天津商学院专业基础试验室开设设计性试验一览表.docx

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天津商学院专业基础试验室开设设计性试验一览表

天津商学院专业基础试验室开设设计性试验一览表

生物化学实验：

XXX酶的提取及动力学分析

实验目的：

掌握酶及蛋白的分离提取技术及方法；

学会评价酶催化特性的有关知识。

实验要求：

1采用两到三种方法对酶进行分离纯化，然后进行相关分离指标的比较；

2利用评价酶分离纯化的酶表对分离纯化方法进行评价；

3研究影响酶促反应的因素（温度、pH、Km和Vm、酶的操作稳定性等）

考核方式：

按论文写作格式要求写出实验报告。

酶工程实验：

XXX酶的发酵生产及产酶动力学分析

实验目的：

1掌握产酶微生物的培养技术

2产酶微生的发酵工艺条件及其控制

3酶发酵动力学

实验要求：

1学会细胞活化与扩大培养技术

2培养基配制技术

3温度、pH、溶解氧的调节技术

4提高酶产量的措施

5细胞生长动力学

6产酶动力学

考核方式：

按科技论文格式写出实验报告

酵母蔗糖酶的动力学性质

生物化学课程组

郑丽媛龚莎莎徐迅

摘要：

本实验通过对啤酒酵母中蔗糖酶的提取纯化，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质测定，作初步的研究。

通过一系列试验，研究蔗糖酶的最适pH、最适温度、蔗糖酶催化反应的活化能，测定米氏常数Km、最大反应速度Vmax和各种抑制剂常数KI，由此掌握酶动力学性质分析的一般实验方法。

本文对此系列实验进行了整理和总结。

关键词：

蔗糖酶米氏常数Km反应速度Vmax最适pH最适温度抑制剂常数KI二硝基水杨酸

引言：

自1860年Bertholet从酒酵母SacchacomycesCerevisiae中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。

蔗糖酶（invertase）（—D—呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranosidefructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。

不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。

酶的动力学性质分析，是酶学研究的重要方面。

从20世纪50年代起分光光度法测酶活性以其测定范围广、准确、简便、快捷等优点广泛流行。

下面将通过一系列实验对酵母蔗糖酶的动力学性质进行具体地研究。

1实验器材及试剂

1.1器材

1.1.1研钵离心管滴管烧杯移液管吸耳球试管盖子试管架

1.1.2恒温水浴锅

1.1.3高速冷冻离心机

1.1.4广泛pH试纸

1.1.5紫外分光光度计石英比色皿

1.2材料及试剂

1.2.1啤酒酵母、二氧化硅、去离子水（4oC）、冰块、1mol/L乙酸、95%乙醇

1.2.20.2mol/L,pH4.9乙酸缓冲溶液葡萄糖4mmol/L果糖4mmol/L二硝基水杨酸溶液

1.2.30.2mol/L的磷酸氢二钠磷酸二氢钠柠檬酸乙酸钠乙酸和8mol/L脲

2实验方法

2.1酵母蔗糖酶的制备

2.1.1提取

a.准备一个冰浴，将研钵稳妥地放入冰浴中。

b.称取10g湿啤酒酵母，适量（约5g）二氧化硅放入研钵中,二氧化硅要预先研细。

c.缓慢加入预冷的30ml去离子水，每次加2ml左右，边加边研磨，至少用30分钟。

至酵母细胞大部分研碎，以便将蔗糖酶充分转入水相。

d.将混合物转入两个离心管中，平衡后用高速冷冻离心机离心，4oC10000r/min15min。

e.用滴管小心取出水相，转入另一个清洁的离心管中，4oC1000r/min15min。

f.将上清液转入量筒，量出体积。

用广泛pH试纸检查上清液pH，用1mol/L乙酸将pH调至5.0，为“级分I”。

留出1ml左右测定酶活力及蛋白含量，剩余部分转入清洁离心管中。

2.1.2热处理和乙醇沉淀

a.预先将恒温水浴调到50oC，将盛有级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50oC下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离心管。

