细胞生物学实验指导讲义.docx

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细胞生物学实验指导讲义

实验一细胞的基本形态结构的观察

实验原理与目的

（1）通过观察动、植物细胞，了解细胞形态的多样性并掌握光镜下细胞的基本形态结构。

（2）初步掌握临时制片技术和显微绘图的方法。

实验原理

细胞是生命活动的基本结构单位和功能单位。

构成人体或其他高等动物或植物的细胞种类繁多，形态各异。

细胞的形态都与它们的功能相适应。

如具有运输O2和CO2功能的红细胞为双凹盘状；具有感受刺激与传导功能的神经细胞呈星芒形，附有长短不等的树枝状突起；上皮细胞是柱形或扁平形；巨噬细胞则呈不规则形状，并能伸出伪足，以利于为执行吞噬和消灭外源的病原微生物的功能。

虽然细胞在形态上多种多样、大小不同，但却具有共同的基本结构特点，即都是由细胞膜（cellmembrane）、细胞质（cytoplasm）和细胞核（nucleus）组成。

实验用品

1．器具：

显微镜、载玻片、盖玻片、推片、吸管、镊子、牙签、擦镜纸、吸水纸、小剪刀。

2．材料：

洋葱、人口腔上皮细胞、鸡血液、人血细胞涂片、蟾蜍血细胞涂片。

3．试剂：

2%碘液、Giemsa染液。

试剂配制

1．2%碘液：

称取碘片2g，碘化钾5g，蒸馏水100ml混匀溶解即可。

2．吉姆萨（Giemsa）染液：

吉姆萨粉（Giemsastain）l.0g

甘油（AR）66ml

甲醇（AR）66ml

将Giemsa粉放入研钵中，先加入少量甘油，研磨至无颗粒为止，然后再将全部甘油倒入，放56℃温箱中2h后，加入甲醇，将配制好的染液密封保存棕色瓶内（最好于0~4℃保存）。

内容与方法

一、洋葱鳞茎表皮细胞制片与观察：

1.临时制片：

取一擦净的载玻片，在玻片中央滴一滴2%的碘液，将洋葱茎用小刀分为几块，取一块肉质鳞叶，用镊子在其表面轻轻撕下一小块膜质表皮，再用剪刀剪成3～4mm2的小块，置于载玻片的染液中铺平，染色2～3分钟，盖上盖玻片，用吸水纸吸去盖玻片周围多余的染液。

2.观察：

将标本置于低倍镜下观察，可见许多长柱状排列整齐、彼此相连的细胞，选择其中较典型的细胞移至视野中央，然后换成高倍镜观察以下结构：

1）细胞壁：

在每两个细胞相连处，可看到二层壁状结构，是相邻细胞各自的细胞壁，有纤维素构成。

细胞膜紧贴在细胞壁内侧，不易看到。

2）细胞核：

呈椭圆形，位于中央，被染成黄色，成熟的细胞由于液泡的挤压，核位于质膜边缘。

细胞核一般有1～2个折光较强并染成黄色的核仁。

（3）细胞质：

是细胞膜以内，细胞核以外的物质，染色较浅，有1至数个液泡及微细颗粒（图1-1）。

二、人口腔粘膜上皮细胞制片与观察：

1.临时制片：

在一张擦净的载玻片中央滴一滴2%的碘液，取一根牙签，用其粗端在自己口腔中的脸颊上刮几下，将其刮下的粘膜上皮细胞涂布在碘液中，染色2～3分钟，盖上盖玻片，用吸水纸吸去盖玻片周围多余的染液。

色2～3分钟，盖上盖玻片，用吸水纸吸去盖玻片周围多余的染液。

2.观察：

将制好的玻片标本置于低倍镜下观察，可见细胞被染成黄色，成群或分散存在。

由于该细胞体积较小，着色较淡，观察时应稍降低视野中的亮度，选择较分散且轮廓清楚的细胞移至视野中央，换成高倍镜观察以下结构。

1）细胞膜：

是包围在细胞最外层的膜状结构，细胞呈扁平不规则的类圆形，细胞膜有些地方出现皱褶。

2）细胞核：

圆形或椭圆形的细胞核呈深黄色位于细胞中央，核中有时可见一致密的结构，即为核仁。

3）细胞质：

是细胞膜与细胞核之间染色较浅的物质（图1–2；图1-3）。

2.观察：

将已经染好的血涂片标本（肉眼可见血膜呈粉红色）放置在低倍镜下，检查整个血涂片，选择细胞均匀分布、较少重叠的区域，然后转换高倍镜下仔细观察，在人的血涂片上红细胞数目多、体积小、呈圆饼状，无细胞核（图1-4），胞质呈粉红色；白细胞比例较小，寻找较困难，但胞体较大，细胞核明显，形态多样，呈兰紫色。

鸡的血细胞、蛙的血细胞的形态与人类有很大不同，在鸡或蛙血的红细胞涂片中，可见红细胞呈卵圆形，并且有椭圆形的细胞核（图1-5）。

图1-4人血红细胞的形态?

