细胞生物学试验指导.docx
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细胞生物学试验指导
细胞生物学实验指导
细胞生物学的发展总是依赖于技术和实验手段的进步,所以学习细胞生物学的技术和方法至关重要。
实验一普通显微镜及其使用（装片观察）
一、目的要求：
1、掌握显微镜的构造、油浸系的原理、使用方法、保护要点。
2、参观了解其他各类显微镜。
二、材料：
普通光学显微镜及其他显微镜、细菌标本片、香柏油、二甲苯、擦镜纸。
三、方法和步骤：
1、介绍普通光学显微镜的构造
机械部分：
镜座、镜臂、镜筒、转换器、载物台、调焦螺旋。
光学部分：
接目镜、物镜、反光镜、聚光器。
2、油镜的原理及使用方法
原理：
油镜头的晶片细小，进入镜中的光线亦少，光线经聚光器，通过载玻片进油镜时，由于空气介质和玻璃介质的折射率不一样，光线因折射而损失，使视野更暗。
在载玻片和油镜之间加上和玻璃折光系数相同的香柏油，光线直接进入镜头，不发生折射，视野明亮，便于观察。
3、如何维护显微镜：
机械部分的维护，光学部分的维护。
4、注意事项：
（1）观察油镜载片时，先在载片上有菌影的地方滴1-2滴香柏油，然后放载物台中央，眼侧面看，慢慢降低油镜浸入香柏油中，镜头几乎接触标本。
再用左眼在接目镜观察，同时慢慢旋动粗螺旋提起镜筒至能模糊看到物象时，再转动微调螺旋，直至看清晰为止。
注意镜头离开油，就不能看清，重新按刚才的步骤进行。
（2）油镜使用过后，立即用擦镜纸擦拭镜头，如油渍已干，则可用香柏油粘二甲苯擦拭镜头，再用干净擦镜纸擦去二甲苯。
5、观察几种细菌标本片。
6、示教看相差显微镜和荧光显微镜。
四、作业及思考题：
1、油镜的原理是什么
2、光线强弱如何调节与哪些部件有关
实验二、细胞膜的渗透性
实验目的
了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。
实验原理
将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以促使水分进入细胞，引起溶血，由于溶质透入速度互不相同，因此溶血时间也不相同。
实验用品
一、器材
50ml烧杯,试管（1～10cm）,10ml移液管,试管架。
二、材料
羊血。
三、试剂L氯化钠，L氯化胺，L醋酸胺，L硝酸钠，草酸胺，硫酸钠，葡萄糖，甘油，乙醇，丙酮。
实验方法
一、羊血细胞悬液
取50ml小烧杯一个，加1份羊血和10份L氯化钠，形成一种不透
明的红色液体，此即稀释的羊血。
二、低渗溶液
取试管一支，加入10ml蒸馏水，再加入1ml稀释羊血，注意观察溶液颜色
的变化，有不透明的红色逐渐澄清，说明红细胞发生破裂造成100%红细胞溶血，使光线比较容易透过溶液。
三、羊红细胞的渗透性
1、取试管一支，加入L氯化钠10ml，再加入1ml稀释羊血，轻轻摇动，注意观察溶液颜色有无变化有无溶血现象为什么
2、取试管一支，加入L氯化胺10ml，再加入1ml稀释羊血，轻轻摇动，注意观察溶液颜色有无变化有无溶血现象为什么
3、分别在另外8种等渗溶液中进行同样实验。
步骤同2。
实验结果
并对实验结果进行比较和分析。
实验三、线粒体和液泡系的超活染色与观察
活体染色是能使生活有机体的细胞或组织特异性着色但对活样品又没有毒害作用的一种活体染色方法，其目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。
活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。
通常把活体染色分为体内活体染色与体外活体染色两类。
体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。
活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是靠染料的“电化学”特性。
碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。
但并非任何染料均可用于活体染色，理论上应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，且使用时需要配成稀淡的溶液。
一般说来，最为适用的是碱性染料，这可能是因为它具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。
詹纳斯绿B（JanusgreenB）和中性红（neutralred）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色分别具有专一性。
实验目的
1、观察动、植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布；
2、学习一些细胞器的超活染色技术。
实验原理
线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。
细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。
活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。
詹纳斯绿B是线垃体的专一性活体染色剂。
线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态（即有色状态）呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。
中性红为弱碱性染料，对液泡系（即高尔基体）的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能是与液泡中某些蛋白质有关。
实验用品
1、器材
显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀片、解剖盘．载玻片、凹面载玻片、盖玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。
2、试剂
（1）Ringer溶液：
氯化钠（变温动物用
氯化钾
氯化钾
氯化钙
蒸馏水100ml
（2）10%、1/3000中性红溶液：
称取中性红溶于50mlRinger液，稍加热（30~40℃）使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。
临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml，加入29mlRinger溶液混匀，装入棕色瓶备用。
（3）1%、1/5000詹纳斯绿B溶液
称取50mg詹纳斯绿B溶于5mlRinger溶液中，稍加微热（30~40℃），使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。
取1%原液lml加入49mlRinger溶液，即成1/5000工作液装入瓶中备用。
最好现用现配，以保持它的充分氧化能力。
实验材料
人口腔上皮细胞，小麦种子或黄豆幼根根尖。