b.取出离心管,于冰浴中迅速冷却，4oC,10000r/min，离心10分钟。

c.将上清液转入小烧杯中，放入冰浴，缓慢地加入等体积预冷至－20oC的95%乙醇，同时轻轻搅拌，再在冰浴中放置10分钟，以沉淀完全。

于4oC，10000r/min，离心10分钟，倾去上清液，滴干，沉淀保存于离心管中，放入冰箱中冷冻保存。

2.2底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数Km和最大反应速度Vmax测定

2.2.1标准曲线的制作

本实验和下一个实验均采用二硝基水杨酸法测定反应产物还原糖，为了掌握该法测定的范围，可先作一条标准曲线。

按下表进行实验操作：

表1二硝基水杨酸法测定葡萄糖的标准曲线

1

2

3

4

5

6

葡萄糖（ml）

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

水（ml）

1.0

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

二硝基水杨酸

0.5ml

盖上盖子，沸水浴中煮5min后迅速冷却

水

4.0ml

充分混合

用第1管作空白对照，测定其余各管520nm的吸光度A520。

用A520值对还原糖的数作图。

2.2.2酶活力预试

表2酶活力预试表

试管号

1

2

3

蔗糖（10%）（ml）

0

2.0

2.0

37oC水浴3min

蔗糖酶粗提物（ml）

0

1.0

0

蔗糖酶纯化物（ml）

0

0

1.0

醋酸缓冲溶液（ml）

2.0

0

0

37oC水浴准确反应5min后取出速冷

0.1mol/LNaOH（ml）

2.0

二硝基水杨酸（ml）

0.5

沸水浴反应5min,取出速冷

试管号

1

2

3

上述反应液

1.0

水

4.0

摇匀后测A520

2.2.3测定不同底物浓度对催化速度的影响

表3底物浓度对酶催化反应速度的影响（Km和Vmax测定表）

试管号

1

2

3

4

5

6

7

10%蔗糖溶液（ml）

0.1

0.2

0.3

0.5

1.0

1.5

2.0

醋酸缓冲液（ml）

1.9

1.8

1.7

1.5

1.0

0.5

0.0

蔗糖酶溶液（ml）

1.0

37℃准确反应5min后取出速冷

0.1mol/LNaOH（ml）

2.0

二硝基水杨酸（ml）

0.5

沸水浴反应5min,取出速冷

试管号

1

2

3

4

5

6

7

上述反应液（ml）

1.0

水（ml）

4.0

摇匀后测A520

2.3pH值、温度、抑制剂对蔗糖酶活性的影响

2.3.1酶活力预试

表5酶活力预试表

试管号

1

2

3

蔗糖酶体积（ml）

0.5

乙酸缓冲溶液（pH=4.9）（ml）

2.0

1.9

1.0

37oC水浴3min

蔗糖（pH4.510%）（ml）

0

0.1

1.0

37oC水浴准确反应5min后取出速冷

NaOH（0.2mol/L）（ml）

2.0

二硝基水杨酸

1.0

沸水浴反应5min,取出速冷,测定A520

注:

