GPC3CART回输制剂生产工艺的研究资料及验证资料.docx
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GPC3CART回输制剂生产工艺的研究资料及验证资料
申请分类：
新药
注册分类：
治疗用生物制品1类
药品名称靶向GPC3的自体CAR-T细胞回输制剂
资料项目名称生产工艺的研究资料及验证资料
资料项目编号
申请机构：
申请机构地址：
申请机构电话：
申请机构主要研究者姓名：
试验者姓名：
试验起止日期：
原始资料的保存地点：
联系人姓名、电话：
药品注册申请人名称：
缩略词对照表
序号
缩略词
全称
1
GPC3-CAR-T
靶向GPC3的自体CAR-T细胞
2
HSA
人血清白蛋白
3
YG-M-C
培养基
4
YG-PS-A
保存液
靶向GPC3的自体CAR-T细胞回输制剂
生产工艺研究资料及验证资料
本注册申报资料拟对靶向GPC3的自体CAR-T细胞回输制剂的生产工艺和贮藏条件进行研究，采用悬浮培养法，经过分离、分选、培养、激活、扩增、收获等步骤制得的细胞悬液，含适量保存液。
建立了一套从分离培养至细胞制剂的标准生产工艺方案和质控方法，为靶向GPC3的自体CAR-T细胞回输制剂成品提供质量可控的细胞来源。
1靶向GPC3的自体CAR-T细胞
本产品属于基因改造的免疫细胞，以GPC3为靶点，通过将靶向GPC3的单链抗体GC33与共刺激分子CD28、CD137和CD3ζ链的胞内信号结构域进行融合重组，构建抗-GPC3-CD28-CD137-CD3ζ的慢病毒表达载体，制备GPC3-CAR分子修饰的T细胞。
2培养基的选择
2.1研究背景
细胞培养是指模拟体内环境，使细胞在体外生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。
常用的细胞培养体系包括细胞培养基，无菌无毒环境，恒定的温湿度等等。
培养基的主要成份为氨基酸，碳水化合物，无机盐，维生素，血清，生长因子以及其它成份。
胎牛血清是细胞体外扩增时常常采用的培养成份，这种血清带有动物来源的抗原，会在临床上引起很多潜在的危险，移植到人体内后可能会产生严重的过敏反应和免疫排斥反应。
其他的危险性包括病毒和细菌感染、朊病毒和未知的动物传染病[1-3]。
有报道采用异基因的人血清、富含血小板的血浆和人血小板裂解物来培养扩增干细胞[4-6]。
然而，血清因为批次之间的差异性影响体外培养细胞的可重复性。
为了培养质量可控，使用安全，重复性高的细胞产品，本项目选择了无血清无抗生素成份的细胞培养体系，避免以往使用的含人或动物血清培养体系,导致不同程度的异种蛋白混入而引起的排异反应，以及抗生素残留对人体的影响。
本研究拟对不同培养基进行筛选，通过考察细胞的收获量，形态等指标，最终确定最优化的细胞培养基体系，为临床应用提供支持。
根据培养基临床应用的需要，选择了以下3种国内外市场上常见的无血清培养基（见下表9-1），作为细胞的备用培养基进行考察。
表9-1培养基选择方案一览表
编号
无血清培养基
货号
厂商
A
免疫细胞无血清培养基
ALyS505N
珠海贝索
B
PC-1TM培养基
77232
Lonza（龙沙）集团
C
FasGrow
10150
北京百乐通
2.2仪器设备
医用洁净工作台SW-CJ-2F 苏州净化设备有限公司
离心机8420KUBOTA（日本久保田）
生物显微镜CX21OLYMPUS（奥林巴斯公司）
倒置相差显微镜IX71 OLYMPUS（奥林巴斯公司）
细胞培养箱MCO-20AIC SANYO（三洋电机有限公司）
2.3实验方案
（1）将外周血分离所得的单个核细胞取样，用countstar全自动细胞计数仪进行计数；
（2）按照免疫磁珠分选试剂盒（Dynabeads®人T细胞活化剂CD3/CD28）的说明书的方法，按照1:
1的比例加入偶联CD3/CD28抗体的磁珠（beads），轻轻震荡20min，利用磁力架，得到CD3阳性的T细胞。
（3）将CD3阳性T细胞用上述三种培养基进行分别培养，按照1*106/ml细胞接种，进行培养，加入300U/mLIL-2、50ng/mLIL-7、100ng/mLPHA，进行培养。
（4）72小时后，细胞激活，且得到纯度比较高的T细胞，可以用流式细胞仪检测CD69/CD8的细胞的比例。
此时，可以用含CAR的慢病毒对培养的细胞进行感染。
（5）再过12小时后，进行全量换液，以去除感染用的病毒，然后继续培养；根据细胞长势在后续的培养过程中进行细胞半换液，以补充细胞生长过程中所需的营养物质。
2.4结果讨论
通过A/B/C三种不同培养系统下培养的实验研究，考察不同培养体系下不同细胞的形态，融合度，计数等指标，结果发现：
1）细胞培养结果表明：
B，C培养基细胞生长较差，不适合本生产工艺。
2）细胞融合情况：
A的细胞生长较密集，培养72小时后，融合度达到85%-95%左右；而B和C就相对长得比较稀松，融合度在70%-75%左右。
3）计数结果：
收获量最大的是A培养基。
B培养的细胞出现了很多亮点，已经呈现老化现象。
实验表明,随着培养代次的增加，C培养体系下细胞形态逐渐老化。
综上所述，细胞在A培养基下培养都能获得最多的细胞收获量和较佳的细胞形态，同时A培养基培养出来的细胞也符合GPC3-CAR-T细胞的质控标准，故A培养基为优选培养基。
2.5培养基主要成分
试剂中文名
试剂英文名
来源
供应商
L-谷氨酸
L-Glutamine
非动物源
invitrogen
DMEM/F12
