清清蛋白溶液；公用。

（12）底物溶液Ⅱ：

300mg溶壁微球菌干粉溶于100ml测活缓冲液中；（生物技术班不用配制）。

（13）10mol/L脲，测活缓冲液配制；（生物技术班不用配制）。

（14）30%胶贮液：

每100mL中含丙烯酰胺29.2g，甲叉双丙烯酰胺0.8g；

（15）1.5mol/LTris-HClpH8.8；购买，不用配。

（16）0.5mol/LTris-HClpH6.8；购买，不用配。

（17）10%（W/V）过硫酸铵；现配。

（18）SDS电泳缓冲液：

25mmol/LTris，0.192mol/LGly，0.1%（W/V）SDS；

（19）10%（W/V）SDS；公用。

（20）染色液：

0.2g考马斯亮蓝R-250，42mL工业酒精，10mL冰醋酸，加蒸馏水至50mL；

（21）脱色液：

5mL冰醋酸，45mL工业酒精，50mL蒸馏水；100ml

（22）保存液：

7%冰醋酸；现配。

（23）2×上样缓冲液：

购买，不用配。

0.5mol/LTris-HClpH6.82mL

甘油2mL

20%SDS2mL

0.1%溴酚蓝0.5mL

2-β-巯基乙醇0.5mL

蒸馏水2.5mL

三：

实验步骤

1酶的提取

（一）样品的制备：

新鲜鸡蛋四个，破蛋壳取出蛋清，加入蛋清体积1.5倍的0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0），搅拌均匀，并调pH7.0（NaOH调pH），然后用八层纱布过滤，留取上清液，量取体积并记录，留0.4mL上清液（定为Ⅰ步骤样品）并加入0.4mL甘油-20℃冻存备用。

（二）阳离子交换层析

1.阳离子交换柱的再生：

20g阳离子交换树脂用0.5mol/LNaOH浸泡30min，水洗至中性，再用0.5mol/L盐酸浸泡30min，水洗至中性。

2.平衡：

在烧杯中将再生好的阳离子交换树脂用0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0平衡。

3.吸附：

在已平衡好的阳离子交换树脂中加入蛋清样品，搅拌吸附1h（玻璃棒搅拌）。

4.洗涤：

倒去其余上清液，树脂用100mL0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0洗涤3遍。

5.装柱：

将树脂搅拌均匀装入离子交换柱，再用300mL含0.05mol/LNaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0洗涤杂蛋白。

（装柱前，先检查层析柱是否干净，保证所有接头密闭、管道通畅；装柱时，流速不超过3mL/min，全过程绝对不能出现流干现象）。

6.洗脱：

用300mL含0.5mol/LNaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0以3mL/min的流速进行洗脱，合并光吸收高峰管，量取体积并记录，留0.4mL上清液并加入0.4mL甘油，-20℃冻存备用（定为Ⅱ步骤样品）。

（三）硫酸铵沉淀

每100mL上清液中缓慢加入35g硫酸铵固体，溶解后静置30min，10000rpm离心10min，沉淀用0.5mL左右含0.1mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0溶解，留0.05mL上清液并加入0.05mL甘油，-20℃冻存备用（定为Ⅲ步骤样品）。

四注意事项

1.上样前，层析柱要达到平衡。

2.上样后要控制流速。

（四）实验数据

图1酶提取仪器稳定图

图2酶提取平衡图

图三酶提取洗脱图

2酶的纯化

2.1分子筛层析

（1）溶胀：

取葡聚糖凝胶G-503g，加60mL蒸馏水沸水浴中煮沸2h，充分溶胀后的凝胶以倾斜法除去表面悬浮的小颗粒，如此反复洗涤2～3次，最后加入等体积含0.1mol/LNaCl的pH7.0磷酸缓冲液备用。

（2）装柱：

将凝胶悬浮液搅拌均匀后一次连续性倾入柱中，控制流速≦15mL/h，自然沉降（注意：

绝对不能出现“流干”现象，不能有气泡和分层，胶面一定要平整）。

（3）平衡：

用含0.1mol/LNaCl的pH7.0磷酸缓冲液平衡两个柱体积，控制流速≦15mL/h。

（4）上样：

将溶解后的硫酸铵沉淀样品10000rpm离心3min后上样，当样品进入胶面后，再用平衡缓冲液约0.5mL洗管壁和胶面3次（注意：

绝对不能出现“流干”现象和破坏胶面的平整性）。

（5）.洗脱：

用含0.1mol/LNaCl的pH7.0磷酸缓冲液洗脱，控制流速≦15mL/h，自动部分收集器收集，2mL/管，紫外监测仪检测洗脱峰或比色法测定洗脱峰。

合并光吸收及酶活高峰管。

2.2透析浓缩

用含50%甘油的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH4.0透析浓缩4h，-20℃分装保存备用（定为Ⅳ步骤样品）。