根据需要可增加几组预测,如蔗糖1.5ml,乙酸缓冲溶液1.0ml（无蔗糖酶对照）

2.3.2pH值对蔗糖酶活性的影响

a.按下表配制12种缓冲溶液

将两种缓冲试剂混合后总体积均为10ml，其溶液pH值以酸度计测量值为准。

表6缓冲溶液的配制

溶液pH

缓冲试剂

体积ml

缓冲试剂

体积ml

2.5

0.2mol/L磷酸氢二钠

2.00

0.2mol/L柠檬酸

8.00

3.0

0.2mol/L磷酸氢二钠

3.65

0.2mol/L柠檬酸

6.35

3.5

0.2mol/L磷酸氢二钠

4.85

0.2mol/L柠檬酸

5.15

3.5

0.2mol/L乙酸钠

0.60

0.2mol/L乙酸

9.40

4.0

0.2mol/L乙酸钠

1.80

0.2mol/L乙酸

8.20

4.5

0.2mol/L乙酸钠

4.30

0.2mol/L乙酸

5.70

5.0

0.2mol/L乙酸钠

7.00

0.2mol/L乙酸

3.00

5.5

0.2mol/L乙酸钠

8.80

0.2mol/L乙酸

1.20

6.0

0.2mol/L乙酸钠

9.50

0.2mol/L乙酸

0.50

6.0

0.2mol/L磷酸氢二钠

1.23

0.2mol/L磷酸二氢钠

8.77

6.5

0.2mol/L磷酸氢二钠

3.15

0.2mol/L磷酸二氢钠

6.85

7.0

0.2mol/L磷酸氢二钠

6.10

0.2mol/L磷酸二氢钠

3.90

b.准备二组各12支试管，第一组12支试管每支都加入0.2ml上表中相应的缓冲液，然后加入0.2ml的蔗糖酶，另一组12支试管也是每支都加入0.2ml上表中相应的缓冲液，但不再加酶而加入等量的去离子水，分别作为测定时的空白对照管。

所有的试管都用水补足到0.8ml。

c.所有的试管按一定时间间隔加入10%蔗糖的水溶液开始反应，反应5分钟后分别加入1.0ml0.2mol/LNaOH终止反应，接着加入0.5ml二硝基水杨酸试剂，封口，在沸水浴中煮5分钟，取出速冷，然后加入5.0ml水，摇匀测定A520。

d.本实验再准备二支试管，一支用水作空白对照；另一支作葡萄糖标准管。

e.画出不同pH下蔗糖酶活性与pH的关系曲线，注意画出pH值相同，而离子不同的两点，观察不同离子对酶活性的影响。

2.3.3温度对蔗糖酶活性的影响

a.本实验测定0oC、25oC、35oC、45oC、55oC、65oC、75oC七个温度下蔗糖酶催化的反应速度。

每个温度准备两支试管，一支加酶测酶催化，另一支不加酶，作对照。

b.测定以上各个温度下的反应速度，每次用二支试管，均加入0.2ml乙酸缓冲溶液，一支加0.2ml酶，加一支不加酶，均用水调至0.8ml，放入水浴温度下使反应物平衡30秒，加入0.2mol/L蔗糖0.2ml，准确反应10分钟，立即加入1.0ml0.2mol/LNaOH终止反应，接着加入1ml二硝基水杨酸试剂，封口，在沸水浴中煮5分钟，取出速冷，然后加入5.0ml水，摇匀测定A520。

c.画出酶催化的反应速度对温度的关系曲线和lnk-1/T的关系曲线。

2.3.4尿素（脲）抑制蔗糖酶的实验

共做七组底物浓度加抑制剂和不加抑制剂情况下酶的活性高低

a.本实验需要15支试管,一支做空白对照,另外十四支试管分为两组,一组加抑制剂脲,另一组不加,分别测定七种底物浓度下酶的活性.

b.画出反应速度与底物浓度的关系图，和I/V-I/[V]关系图，计算Km、Vmax、K1和相应的表观值，讨论脲对蔗糖酶活性的影响

3结果

3.1酵母蔗糖酶的制备

3.2底物浓度对催化反应速度的影响及来米氏常数Km和最大反应速度Vmax的测定

3.2.1标准曲线的绘制

二硝基水杨酸法测定葡萄糖的标准曲线

试管号

1

2

3

4

5

6

葡萄糖溶液浓度（mmol/L）

0

0.8

1.6

2.4

3.2

4

A520

0

0.063

0.234

0.333

0.516

0.520

3.2.2酶活力预试

试管号

1

2

3

OD520

0

0.952

1.236

3.2.3底物浓度对酶催化反应速度的影响（Km和Vmax测定表）

结果

1

2

3

4

5

6

7

OD520

0.000

0.093

1.488

0.674

0.987

0.659

1.485

葡萄糖产量，mg

0.000

0.726

1.035

0.473

0.689

0.463

1.033

（v）=[葡萄糖产量5]

0.000

3.630

5.140

2.368

3.448

2.316

5.166

[S]=10%VX1000/3X342

0.000

0.354

0.501

0.231

0.336

0.226

0.504

1/[S]