实验方法
1、人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察
清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上
↓
滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液
↓
用牙签口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞
↓
刮下的粘液状物放大载玻片的染液滴中
↓
染色10~l5min（注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液）
↓
盖上盖玻片,显微镜下观察
2、植物细胞液泡系的超活染色与观察
取豆芽的根尖
↓用刀片纵切根尖
放入中性红染液滴中，染色5~10min。
↓
吸去染液，滴一滴Ringer液
↓
盖上盖玻片进行镜检（镊子轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察）
实验结果
在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的幼小液泡。
然后，由生长点向延长区观察，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积增大，数目变少。
在成熟区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分，将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处。
实验报告
（1）.绘口腔上皮细胞示线粒体的形态与分布
（2）.绘蟾蜍胸骨剑突软骨细胞示液泡系的形态与分布
实验四、叶绿体的分离与荧光观察
实验目的
1.通过植物细胞叶绿体的分离,了解细胞器分离的一般原理和方法。
2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光,并熟悉荧光显微镜的使用方法。
实验原理
将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
叶绿体的分离应在等渗溶液L氯化钠或L蔗糖溶液）中进行,以免渗透压的改变使叶绿体到损伤。
将匀浆液1000r/min的条件下离心2min,以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。
然后，在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。
分离过程最好在0~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。
因此在荧光观察时应抓紧时间,有必要时立即拍照。
另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。
实验用品
一、器材
1.主要设备:
普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。
2.小型器材:
500ml烧杯2个,250ml量筒1个,滴管20支,10ml刻度离心管20支,试管架5个，纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。
二、材料新鲜菠菜。
三、试剂L氯化钠溶液，%吖啶橙（acridineorange）。
实验方法
一、叶绿体的分离与观察
1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于LNaCl溶液中，装入组织捣碎机。
2.利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀桨3~5min。
3.将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。
4.取滤液4ml在1000r/min下离心2min。
弃去沉淀。
5.将上清液在3000r/min下离心5min。
弃去上清液，沉淀即不叶绿体（混有部分细胞核）。
6.将沉淀用LNaCl溶液悬浮、
7.取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。
（1）在普通光镜下观察。
（2）在荧光显微镜下观察叶绿体的直接荧光。
（3）在荧光显微镜下观察叶绿体的间接荧光：
取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴%吖啶橙荧光染料,加盖片后即可在荧光显微镜下观察。
二、菠菜叶手切片观察
用剔须刀片将新鲜的嫩菠菜叶切削出一斜面置于载玻片上，滴加1~2滴LNaCl溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察。
（1）在普通光镜下观察。
（2）在荧光显微镜下观察其直接荧光。
（3）观察间接荧光：
向手切片上滴加1～2滴%吖啶橙染液，染色1min，洗去余液,加盖片后可在荧光显微镜下观察间接荧光。
实验结果
一、叶绿体的分离和观察
1.普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。
2.以Olympus荧光显微镜为例，在先用B（bule）激发滤片、B双色镜和O530（orange）阴断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。
3.加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧光。
二、菠菜叶手切片观察
1.在普通光镜下可以看到三种细胞
（1）表皮细胞:
为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞;
（2）保卫细胞:
为构成气孔的成对存在的肾形细胞；（3）叶肉细胞:
为排列成栅状的长形和椭圆形细胞。
叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。
2.在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱,气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。
表皮细胞内的叶绿体数量要比叶肉细胞少。
3.用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光,气孔仍为绿色。
作业
1.在普通光学显微镜下，用目微尺和台微尺测量一下叶绿体的长轴和短轴，分别测量5~10个叶绿体，求其平均值。
2.在荧光显微镜下，观察叶绿体的自发荧光时，更换滤镜系统，叶绿体的颜色是否有变化
实验五、植物染色体标本制备与观察
实验目的
学习植物染色体标本的制备技术，了解Feulgen反应的基本原理,学习其操作方法和压片法,初步掌握细胞分裂各期的主要特点.