?

图1-5鸡血红细胞的形态

作业与思考题

1.绘制高倍镜下洋葱鳞茎表皮细胞、人口腔黏膜上皮细胞图，并注明各部分结构的名称。

2.生物绘图的基本要求是什么？

实验二细胞大小的测量

实验目的学习显微测量方法

实验原理应用显微镜的成像原理，同时借助显微镜的镜台测微尺和目镜测微尺，两尺配合使用，进行测量和运算，得出细胞的大小。

（目镜测微尺测量倍率比照表）

实验材料、用品

材料：

人口腔上皮细胞,鸡血红细胞、洋葱鳞叶表皮细胞。

仪器（请参看仪器图库）：

测微尺、显微镜。

物镜测微尺目镜测微尺

实验步骤

（一）测微尺的使用操作

1.卸下目镜的上透镜，将目镜测微尺有刻度一面向下装在目镜镜面上，再旋上目镜的上透镜。

2.将镜台测微尺有刻度一面朝上放在载物台上夹好，使测微尺刻度位于视野中央。

调焦至看清镜台测微尺的刻度。

3.小心移动镜台测微尺和目镜测微尺（如目镜测微尺刻度模糊，可转动目镜上透镜进行调焦），使两尺左边的"0"点一直线重合，然后由左向右找出两尺另一次重复的直线（图1-6）。

4?

记录两条重合线间目镜测微尺和镜台测微尺的格数。

按下式计算目镜测微尺每格的长度等于多少μm

目镜测微尺每格的长度/μm=镜台测微尺的格数/目镜测微尺的格数

（二）花粉细胞的观察测量

1．采集刚开放或将要开放的成熟花朵；

2.在载玻片滴1~2滴蒸馏水；

3.用接种针将花粉分散于蒸馏水上，盖上盖玻片；

4.用测微尺测量花粉细胞大小，计算平均值。

附：

鸡血细胞的观察测量

将已经制备好的鸡血涂片放在染色盘架上，滴数滴瑞氏-吉姆萨染液欲涂片上，静置染色1分钟，滴加等量1/15mol/L磷酸缓冲液，用牙签轻轻搅拌混匀，再静置染色5－10分钟，最后用清水缓缓冲洗1分钟，倾斜放置，凉干后进行观察测量。

实验报告

用测微尺测量不同材料各种细胞的大小后，制表格表示测量结果。

注意事项

载物台上物镜测微尺刻度是用加拿大树胶和圆形盖玻片封合的。

当除去松柏油时，不宜使用过多的二甲苯，以避免盖玻片下的树胶溶解。

取出目镜测微尺，将目镜放回镜筒，用擦镜纸擦去目镜测微尺上的油腻和手印

思考题

分别计算不同物镜放大倍数下测微尺的单位。

实验三植物细胞骨架的观察

一、实验目的

1.掌握考马斯亮蓝R250对植物细胞骨架染色的方法。

2.通过对洋葱内皮细胞的处理，掌握植物细胞骨架的制备方法与显微形态观察。

二、实验原理

细胞骨架（cytoskeleton），是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络结构，根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同可分为微丝、微管和中等纤维。

细胞骨架对于维持细胞的形态结构及细胞运动、物质运输、能量转换、信号传导和细胞分裂等有重要的作用。

本试验采用去垢剂TritonX-100的缓冲液处理植物材料时，可将细胞的膜结构和大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来，后者用考马斯亮蓝R250染色，在光学显微镜下可见一种网状结构。