-

2.825

1.996

4.329

2.986

4.424

1.984

1/v

-

0.275

0.195

0.422

0.290

0.431

0.194

Lineweaver-Burk双倒数值线方程：

Km=194.6Vmax=2000

3.3pH值、温度、抑制剂对蔗糖酶活性的影响

3.3.1酶活力预试

注:

酶活预测受到诸多因素的影响,数据无效

3.3.2pH对蔗糖酶活性的影响

pH对蔗糖酶活性的影响

试管号

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

pH

2.5

3.0

3.5

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.0

6.5

7.0

A520

0.002

0.011

0.001

0.043

0.009

0.250

0.272

0.375

0.467

0.006

0.013

0.033

注：

由于酶活力预测时蔗糖污染的影响，导致蔗糖酶稀释过度，数值偏小

3.3.3温度对蔗糖酶活性的影响

温度对蔗糖酶活性的影响

试管号

1

2

3

4

5

6

7

温度

0

25

35

45

55

65

75

OD520

0.114

0.458

0.483

1.135

1.178

0.992

0.722

3.3.4脲抑制剂对蔗糖酶活性的影响

脲抑制剂对蔗糖酶活性的影响

试管号

1

2

3

4

5

6

7

V脲（4mol/L）

0.1

0.2

0.3

0.5

1.0

1.5

2.0

未加脲（OD值）

0.335

0.562

0.728

0.879

0.941

0.988

-

加脲（OD值）

0.119

0.388

0.433

0.540

0.648

0.720

0.767

注:

3.3.33.3.4数据结果分别来源取自合作组13AB

4讨论

4.1酵母蔗糖酶的制备

啤酒酵母中的蔗糖酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶（externalyeastinvertase）,其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50%糖成分的糖蛋白。

在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶（internalyeastinvertase），含有少量的糖。

两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万（或22万，与酵母的来源有关），内酶约为13.5万。

两种酶底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。

4.2底物浓度对催化反应速度的影响及来米氏常数Km和最大反应速度Vmax的测定

根据Michaelis-Menten 方程：

可以推得Lineweaver-Burk双倒数值线方程：

在1/V纵轴上的截距是1/Vmax，在1/［S］横轴上的截距是－1/Km。

测定Km和Vmax，特别是测定Km，是酶学研究的基本内容之一，Km是酶的一个基本的特性常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质，特别是同一种酶能够作用于几种不同的底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力强弱，Km值越大，说明酶与底物的亲和力越弱，反之，Km值越小，酶与底物的亲和力越强。

图1双倒数图

这部分实验期望1ml酶液的活力应该在0.4—1.6mg葡萄糖含量之间为宜,从而与所做标准曲线相对应,但由于底物与酶的比例选择不当,葡萄糖标准曲线由于某种原因也不很理性（可能与显色反应时间和温度控制有关）且操作中可能带来的污染,使结果不能令人满意,图表中斜体表示的数据,即第三管数据极不符合趋势。

且本图为双倒数形式，所作图x，y轴分别为1/[s]，1/v，无法显示酶活性随底物浓度变化趋势，即图中显示点的顺序非底物浓度增加的顺序，造成规则直线的假象（这一点已做原始图表说明），所以结论是由于试剂用量等方面的问题本部分实验结果不具参考价值。

4.3pH值、温度、抑制剂对蔗糖酶活性的影响

4.3.1pH值对蔗糖酶活性的影响

酶的生物学特性之一便是其对酸碱度的敏感性，酶的活性和稳定性易受环境pH的影响。

pH对酶的活性的影响极为显著，通常各种酶只在一定的pH范围内才表现出活性，同一种酶在不同的pH值下所表现的活性不同，其表现活性最高时的pH值称为酶的最适pH。

各种酶在特定条件下最适pH各不相同。

酶溶液pH值之所以会影响酶的活性，很可能是因为它改变了酶活性部位有关基团的解离状态，而酶只有处于一种特殊的解离形式时才具有活性，例如：

H＋H＋

EH2＋＋EHE－

pKa1（有活性）pKa2

酶的活性部位有关基团的解离形式如果发生变化，都将使酶转入“无活性”状态。

在最适pH时，酶分子上活性基团的解离状态最适合于酶与底物的作用。

此外，缓冲系统的离子性质和离子强度也会对酶的催化反应产生影响。

蔗糖酶有两组离子化活性基团，它们均影响酶水解蔗糖的能力。

其解离常数分别是pKa=7和pKa=3。

制作pH与酶活性的关系曲线，即保持其它条件恒定，在不同pH条件下测定酶促反应速度，以pH值为横座标，反应速度为纵座标作图，由此曲线，可以了解反应速度随pH值变化的情况，且可以求得酶的最适PH。

