细胞培养基本技术概述.docx

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细胞培养基本技术概述

细胞培养基本技术概述

作者：

佚名    实验频道来源：

『生物交流』    点击数：

981    更新时间：

2004-10-17

无菌操作基本技术

1.实验进行前，无菌室及无菌操作台（laminarflow）以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%

ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。

每

次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间

污染。

实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面。

操作间

隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。

2.无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可

以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。

实验用品以70%ethanol擦

拭后才带入无菌操作台内。

实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操

作。

3.小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。

勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打

开之容器正上方操作实验。

容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，

尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

4.工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。

对于来自人类或是病毒

感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台（至少ClassII）。

操作过程

中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐

针头之伤害等。

5.定期检测下列项目：

5.1.CO2钢瓶之CO2压力

5.2.CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染（水盘的水用无菌水，每周更换）。

5.3.无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网（300

小时/预滤网，3000小时/HEPA）。

6.水槽可添加消毒剂（Zephrin1:

750），定期更换水槽的水。

实验用品

1.种类︰

1.1.细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteurpipet外，其它均为塑料无菌

制品。

1.2.TC级培养盘表面均有coating高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask,

plates,dishes,rollerbottle等，依实验需要使用。

1.3.plasticsterilepipet:

1ml,2ml,5ml,10ml,25ml

1.4.塑料离心管:

15ml,50ml，均有2种不同材质，其中polypropylene（PP）为不透

明材质，polystyrene（PS）为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。

1.5.glasspastuerpipet:

9inch，用以抽掉废弃培养液等。

1.6.玻璃血清瓶（PyrexorDuranglassware）：

100ml,250ml,500ml,1000ml

2.清洗︰

2.1.新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05NHCl浸泡数小时，洗净后才开始使用。

2.2.用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干

净，勿加清洁剂清洗。

3.灭菌︰

3.1.实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121oC,15lb,20分钟，置于

oven中烘干。

3.2.实验用玻璃pasteurpipet以干热灭菌170oC,4小时。

3.3.液体或是固体废弃物可用10%hypochloride溶液（次氯酸，即漂白水）或是蒸汽高

压灭菌121oC,15lb,20分钟处理。

培养基

1.液体培养基贮存于4oC冰箱，避免光照，实验进行前放在37oC水槽中温热。

2.液体培养基（加血清）存放期为六个月，期间glutamine可能会分解，若细胞生长不佳，

可以再添加适量glutamine。

3.粉末培养基配制（以1升为例）：

3.1.细胞培养基通常须添加10%血清，因此粉末培养基之配制体积为900ml，pH为

7.2-7.4。

NaHCO3为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成

pH之误差，或局部过碱。

因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，

然后用CO2气体调整pH，而非用强酸（HCl）或强碱（NaOH），因为氯离子对细胞生

长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发生改变。

3.2.材料：

3.2.1.纯水（milli-Q水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要）

3.2.2.粉末培养基

3.2.3.NaHCO3（SigmaS-4019）

3.2.4.电磁搅拌器

3.2.5.无菌血清瓶

3.2.6.0.1或0.2mm无菌过滤膜

3.2.7.pHmeter

3.2.8.真空帮浦

3.2.9.CO2气体

3.3.步骤：

3.3.1.取粉末培养基溶于700mlmilli-Q水中，搅拌使其溶解。

3.3.2.称取适量之NaHCO3粉末（数量依培养基种类而异，表一）溶于200ml

milli-Q水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2气体至饱和，约3-5分钟。

3.3.3.将溶解且含饱和CO2之NaHCO3溶液加入溶解之液体培养基中混合。

混后

溶液之pH应为7.2-7.4，除非pH值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。

若为太碱，可再通入CO2气体调整pH。

培养基以真空帮浦通过过滤膜时，

pH会升高0.1-0.2。

3.3.4.以0.1或0.2mm无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养

基种类、日期、瓶号等，贮存于4oC。

（血清亦可加入培养基中一起过滤）

3.3.5.配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。

4.配制培养基之生长测试

4.1.材料：

4.1.1.MDCKcell（ATCCCCL-34或CCRC60004）

4.1.2.6-wellTCplate（or35mmTCdish）

4.1.3.methanol

4.1.4.glacialaceticacid

4.1.5.10%Giemsasolution（GibcoBRL10092-013）

4.2.步骤：

4.2.1.以待测试培养基培养MDCKcell，接种MDCK细胞于6-wellplate（或35

mmTCdish）中，每个well接种1×102活细胞，同时作对照组实验。

4.2.2.接种5～7天后，在100倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群

落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。

4.2.3.去除培养基，加入1mlCarnoy’s固定液（甲醇：

冰醋酸﹦3:

1），室温下静

置10min。

4.2.4.去除固定液，水洗二次。

4.2.5.加入1ml10%Giemsasolution，，室温下静置染色2-3min。

4.2.6.去除染液，水洗二次。

4.2.7.以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不

佳，则丢弃之。

抗生素

1.细胞库之细胞培养基不加抗生素

1.1.培养自ATCC引进之细胞株，培养基中不加抗生素。

1.2.培养自其它实验室引进之细胞株，制作tokenfreeze前培养基须添加抗生素，待

tokenfreeze通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。

2.寄送活细胞时，须将培养液充满整个flask时，则须添加抗生素（penicillin100units/ml+

streptomycin100ug/ml）。

3.若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加gentamicin，因gentamicin会抑制

mycoplasma生长。

4.去除细菌污染之抗生素混合配方:

penicillin250units/ml,streptomycin250ug/ml,neomycin

250ug/ml,bacitracin2.5units/ml，注意混合使用后药物毒性会增强。

5.抗生素使用种类与浓度：

              工作浓度.储存温度.杀灭细菌

penicillin100units/ml-20℃G（+）bacteria

streptomycin100ug/ml-20℃G（+）andG（-）bacteria

chlotetracycline50ug/ml-20℃G（+）andG（-）bacteria

gentamicin50ug/ml-20℃G（+）andG（-）bacteria,mycoplasma

amphotericinB2.5ug/ml-20℃yeastandmolds

nystatin50ug/ml-20℃yeastandmolds

fungizone2.5ug/ml-20℃yeastandmolds

血清

1.血清必须贮存于–20～-70oC，若存放于4oC，请勿超过一个月。

如果一次无法用完一

瓶，可将40～45ml分装于无菌50ml离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10%，

必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。

2.一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。

若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加

入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。

3.瓶装（500ml）血清解冻步骤（逐步解冻法）:

-20oC或–70oC至4oC冰箱溶解一天，至室

温下全溶后再分装，一般以50ml无菌离心管可分装40～45ml。

在溶解过程中须规则摇

晃均匀（小心勿造成气泡），使温度与成分均一，减少沈淀的发生。

勿直接由–20oC直接

至37oC解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。

4.heat-inactivation是指56oC,30分钟加热已完全解冻之血清。

加热过程中须规则摇晃均

匀。

此热处理之目的是使血清中之补体成份（complement）去活化。

除非必须，一般不建

议作此热处理，因为会造成沈淀物之显著增多，且会影响血清之品质。

补体参与之反应有：

cytolyticactivities,contractionofsmoothmuscle,releaseofhistaminefrommastcellsand

platelets,enhancedphagocytosis,chemotaxisandactivationoflymphocyticandmacrophagecell

type。

5.勿将血清置于37oC太久，若在37oC放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较

不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质。

6.血清之沈淀物

6.1.凝絮物：

发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白（lipoprotein）变性

及解冻后血清中存在之血纤维蛋白（fibrin）造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本

身之品质。

若欲减少这些凝絮沈淀物，可用离心3000rpm,5min去除，或离心后上

清液可以加入培养基中一起过滤。

不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会

阻塞过滤膜。

6.2.显微镜下观察之“小黑点”：

通常经过热处理之血清，沈淀物的形成会显著的增多。

有些沈淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清

放在37oC中欲培养此“微生物“，但在37oC环境下，又会使此沈淀物增多，更

会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。

一般而言，此

小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批

号的血清。

7.血清之生长测试

7.1.材料：

7.1.1.MDCKcell（ATCCCCL-34或CCRC60004）

7.1.2.a-MEM（alphamodifiedminimalessentialmedium,GibcoBRL12000-022）

7.1.3.6-wellTCplate（or35mmTCdish）

7.1.4.methanol

7.1.5.glacialaceticacid

7.1.6.10%Giemsasolution（GibcoBRL10092-013）

7.2.步骤：

7.2.1.以a-MEMwith10%FBS（已测试过）培养MDCK细胞于T75flask至80

%confluency。

7.2.2.以trypsin-EDTA处理细胞，离心后，加入适量不加血清之a-MEM制成细

胞悬浮液，并测细胞浓度。

以不加血清之a-MEM稀释细胞浓度为1×102活

细胞数/ml。

7.2.3.将1ml细胞悬浮液接种入6-wellplate中，并另加入1ml含不同浓度的血

清（20%,10%,4%,2%,1%,0.4%）之a-MEM，使血清最终浓度为10

%,5%,2%,1%,0.5%,0.2%。

用已测试过之血清同时进行对照组试验。

7.2.4.37oC，5%CO2培养箱培养5-7天，期间不需更换培养基，待细胞群落大

到可以肉眼观察，而群落间不互相接触即可。

7.2.5.去除培养基，加入1mlCarnoy’s固定液（甲醇:

冰醋酸﹦3:

1），室温下静

置10min。

7.2.6.去除固定液，水洗二次。

7.2.7.加入1ml10%Giemsasolution，，室温下静置染色2-3min。

7.2.8.去除染液，水洗二次。

7.2.9.以肉眼计数群落数

7.2.10.计算SPE（SerumPlatingEfficiency）：

SPE=（no.ofcolonies/well）/100x100%

7.2.11.计算RPE（RelativePlatingEfficiency）：

SPE=[totalcoloniesofsixwell（test）/Totalcoloniesofsixwell（control）]x100%

7.3.比较各浓度血清培养基之RPE，即可得知待测血清对细胞生长的影响。

7.4.订购多量同一批号的优良血清，置于–70oC保存之

冷冻细胞活化

1.冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死

亡。

2.细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常（例如产生

单株抗体或是其它蛋白质）。

3.材料

3.137oC恒温水槽

3.2新鲜培养基

3.3无菌吸管/离心管/培养瓶

3.4液氮或干冰容器

4.步骤：

4.1操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。

4.2自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时

盖子易松掉。

4.3将新鲜培养基置于37°C水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无

菌操作台内。

4.4取出冷冻管，立即放入37°C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全

部融化，以70%ethanol擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。

4.5取出0.9ml解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内（稀释比例为

1:

10～1:

15），混合均匀，放入CO2培养箱培养。

另取0.1ml解冻细胞悬浮液作

存活测试。

4.6解冻后是否立即去除冷冻保护剂（例如DMSO或glycerol），依细胞种类而异，

一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。

惟若要立即去除，则将解冻之细胞

悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1,000rpm,5分钟，移去上清

液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。

4.7若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。

 细胞传代培养

1.细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为1:

3至1:

6，依细胞

种类而异。

2.材料：

2.1.无菌磷酸生理缓冲液（Dulbecco’sphosphate-bufferedsaline,Ca++/Mg++free,D-PBS,

GibcoBRL21600-010）

2.2.trypsin-EDTAsolution（0.05%trypsin-0.53mMEDTA-4Na,GibcoBRL25300-062）：

以10ml分装于15ml无菌离心管中，保存于–20oC，使用前放在37oC水槽

回温。

2.3.新鲜培养基

2.4.无菌吸管/离心管/培养瓶

3.步骤：

3.1.附着型胞（adherentcell）

3.1.1.吸掉旧培养液。

3.1.2.用D-PBS洗涤细胞一至二次。

3.1.3.加入trypsin-EDTA溶液（1ml/25cm2,2ml/75cm2），37oC作用数分钟，于倒

立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA溶

液。

（若不移去trypsin-EDTA，则在trypsin-EDTA作用后，加入适量含血清

之新鲜培养基终止trypsin作用，离心后再吸掉上清液。

）

3.1.4.轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数

次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常

培养条件培养。

3.2.悬浮型细胞（suspensioncell）

3.2.1.吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000rpm5分钟。

3.2.2.吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的

培养瓶中，以正常培养条件培养。

3.3.融合瘤（hybridoma）

3.3.1.有些hybridomacell需培养三天以上才会产生抗体，若是更换培养基，则可

能会失去抗体。

因此继代培养不需离心后更换培养基，直接添加新鲜培养基

稀释细胞浓度即可。

若体积太大，可倾斜放置，或分殖至新培养瓶中。

细胞计数与存活测试

1.原理：

1.1.计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。

1.2.血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，

其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。

当chamber上方

盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2x0.1mm=1.0x10-4ml。

使用时，计

数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞

数目。

1.3.存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细

胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。

一般使用蓝色之trypanblue染料，如果细

胞不易吸收trypanblue，则用红色之Erythrosinbluish。

2.材料：

2.1.0.4%w/vtrypanblue（GibcoBRL15250-061）

2.2.Erythosinbluishstain

取0.1gramErythrosinbluish（SigmaE-9259）及0.05grampreservativemethyl

paraben（SigmaH-3647）溶于100mlCa++/Mg++freesaline

2.3.血球计数盘及盖玻片（Hemocytometerandcoverslip）

2.4.计数器（counter）

2.5.低倍倒立显微镜

2.6.粒子计数器（Coultercounter,CoulterElectronics）

3.步骤：

3.1.取50ml细胞悬浮液与50mltrypanblue（orErythrosinbluish）等体积混合均匀于

1.5ml小离心管中。

3.2.取少许混合液（约15ml）自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于

100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色（或红色-Erythrosin

bluish）。

3.3.计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数（至少乘以2，因与trypanblue

等体积混合），最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。

若细胞位于线

上，只计上线与右线之细胞（或计下线与左线之细胞）。

4大格*细胞总数x2x104/4=细胞数/ml

*每一大格的体积=0.1cmx0.1cmx0.01cm=10-4ml

3.4.若不用血球计数盘，可用Coultercounter作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细

胞。

3.5.范例：

T75monolayerculture制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1mltrypan

blue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之

细胞数目。

活细胞数/方格：

55,62,49,59

死细胞数/方格：

5,3,4,6

细胞总数=243

平均细胞数/方格=60.75

稀释倍数=2

细胞数/ml：

60.75x104x2=1.22x106

细胞数/flask：

1.22x106x10ml=12.2x106

存活率：

225/243﹦92.6%

细胞冷冻保存

1.注意事项：

1.1.欲冷冻保存之细胞应在生长良好（logphase）且存活率高之状态，约为80–90％

致密度。

1.2.冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二

日测试是否有抗体之产生。

1.3.注意冷冻保护剂之品质。

DMSO应为试剂级等级，无菌且无色（以0.22micron

FGLPTe