核酸是生物最重要的组成成分,核酸分为两大类,即脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）.它们在细胞内的分布及化学性质均有所不同.DNA主要分布在核的染色质或有丝分裂过程中出现的染色体内.RNA分布在细胞质和核仁内.但在染色质及染色体中也含有少量的RNA,核仁中也有少量的DNA.在线粒体,叶绿体等细胞器内除含有RNA外,也含有少量的DNA.
实验原理
Feulgen反应的原理是根据DNA经弱酸（1mol/L）水解后,打开料嘌呤和脱氧核糖连接的键,在脱氧核糖的一端形成有离的醛基.这些醛基就在原位与Schiff试剂结合,形成含醌基（）的化合物,醛基是一个发色团所以具有颜色,因此凡有DNA的部位,就呈现紫红色.
实验材料
大麦、黑麦或小麦种子
实验内容
植物染色体标本的制备及DNA的显示法-Feulgen反应
压片法
细胞有丝分裂相的观察
实验步骤
（一）植物染色体标本的制备
1、将植物种子放在潮湿的滤纸上，20°C发芽，待胚根长至1～2cm时，切取长的根尖部分。
2、预处理：
将切下的根尖浸入%秋水酰素液中，室温下处理3～4小时。
3、固定、水解及染色：
Camoy固定剂
固定10-30分钟95%酒精10分钟70%酒精10分钟蒸馏水→（对照）5%三氯醋酸90oC15分钟
1mol/LHCl←蒸馏水1mol/LHCl60oC8分钟Schiff试剂40-60分钟亚硫酸水（1,2,3）换3次,每次5分钟自来水将染色后的根尖漂洗干净,悬着染色效果好的材料蒸馏水压片镜检
（二）压片法
压片的操作步骤如下,把根尖放在载片上,用刀片切取根尖,纵切根尖,加一滴水,用解剖针将根尖纵向分成若干小条,保留1-2小条,加盖玻片,用铅笔端轻轻敲击盖玻片,使细胞分离,压平呈云雾状.
（三）蚕豆（或洋葱）根尖压片的观察
首先在低倍镜下,区分根尖的分生组织区及延长组织区的细胞,然后,在高倍镜下,观察细胞核的形态,注意在你的片子上,是否有有丝分裂细胞,如有,你能找到细胞分裂期的几个阶段,其特征如何（可参照附录）
做Feulgen反应时,应注意的几个问题
固定剂的选择:
一般常选用Carnoy固定液.其他的固定剂如Flemming固定剂及Champy固定剂等均可用,但不能使用Bouin固定剂.
水解时间:
水解时间一定要合适,不宜过长或不足,否则会影响实验结果.如用Carnoy固定液固定的材料,水解时间一般在8-15分钟之间.水解时间的长短要随不同的材料及不同的固定剂而定.
Schiff试剂的质量:
在做Feulgen反应时,重要的因素就是Schiff试剂的质量问题.实验时,要注意试剂颜色是否正常,有无SO2的气味.
洗涤剂的重要性:
漂洗时,所用的亚硫酸水,最好在每次实验前临时配制,以便保持较浓的SO2.
实验对照组:
一定要做对照片,以便说明实验结果的真实性.
操作过程中,用镊子镊取根尖的生长区部位,切勿夹取根冠部位.
鸦片过程中尽量使根尖分生组织细胞保持原来的分布状态.