三、实验用品

（一）材料洋葱

（二）器材显微镜、载玻片、滴管、擦镜纸、PH计

（三）试剂

1.0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）

0.2mol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液（PB，PH7.3）50ml

0.15mol/LNaCl

双蒸馏水加至1000ml

2.PB

0.2mol/LNa2HPO477ml

0.2mol/LNaH2PO423ml

3.M-缓冲液

咪唑（PH6.7）50mmol/L

KCl50mmol/L

MgC120.5mmol/L

EGTA1mmol/L

EDTA0.1mmol/L

巯基乙醇1mmol/L

甘油4mmol/L

用1mol/LHCl调pH至7.2。

4.1%的TritonX-100/M-缓冲液

5.0.2%考马斯亮蓝R250染液

甲醇46.5ml

冰醋酸7ml

蒸馏水46.5ml

6.3%戊二醛-PB溶液（PH7.3）

四、实验操作见图4-4

取洋葱内皮1cm左右

置于含PBS液的载玻片上

湿润后，吸去PBS

加2滴1%TritonX-100/M-缓冲液，5min

吸去缓冲液，加3%戊二醛-PB溶液，固定30min

加PBS洗2次，共3min

加0.2%考马斯亮蓝R250染色30min

用PBS洗2次，共2min，吸干

镜检并绘图

图4-4细胞骨架标本制作过程

五、实验建议

1.用去垢剂TritonX-100的缓冲液处理材料时，应控制在30min左右。

2.每一次加液或染色后，应用PBS洗2次，并用滤纸吸干。

六、实验报告及作业

1.画出实验所观察到的细胞骨架图，并注明放大倍数。

2.为什么用TritonX-100的缓冲液处理材料？

实验四细胞中多糖和过氧化物酶的定位

【实验目的】

　掌握显示细胞中多糖和过氧化物酶反应的原理和方法。

【实验原理】

高碘酸—雪夫试剂反应，简称PAS反应。

主要是利用高碘酸作为强氧化剂，这种强氧化剂能打开C-C键，使多糖分子中的乙二醇变成乙二醛，氧化所得到的醛基与Schiff试剂反应形成紫红色化合物。

颜色的深浅与糖类的多少有关。

细胞内的过氧化物酶能把联苯胺氧化为蓝色或棕色络合物，根据蓝色或棕色的出现来表示过氧化物酶的存在。

PAS反应过程如下：

过氧化物酶联苯胺反应过程如下：

【实验仪器、材料和试剂】

（一）仪器

　　显微镜、镊子、染色钵、刀片、载玻片、盖玻片、吸水纸等

（二）材料

　　马铃薯块茎、洋葱根尖或洋葱鳞茎

　　（三）试剂

　　1．高碘酸溶液：

高碘酸（HIO4·2H2O）0.4g，95%乙醇35ml，M/5醋酸钠溶液（2.72g醋酸钠溶于100mlH2O）5ml，蒸馏水10ml

　　2．Schiff试剂（配法见Feulgen反应）

　　3．亚硫酸水溶液（配法见Feulgen反应）

　　4．70%乙醇

　　5．联苯胺溶液：

　　在0.85%盐水内加入联苯胺至饱和为止，临用前加入20%体积的H2O2，每2ml加一滴。

　　6．0.1%钼酸铵溶液：

称取0.1g钼酸铵溶于100ml0.85%盐水.

【方法与步骤】.

（一）细胞中多糖的测定：

高碘酸—雪夫（PAS）反应

　　1．把马铃薯块茎用刀片徒手切成薄片。

　　2．浸于高碘酸溶液5～15min。

　　3．移入70%乙醇中浸片刻。

　　4．Schiff试剂染色15min。

　　5．亚硫酸溶液洗三次，每次1min。

　　6．蒸馏水洗片刻。

　　7．装片镜检。

　　镜检结果：

细胞中多糖部位呈现紫红色。

（二）细胞中过氧化物酶的测定：

联苯胺反应

　　1．把洋葱根尖徒手切成20～40μm厚的薄片或用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮一小块。

　　2．浸在溶有0.1%钼酸铵的0.85%盐水溶液中5min（钼酸铵的作用是催化剂）。

　　3．浸在联苯胺溶液内2min至切片出现蓝色。

结果：

细胞中有蓝色沉淀出现

【作业】

1．简述PAS反应及联苯胺反应的原理。

　　2．绘图示细胞中多糖及过氧化物酶的分布。

实验五细胞核与线粒体的分级分离

【实验原理与目的】

（1）了解细胞器分级分离的原理。

。

（2）初步掌握细胞核与线粒体的分级分离。

（3）熟悉离心机、匀浆器的使用方法。

【实验原理】

细胞组分的分级分离是研究亚细胞组分的化学组成、理化特性及其功能的基本方法。

细胞内各种结构的大小、形状和密度不同，在同一离心场内的沉降速度也不同，因此在密度均一的介质中，在不同大小的离心力场的作用下，组分先后沉降而初步分离。

差速离心只能将那些大小有显著差异的成分分离开，更精细的分离则要采用密度梯度离心。

细胞组分的分离是通过组织匀浆、分级离心等步骤

完成的（图）。

图11.差速离心技术各步骤图解

【实验用品】

1．玻璃匀浆器、台式高速冷冻离心机、普通离心机、EP管、微量进样器、tip头、剪刀、镊子、小烧杯、离心管、载玻片、盖玻片、滴管、普通光学显微镜、滤纸、8层纱布或尼龙网（200目）、冰块。