本部分实验由于蔗糖溶液的污染，使酶活预测步骤参考价值不大，虽然反复，但终因为干扰因素过多（如所领比色皿中有一只上附有不易洗掉的污渍）最后决定的用量为一般估计，导致酶溶液稀释过度，总体数值偏小。

结果粗略估计蔗糖酶的适宜pH值范围为4.5—5.5，曲线显示峰值，即最适pH值落在5.4附近，可能会与真值有所出入。

4.3.2温度对蔗糖酶活性的影响

对温度的敏感性是酶的又一重要特性。

温度对酶的作用具有双重影响，一方面温度升高会加速酶反应速度；另一方面又会加速酶蛋白的变性速度，因此，在较低的温度范围内，酶反应速度随温度升高而增大，但是超过一定温度后，反应速度反而下降。

酶反应速度达到最大时的温度称为酶反应的最适温度。

如果保持其它反应条件恒定，在一系列不同的温度下测定酶活力，即可得到温度～酶活性曲线，并得到酶反应的最适温度。

最适温度不是一个恒定的数值，它与反应条件有关。

例如反应时间延长，最适温度将降低。

大多数酶在60℃以上变性失活，个别的酶可以耐100℃左右的高温。

本实验除了测定蔗糖酶催化蔗糖水解反应的热稳定温度范围与最适温度外，还可以同时测定反应的活化能。

活化能可用阿累尼乌斯方程式计算：

式中：

Ea为话化能（Cal/mole），k为反应速度常数（moles/min），R为气体常数（1.987Cal/deg﹒mole），T为绝对温度（℃+273），A为常数。

活化能越低，反应速度就越快。

酶作为催化剂可以大大降低反应的活化能，从而大大增加反应的速度。

蔗糖酶催化反应的活化能比酸催化反应的活化能小的多，说明酸催化的能力远不及蔗糖酶。

本实验即以酸催化作为对照，排除酸催化影响。

这部分实验数据取自13组A，从图表结果看，虽然曲线平滑性不佳，但可以看到最适温度约为50oC。

4.3.3脲抑制剂对蔗糖酶活性的影响

抑制剂I与酶的活性部位结合，改变了酶活性部位的结构或性质，通过阻止ES复合物的形成或阻止ES转变成E+P的反应引起酶活力下降。

根据抑制剂与酶结合的特点可分为可逆与不可逆抑制剂。

这二种抑制剂类型可以通过实验进行判断：

在固定抑制浓度的情况下，用一系列不同浓度的酶与抑制剂结合，并测定反应速度。

以反应速度对酶浓度作图，根据曲线的特征即可判断之。

在可逆抑制类型中可分为竞争性抑制，非竞争性抑制和反竞争性抑制三种：

竞争性抑制剂非竞争性抑制剂

本实验图表基本显示数值趋势,由实验结果作图可见，脲抑制剂为非竞争性可逆抑制剂。

（数据图表由13组B提供）

4.4对实验的改进意见

本实验遇到理论值与实际值不符的现象，对实验过程中可能遇到的问题应做足估计（如酶、试剂、仪器用品的保存，实验数值etc），这也要求我们做好预习，做到理论联系实际。

[参考文献]

[1]邵雪玲，毛歆，郭一清.生物化学与分子生物学实验指导.武汉:

武汉大学出版社,2003,10

[2]张楚富.生物化学原理.北京:

高等教育出版社,2003,9

[3]王镜岩等.生物化学实验指导.北京：

高等教育出版社，2003，8