习题
简述Feulgen反应的原理
欲得到一张好的Feulgen反应制片,制片过程中应注意些什么
绘制细胞分裂图。
实验六植物原生质体的制备
实验目的
1.学习植物原生质体的分离制备技术，观察原生质体的形态。
2.学习植物原生质体的融合技术，观察不同方法融合细胞的形态及变化。
实验用品
显微镜，擦镜纸，剪子，镊子，小平皿，吸管四支，直式漏斗，300目尼龙网，10ml离心管，载片，盖片。
实验原理
原生质体（protoplast）这个术语最早是由Hanstein在1880年提出来的。
确切地说，食用菌原生质体是指细胞壁完全消除后余下的那部分包裹的裸露的细胞结构。
植物的花瓣细胞在经过纤维素酶，离折酶处理后，纤维素和果胶成分遭到破坏，造成原生质体脱离细胞壁进入培养液中。
植物花瓣细胞中的大液泡中存在有大量色素，且不同的细胞色素不同，因此可以在不对细胞染色的情况下，通过颜色范围辨认不同细胞的原生质体，以及同种间细胞融合和异种间细胞融合情况。
PEG是一种高分子化合物，由于含有醚键而具有负极性，与水，蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团形成氢键。
当PEG分子足够长时，可作为邻近原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。
PEG也能连接Ca2+等阳离子。
Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连，在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合，高Ca2+高pH清洗则增加了质膜的流动性，因而大大提高了融合频率，洗涤时的渗透冲击对融合也可能起作用。
实验试剂
1.洗涤液：
甘露醇
CaCl22H2O8mM
NaH2PO4H2O2Mm
实验步骤
1.酶液的制备把纤维素酶（EAS－867）溶于～摩尔/升甘露醇内，加10毫摩/升氯化钙溶液作稳定剂。
酶溶解后，经4000转/分离心机沉降原生质体，20分钟后，取上清液。
经针筒型过滤器，再经微米微孔滤膜过滤后，在无菌箱内把酶液分装在三角烧瓶内，贮存在冰箱里备用。
2.材料准备把生长在温室，苗龄60天以上的烟草植株，取上中部全展叶，在日光下照射2小时，使它萎蔫。
也可以用温室生长的蚕豆叶作同样处理，或用大田收获的胡萝卜，放在0℃以上低温备用。
萎蔫后的叶片浸在3%的漂白精片溶液中15～20分钟，再用无菌水冲洗干净，用无菌吸水纸吸干表面水分。
3.酶解用尖头镊子撕去叶片下表皮，剪成小块。
胡萝卜则用刀片削去表皮和中柱，取用皮层部，切成小块。
以上材料1克，放入盛有10毫升酶溶液的培养皿里，加盖。
在28～30℃下保温～3小时。
4.洗涤叶片或其他组织经酶解后会出现圆形的游离原生质体，原生质体悬浮液内有未消化的组织、碎片、细胞和破裂的原生质体。
用滤纸或尼龙布滤去粗杂质，再把原生质体悬浮液移到离心管，用手摇离心机转动2分钟，吸去上清液（见图），再加入毫升甘露醇洗涤2～3次，最后就得到较为纯净的原生质体，可以供进一步培养或作其他实验用。
实验七细胞融合方法
实验目的
1、初步掌握动物细胞PEG融合的方法。
2、学习细胞融合及其应用的有关知识。
实验原理
2个或2个以上的细胞合并为1个细胞的现象，称为细胞融合。
细胞融合的主要方法有病毒法、聚乙二醇（PEG）法和电融合方法。
用PEG处理细胞，能使质膜性质发生改变，导致细胞膜融汇，胞质流通，最后导致细胞融合。
实验器材、材料与试剂
1、仪器：
光学显微镜，离心机，恒温水浴锅，C02培养箱，超净台，倒置显微镜等。
2、材料
新鲜鸡红细胞，无菌注射器，6号针头，刻度离心管，试管，载玻片，盖玻片。
3、试剂
50%PEG，Hanks液，甲醇，Giemsa染液，碘酒，75%乙醇
实验方法
（1）取新鲜鸡血以％生理盐水制成10％的悬液。
（2）称取克PEG（MW=4,000）放入试管内，在酒精灯上融化之，迅速加入预热的Hanks液混匀制成50％的PEG溶液。
放入37℃水浴中待用。
（3）取上述10％的鸡红细胞悬液1ml放入离心管中，再加入5mlHanks液混匀，然后以1,000rpm离心5分钟，小心弃去上清，用指弹法将细胞团块弹散。
（4）取上述50％PEG溶液，在1分钟内滴加到鸡红细胞悬液，边加边轻轻摇动混匀。
待PEG全部加入后静置1分钟左右。
此全部过程都要求在37℃水浴内进行。
（5）缓慢滴加9mlHanks液以终止PEG的作用，在37℃水浴内静置5分钟。
（6）离心弃上清后，取一滴融合后的细胞悬液滴片，加盖片镜检。
作业：
1、分析实验结果
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