2．材料：

小白鼠肝脏。

3．试剂：

匀浆介质（O．25mol／L蔗糖水溶液，含0．003mol／LCaCl2）、甲基绿一派洛宁染液、?

95％乙醇、丙酮、生理盐水、中性红一詹纳斯绿B染液。

【试剂配制】

1）甲基绿-派洛宁染液：

①0.2mol／L醋酸缓冲液（pH4．8）：

冰醋酸1．2ml，加蒸馏水至100ml；醋酸钠2.72g溶于100ml蒸馏水中。

使用时两液按2：

3比例混合；A液：

5％派洛宁水溶液4ml、2％甲基绿水溶液14ml、蒸馏水16ml；B液：

0.2mol／I。

醋酸缓冲液（pH4.8）16ml。

使用时临时将A液与B液混合（5∶2）。

。

2）中性红-詹纳斯绿B染液：

①将3滴詹纳斯绿B饱和水溶液（溶解度5.18％）加到5ml无水乙醇中，然后再加入1ml1：

15000中性红溶液（中性红10mg溶于150ml水中），瓶子用黑纸包好，4℃冰箱保存；5ml无水乙醇中加入20～30滴中性红饱和水溶液（溶解度5.64％）；临用时将2种溶液等体积混合。

3）0.12mol/L草酸铵溶液：

?

称取草酸铵8.527g,溶解于500ml蒸馏水中

3）将烧杯内悬浮组织倒入玻璃匀浆器中，使匀浆器的下端浸入盛有冰块的器皿中，垂直插入匀浆捣杆，上下转动研磨数次使肝组织磨碎。

用2层纱布（先用少量匀浆介质湿润）过滤匀浆液至离心管中，离心管内匀浆液约有7～8ml。

然后制备1张滤液涂A，做好标记，自然干燥。

4）将装有匀浆滤液的离心管配平后，在普通离心机中以2500r／分钟离心15分钟，缓缓吸取上清液，移入EP管中，盖紧盖子放在有冰块的器皿内，待分离线粒体时用。

同时制备1张上清液涂片B，做好标记，自然干燥。

5）用lOml匀浆介质悬浮离心后的沉淀物，用吸管混匀，以2500r／分钟离心15分钟，吸弃上清液，沉降物加入0.3~0.5ml匀浆介质，用吸管吹打成悬液，制备1张涂片C，做好标记，自然干燥。

2.高速离心分离提取线粒体：

1）将放在有冰块的器皿内装有上清液的EP管取出配平，在台式高速离心机上以13,000r/min离心20分钟，缓缓吸去上清液，留取沉淀物。

如沉淀的表面有一浅色的疏松层时（主要是一些损伤和肿胀的线粒体），则应连同上清液一起小心吸去。

2）沉淀再加入预冷的匀浆介质悬浮，用tip头吹打后再以13,000r/min离心20分钟。

3）将上清液吸入另一EP管中，留存沉淀物中加入0.1ml的匀浆介质混匀成悬液（可用牙签）。

EP管同时置于冰浴中，待制片鉴定时用。

【内容与方法】

1.细胞核。

将步骤一中得到的涂片A、B、C浸入95％乙醇中5分钟，晾干，在涂片标本上?

滴加甲基绿-派洛宁染液染色20~30分钟，再以纯丙酮分色20秒，

蒸馏水漂洗，直立于吸水纸上吸干水分，在高倍镜下比较观察A、B、C?

