肝糖原的提取鉴定与定量实验报告第四实验室.docx

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肝糖原的提取鉴定与定量实验报告第四实验室

南方医科大学

生物化学实验报告

姓名：

学号：

专业年级：

2015级护理本科

组别：

第四实验室

生物化学与分子生物学实验教学中心

实验名称

肝糖原的提取、鉴定与定量

实验日期

2016-12-20

实验地点

第四实验室

合作者

指导老师

评分

教师签名

批改日期

一、实验目的

1、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。

2、了解离心管和分光光度计使用的原理并掌握操作步骤。

3、熟悉吸量管、可调式微量移液器的操作步骤。

4、熟悉溶液的转移操作；熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合适的混

匀方法）。

5、了解呈色反应。

二、实验原理

（一）肝糖原的提取与鉴定

1.糖原的分离

采用研磨匀浆使细胞破碎，用低浓度的三氯醋酸使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶从而使其沉淀，而糖原仍稳定保持在上清液中，从而使糖原与蛋白质等其他成分分离开来。

糖原不溶于乙醇而溶于热水，故用95%乙醇溶液将糖原沉淀，再用热水溶解。

2.糖原的鉴定

（1）糖原螺旋链吸附碘分子：

糖原水溶液呈乳样光泽，其长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子，呈现出红棕色。

（2）呈色反应——利用葡萄糖的还原性：

CuSO4+2NaOH=NaSO4+Cu（OH）2↓

2Cu（OH）2+C6H12O6=2CuOH+氧化型葡萄糖+H2O

2CuOH=Cu2O↓（红色）+H2O

④Cu（OH）2=CuO↓（黑色）+H2O

（二）肝糖原定量测定

1.糠醛衍生物的生成及其性质

糖原的水解产物葡萄糖可以在浓硫酸的作用下生成糠醛衍生物-5-羟甲基呋喃甲醛，其可以和蒽酮生成蓝色的化合物，该物质在620nm处有最大吸收。

2.标准对照法进行定量

糖含量在10μg～100μg，溶液颜色的深浅与可溶性糖的含量成正比，利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。

三、材料与方法：

（一）肝糖原的提取与鉴定

1.实验材料：

（1）样品：

鸡肝

化钠溶液、班氏试剂、碘试剂

（2）试剂：

5%三氯乙酸溶液、95％乙醇溶液、蒸馏水、浓盐酸、50%氢氧

（3）仪器和器材：

剪刀、天平、镊子、圆纸片、研钵、试管、离心机、刻

度吸量管（移液管）、微量可调取液器（加样枪）、滴管、白瓷反应板、试管架、恒温水浴箱

2.实验流程

鸡肝约1.5g，剪碎

＋5%CCl3COOH1ml

研磨至乳状

＋5%CCl3COOH3ml

研磨成肝匀浆

全部转入离心管中，离心3分钟（4000r/min）

沉淀（弃去）上清（取3ml）

＋3ml95%乙醇，混匀，静置10分钟

离心5分钟（4000r/min）

上清（弃去）沉淀

＋蒸镏水1ml

沸水浴2分钟，溶解沉淀

白瓷板孔穴中糖原溶液1ml

＋浓HCl5滴

加碘试剂2滴加碘试剂2滴沸水浴15分钟，冷却

糖原溶液2滴＋50%NaOH5滴

呈色对比糖原水解液2滴糖原水解液

＋班氏试剂4滴

混匀

沸水浴2分钟，观察变化

3.实验步骤

步骤

操作

（1）肝匀浆准备

称取肝组织约1.5g，放入盛有1ml5%三氯醋酸的研钵中，将肝组织磨至乳状后，再加入5%三氯醋酸3ml，在磨成肝匀浆，4000r/min离心3min，上清液倾入另一干净离心管中。

（2）提取糖原

向上清液中加入等量的95%乙醇，混匀，静置10min，离心5min（4000r/min）。

倾去上清液，白色沉淀为糖原。

加入蒸馏水1ml，并加热使沉淀溶解，溶液呈乳样光泽。

（3）糖原鉴定

与碘反应：

取碘试剂2滴于白瓷板孔穴中，加糖原溶液2滴，观察其呈色。

另一孔穴只加碘试剂2滴，作呈色对比。

糖原水解液汇总葡萄糖的鉴定：

取糖原溶液1ml于小试管汇总，加浓盐酸5滴，置沸水浴中水解15min，取出冷却。

用50%NaOH中和（约5滴）。

另取一小试管加班氏试剂4滴，加上述糖原水解液2滴混匀，在沸水浴中（或直接在酒精灯上）加热2min，观察并记录所见

（二）肝糖原定量测定

1.实验材料：

（1）样品：

鸡肝

（2）试剂：

30%氢氧化钾溶液、蒸馏水、标准葡萄糖溶液、蒽酮显色剂

管）、微量可调取液器（加样枪）、滴管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计、100ml容量瓶

（3）仪器和器材：

剪刀、天平、镊子、圆纸片、试管、刻度吸量管（移液

2.实验流程

鸡肝0.15g

＋30%KOH1.5ml（用吸量管）

沸水浴15分钟

冷却，全部转入100ml容量瓶中

加水至标线，仔细混匀，此为糖原提取液

糖原的测定

3.实验步骤

见下表

步骤

操作

（1）糖原提取

在试管中加入30%KOH1.5ml，在称取0.15g肝组织放入试管中，置沸水浴中15min。

取出后冷却，将管内容物全部移入100ml容量瓶，定容，摇匀。

（2）糖原的测定

取3支试管，按下表操作：

试剂（ml）

空白管

标准管

样品管

蒸馏水

1.0

-

-

标准葡萄糖溶液

-

1.0

-

糖原提取液

-

-

1.0

0.2%蒽酮溶液

2.5

2.5

2.5

混匀，沸水浴10min，冷却。

混匀，沸水浴10分钟，冷却c。

在分光光度计620nm波长处，用空白管溶液调零，测定各管溶液的吸光度（A）。

计算公式如下：

肝糖原（g/100g肝组织）=

A样品

×0.05×

100

×

100

×1.11

A标准

肝组织重（g）

1000

（三）注意事项

1.肝糖原的提取与鉴定：

（1）肝糖原提取一步，向上清液中加人等量的95％乙醇后，务必注意混匀。

由于最终混合液比较多，混匀操作比较困难，最好用倾倒混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。

（2）糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。

肝糖原分枝中的葡萄糖残基在20个以下，吸附碘后呈现红棕色。

（3）糖原水解液中葡萄糖的鉴定一步，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑浊，观察不到应有的结果。