2.3实验图谱

图4酶纯化稳定图

图5酶纯化峰值图

2.4注意事项

1）.层析柱上方要留有少量液体，避免使凝胶暴露于空气中。

2）.凝胶过滤上样时，使样品沿管壁缓缓流下，勿冲破胶面

3酶活力、蛋白浓度测定

3.1蛋白浓度的测定

（1）标准曲线的制定

取14支试管，按下表分两组进行平行操作。

管号

0

1

2

3

4

5

6

标准蛋白质溶液/ml

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

缓冲液

0.10

0.09

0.08

0.07

0.06

0.05

0.04

考马斯亮蓝G-250

5ml

摇匀，1h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色

A595nm

0

0.051

0.089

0.119

0.169

0.205

0.235

绘制标准曲线：

以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。

图6蛋白质测定标准曲线图

（2）测定未知样品蛋白质浓度

管号

Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ

Ⅳ

吸光度

0.118

0.056

0.073

0.610

稀释倍数

10

10

100

10

蛋白浓度

0.2846

0.1258

1.6933

0.01546

2．酶活力测定

管号

1

2

测活缓冲液/ml

2.5

3.0

底物溶液/ml

2.5

2.5

酶液/ml

0.5

0

在室温，以1号管为对照，每隔30s测定2号595nm处的光吸收值

时间

样品号

0s

30s

60s

90s

120s

150s

180s

A595nm

Ⅰ

0.017

0.107

0.135

0.170

0.187

0.210

0.224

Ⅱ

0.124

0.142

0.167

0.195

0.213

0.235

0.254

Ⅲ

0.131

0.156

0.181

0.207

0.226

0.238

0.253

Ⅳ

0.257

0.328

0.348

0.350

0.357

0.366

0.370

四、注意事项

酶活测定和蛋白定量实验中所用试管、刻度吸管要干燥，量取试剂要准确。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测酶相对

分子量及纯度鉴定

1.配制15%的分离胶

（1）用胶框封好玻璃板后架好胶板。

（2）按如下比例配好分离胶，混合后立即加入到电泳槽两玻璃板之间到上口约2cm止，再加约1ml蒸馏水水封，聚合后将水吸干。

蒸馏水

1.5mol/LTris-HClpH8.8

胶贮液

10%SDS

TEMED

10%AP

4.7mL

5mL

10mL

200uL

10uL

100uL

2.配制4%的浓缩胶

蒸馏水

0.5mol/LTris-HClpH6.8

胶贮液

10%SDS

TEMED

10%AP

6.1mL

2.5mL

1.3mL

100uL

10uL

50uL

混合后立即加到分离胶上，加入梳子。

聚合后装好电泳缓冲液后小心拔出梳子。

3.样品制备

样品与2×上样缓冲液1:

1混匀，并在100℃水浴中保温3-5min，取出待用。

4.上样、电泳

将样品和标准蛋白加到样品孔中，加样量每孔10uL，加好后开始电泳，先恒压80V，样品进入分离胶后恒压120V，直到溴酚蓝走至距前沿1cm为止。

5.染色

电泳完毕，剥胶前先将凝胶在前沿处作一标记区别正反面后再将凝胶浸泡于染色液中染色2h.

6.脱色

用脱色液脱至区带清晰为止。

五实验结果

观察电泳后各种蛋白质和染料前沿的迁移距离，用相对迁移率Rf（样品迁移距离/染料迁移距离）对lgM作图，根据酶样品的相对迁移率，求出酶的相对分子质量。

并对电泳结果照相保存。

六注意事项

（1）Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴手套和口罩，纯化应在通风橱内进行。

（2）玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成凝胶板与玻璃板之间产生气泡。

（3）样品槽模板梳齿应平整光滑。

（4）用琼脂封底及灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。

（5）切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲。

（6）为防止电泳后区带拖尾，样品中盐离子强度应尽量低，含盐量高的样品可用透析法或凝胶过滤法脱盐。

（7）电泳时应选用合适的电流、电压，过高或者过低都会影响电泳效果。

七、实验图谱：

八电泳结果不正常现象和对策

1.指示剂前沿呈现两边向上或向下的现象。

向上的“微笑”现象说明凝胶的不均匀冷却,中间部分冷却不好，所以导致凝胶中分子有不同的迁移率所致。

这种情况在用较厚的凝胶以及垂直电泳中时常发生.向下的“皱眉”现象常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象。

2.“拖尾”现象是电泳中最常见的现象。

这常常是由于样品溶解不佳引起的，克服的办法是在加样前离心，选用合适的样品缓冲液和凝胶缓冲液，加增溶辅助试剂。

另一方法是降低凝胶浓度。

3.“纹理”现象常常是由于样品中不溶颗粒引起的，克服办法是增加溶解度和离心除去不溶性颗粒。

4.蛋白带偏斜常常是由于滤纸条或电极放置不平行所引起的，或由于加样位置偏斜而引起。

5.蛋白带过宽，与邻近蛋白泳道的蛋白带相连，这是由于加样量太多或加样孔泄漏引起的。

6.蛋白带模糊不清和分辨不佳是由于多种原因引起的。

虽然梯度凝胶可以提高分辨率，但与其他方法相比，常规聚丙烯酰胺凝胶电泳是分辨率较低的方法。

为了提高分辨率，不要加过多的样品，小体积样品可给出窄带。

加样后应立即电泳，以防止扩散。

选择合适的凝胶浓度，使组分得以充分的分离。

通常靠近前沿的蛋白带分辨率不佳，所以应根据分子量与凝胶孔径的关系，灌制足够长度的凝胶，以使样品不会走出前沿.样品的蛋白水解作用也引起扩散而使分辨率降低。

水解作用通常发生在样品准备的时候,系统中的内源性蛋白酶会水解样品蛋白，如果在缓冲液中加蛋白酶抑制剂可以减少这种情况的发生。