3张涂片各含什么成分。

细胞核被染成蓝绿色，核仁和细胞碎片染成红色。

2.线粒体。

取步骤二中得到的沉淀物悬液和上清液分别均匀地涂布在2张干净载玻片上制备成涂片D和E，各滴1滴0.02％中性红-詹纳斯绿B染液，分别盖上盖玻片染色5~20分钟。

在高倍镜下观察已染好色的玻片标本，其中被染成亮绿色的颗粒是线粒体。

比较观察和描述两张玻片的结果。

【作业与思考题】

1.画出小白鼠肝脏细胞核与线粒体的分级分离的操作程序图。

2.观察、描述、鉴定离心分离物涂片的结果。

实验六线粒体和液泡系的超活染色与观察

一、实验目的：

1、观察动、植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布。

2、学习一些细胞器的超活染色技术。

二、实验原理：

活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。

它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。

活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。

根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。

体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。

体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。

活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部位，主要是染料的“电化学”特性起重要作用。

碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子的，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。

但不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总是要配成稀淡的溶液来使用。

一般是以碱性染料最为适用，可能因为它们具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。

詹纳斯绿B（JanusgreenB）和中性红（neutralred）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。

三、实验用品：

1、器材：

显微镜、恒温水浴锅、载玻片、盖玻片、10ml量筒、吸管、牙签、吸水纸（或卫生纸）等。

2、试剂：

1）Ringer溶液（装入滴瓶）

氯化钠0·85g（变温动物用0·65g）

氯化钾0·25g

氯化钙0·03g

蒸馏水100ml

2）1%、1/3000中性红溶液（装入棕色滴瓶）

称取0·5g中性红溶于50mlRinger液，稍加热（30-40℃）使之很快溶解，用滤纸过滤，装于棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。

临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml，加入29mlRinger溶液混匀，装入棕色瓶备用。

3）1%、1/5000詹纳斯绿B溶液（装入棕色滴瓶）

称取50mg詹纳斯绿B溶于5mlRinger溶液中，稍加热（30-40℃），使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。

取1%原液1ml加入49mlRinger溶液，即成1/5000工作液，装入瓶中备用。

最好现用现配，以保持它的充分氧化能力。

四、实验材料：

1、人口腔上皮细胞

2、洋葱鳞茎内表皮细胞

3、小麦或黄豆幼根根尖

五、方法步骤：

（一）、线粒体的超活染色与观察：

线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同的生理状态而发生变化。

詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基（即无色状态）。

1、人口腔黏膜上皮细胞线粒体的超活染色观察

1）、取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上，滴两滴1/5000詹纳斯绿B染液。

2）、实验者用牙签宽头在自己口腔颊黏膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的黏液状物放入载玻片的染液滴中，染色10——15分钟（注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液），盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置显微镜下观察。

3）、在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。

可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中，分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即是线粒体。

2、洋葱鳞茎表皮细胞线粒体的超活染色观察

1）用吸管吸取1/5000詹纳斯绿B染液，滴一滴于干净的载玻片上，然后，撕取一小片洋葱鳞茎内表皮，置于染液中，染色10—15分钟。

2）用吸管吸去染液，加一滴Ringer液，注意使内表皮组织展平，盖上盖玻片进行观察。

3）在高倍镜下，可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所占据，细胞核被挤至一侧贴细胞壁处。

仔细观察细胞质中线粒体的形态与分布。

（二）、液泡系的超活染色与观察

中性红为弱减性染料，对液泡系的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能与液泡中某些蛋白质有关。

1、小麦或黄豆根尖细胞液泡系的中性红染色与观察

1）实验前，将小麦或黄豆种子培养在培养皿内潮湿的滤纸上，使其发芽，胚根伸长到1cm以上。

2）取初生的小麦或黄豆幼苗根尖（约1—2cm长）,置于载波片上,滴一滴Ringer液，用镊子或刀片小心将根尖压成一薄片，吸去Ringer液，在材料上滴一滴1/3000中性红染液，染色5—10分钟。

3）吸去染液，滴一滴Ringer液，盖上盖玻片，并用镊子轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察。

4）在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的幼小液泡。

然后，由生长点向延长区观察，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积增大，数目变少。

在成熟区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分，将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处。

2、洋葱表皮细胞液泡系的活体染色与观察：

1）撕取洋葱鳞茎内表皮

2）置于加有一滴1/3000的中性红染液的载玻片中，染色5—10分钟

3）用吸水纸吸去染液，换上Ringer液，盖上盖玻片

4）显微镜下观察，可见被染成砖红色的中央大液泡

六、注意事项：

1、在对口腔上皮细胞进行染色时不可使染液干燥，可适当补加染液。

2、在对植物进行观察时一定要让材料尽量展开。

七、作业：

1、绘口腔上皮细胞示线粒体形态与分布

2、绘小麦或黄豆根尖细胞示液泡系形态与分布