（4）离心时，一定要注意对称，质量配平，若听到离心机声音过大，应立即停止离心。

2.肝糖原定量测定

（1）肝组织必须定量，精确，因为要涉及到后期的计算。

（2）肝组织必须在沸水浴中全部溶解，否则影响比色。

（3）注意定量转移，取量务必准确。

（4）蒽酮含有浓硫酸，转移需用刻度吸量管。

（5）若肝糖原含量小于1%，须改用间接测量法，即肝组织消化后，用95%乙醇沉淀糖原。

四、实验现象：

（一）肝糖原的提取与鉴定

1.肝匀浆离心3min后（在取了上清液后才拍照，导致上清液看起来有点浑浊）

图1肝匀浆离心3min后的分层现象

2.取3ml上清液向其中加入3ml95％乙醇后，溶液呈淡黄色

图2加入乙醇后的上清液

3.鸡肝上清液经乙醇处理，离心后可看到少量白色沉淀物（表明有一定的糖原含量）

4.在白瓷板孔穴中，2滴糖原溶液滴加2滴碘液后，对比2滴碘液加2滴蒸馏水，有变化，有红棕色物质生成，说明有糖原生成，现象如下图：

图3呈色对比

5.糖原溶液加入班氏试剂后呈清蓝色,水浴2min,颜色变化,但未出现砖红色沉淀

图4左边是水浴之前右边是水浴之后

（二）肝糖原定量测定

1.0.15g鸡肝加入KOH溶液再水浴15min,拿出后溶液呈现浅棕红色

图5鸡肝中加入KOH溶液并沸水浴后现象

2.将鸡肝溶解液移入容量瓶，加蒸馏水至刻度线混匀后，溶液呈浅米黄色。

3.三支试管，从左边到右边依次是空白管，标准管和样品管，并且都加有2.5ml的蒽酮溶液。

加入蒽酮溶液时，试管迅速温度升高，液体上层有蒸腾的现象。

配置空白管、标准管、样品管时，溶液均有放热现象。

图6加蒽酮试剂的糖原溶液水浴后颜色

图六左边数起第一支试管是空白对照（蒸馏水+0.2%蒽酮溶液）的结果，溶液呈黄色（稀释后的蒽酮溶液的颜色）；左边数起第二支试管是标准葡萄糖溶液+0.2%蒽酮溶液的结果，溶液为绿色（黄色加蓝色的结果）；左边数起第三支试管是糖原提取液+0.2%蒽酮溶液的结果，溶液为黄色，与空白对照的结果颜色相近。

五．结果与讨论

（一）实验数据处理

1、在肝糖原定量测定中，所取鸡肝组织为0.15g。

2、3支试管在620nm波长处的吸光度（取平均值）

测定次数

各管吸光值A620

空白管

标准管

样品管

1

0

0.620

0.043

2

0

0.621

0.037

3

0

0.620

0.032

各管平均值—A620

0.620

0.037

3、按照实验原理中给出的公式，计算鸡肝组织中肝糖原的含量：

肝糖原（g/100g肝组织）=

A样品

×0.05×

100

×

100

×1.11

A标准

肝组织重（g）

1000

代入数据有：

肝糖原（g/100g肝组织）=

0.037

×0.05×

100

×

100

×1.11

0.620

0.15

1000

即待测肝中，每100g组织中肝糖原含量为0.221g/100g肝组织。

（二）结果讨论

1.肝糖原的提取与鉴定

（1）鸡肝上清液经乙醇处理，离心后可看到极少量白色沉淀

结论：

存在微量糖原。

（2）在加入碘试剂进行呈色对比时，可观察：

加入碘试剂后的糖原溶液，颜色发生变化，呈现红棕色，比碘液本身的颜色深，但是变化不明显

结论：

存在微量糖原。

（3）在利用班氏试剂鉴定糖原水解液中葡萄糖时，加入班氏试剂的糖原水解液呈现浅蓝色，水浴后，颜色发生变化，但是没有出现预期的砖红色沉淀，反而蓝色更浅了。

结论：

未出现砖红色沉淀，说明没有葡萄糖，间接说明没有糖原。

分析

（1）

（2）（3）的原因：

鸡肝样品的质量较少，导致所含的肝糖原较少；

对比本实验室其他组的实验结果，同样没有出现砖红色沉淀，可能的原因有：

实验室所用的鸡肝不是新鲜的鸡肝，而是保存了一段时间，导致肝糖原因此而减少；在进行沸水浴的过程中，经常打开锅盖造成温度降低，达不到一定温度。

2.肝糖原的定量

（1）结果：

该样品中肝糖原含量为每100g肝组织含肝糖原0.221g。

（2）结论：

查书可得饱食鸡肝肝糖原含量为2～3g/100g肝组织。

在本组实验中测得肝糖原数值小于正常范围值，未达到预期的实验结果。

但对比本实验室其他组别，所求值同样偏小，可见鸡肝组织本身含肝糖原很少。