DMEM
非动物源
invitrogen
胰蛋白酶
TRYPSIN0.25%EDTA
非动物源
invitrogen
人转铁蛋白
HumanHoloTransferrin
人源
R&D
PBS
PBS
非动物源
invitrogen
DME/F12培养基
DME/F12
非动物源
hyclone
羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液
HEPES
非动物源
sigma
重组人血小板源性生长因子
PDGF-BB
非动物源
R&D
成纤细胞生长因子
bFGF
非动物源
R&D
人转化生长因子
TGF-β1
非动物源
R&D
3制备工艺路线的选择
根据国内外有关CAR-T细胞的分离培养研究方法，结合本公司实际情况，研究出一套生产可行，质量可控的靶向GPC3的自体CAR-T细胞回输制剂的分离、培养、传代、收获等一系列的制备工艺和质控方法，并在该工艺下对培养出来的细胞纯度，形态，鉴别，检查以及相关生物学特性进行质量研究，制订本产品的质量标准。
3.1实验方案
采集外周血50mL，以2000r·min-1离心l0min，收集上层自体血浆，56℃水浴灭活30min，置于4℃冷藏备用。
下层血液与磷酸盐缓冲液（PBS）按1∶1稀释吹打均匀，加入2倍体积的淋巴细胞分离液，以2000r·min-1离心30min。
吸取单个核细胞层，PBS洗涤细胞2次，以1500r·min-1离心10min。
将细胞沉淀用含10%自体血浆的ALyS505N无血清培养基重悬，添加终浓度为50ng·mL-1抗CD3单克隆抗体、1000U·mL-1IFN-γ，放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养。
于第2天，添加CD3/CD28抗体偶联磁珠激活T淋巴细胞（CD3/CD28抗体偶联磁珠与T淋巴细胞的比例为3:
1），同时添加终浓度为100U·mL-1IL-1α、300U·mL-1IL-2、30ng·mL-1IL-7。
于第3天，按病毒和培养基的体积比1：
500添加病毒液，病毒感染10天后，采用流式细胞术检测CAR的表达情况。
仪器设备：
医用洁净工作台SW-CJ-2F 苏州净化设备有限公司
离心机8420KUBOTA（日本久保田）
生物显微镜CX21OLYMPUS（奥林巴斯公司）
倒置相差显微镜IX71 OLYMPUS（奥林巴斯公司）
细胞培养箱MCO-20AIC SANYO（三洋电机有限公司）
3.1.1实验步骤
（1）设计GPC3-CAR分子。
选择可特异性识别GPC3的单链抗体GC33、CD8α铰链区、CD28的穿膜结构域，以及共刺激分子CD28、CD137和CD3ζ链的胞内信号结构域为模版，通过柔性连接链将这些结构串联，获得完整的可固定表达于Ｔ细胞膜上的CAR分子。
此外，在遵循偏爱密码子的基础上，根据氨基酸密码子的简并性在
保证氨基酸序列不变的情况下对基因序列进行改造，以增强CAR分子的表达效率。
（2）构建GPC3-CAR慢病毒表达载体。
利用PCR和分子克隆技术按上述设计将识别GPC3抗原的单链抗体GC33与共刺激分子CD28、CD137和CD3ζ链的胞内信号结构域进行基因重组，随后通过人工合成和拼接技术，获得靶向GPC3抗原的GPC3-CAR基因片段，再以XbaⅠ和BamHⅠ限制性酶切位点为克隆位点，利用亚克隆技术将GPC3-CAR基因片段插入慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1α-copGFP中，最终获得携带GPC3-CAR基因片段的慢病毒表达载体pCDH-CMV-GPC3-CAR-EF1α-copGFP。
（3）包装GPC3-CAR慢病毒。
用DMEM-HG培养基培养293FT细胞，将汇合度70%~80%的培养细胞接种到10cm培养皿中，含10%胎牛血清的DMEM-HG培养基换液。
取2个1.5mlEP管，各加入500μl无血清DMEM-HG培养基，将3种慢病毒包装质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG与慢病毒表达载体按1∶1∶1∶1的比例混合后加入到1个EP管，另1个EP管加入PolyJetTM，3种包装质粒加上慢病毒表达载体的质量与PolyJetTM体积比为1∶3。
将2个EP管各自混匀后静置5min，随后将装有Poly-JetTM的EP管中的液体缓缓加入装有质粒的EP管中，轻轻混匀后室温静置20min。
然后将此复合物加入到培养的293FT细胞中，培养16h后弃掉上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM-HG培养基继续培养。
24h后荧光显微镜观察绿色荧光的发光情况，48h后收取上清液，于4℃条件下12000×g离心20min，0.45μm滤器过滤后用1.5mlEP管分装后-80℃冻存备用。
（4）制备GPC3-CAR慢病毒感染T细胞。
取健康志愿者外周血，用Ficoll淋巴细胞分离液和密度梯度离心法分离得到PBMC。
用含10%胎牛血清的KBM551培养基重悬细胞（2×106个/ml），并接种于T25培养瓶内，加入IFN-γ（1000IU/ml），24h后加rIL-2（300IU/ml）和抗CD3抗体（50ng/ml）。
72h后用GPC3-CAR慢病毒按8PFU慢病毒/细胞的感染复数感染T细胞。
感染后的T细胞（5×105/ml）继续培养，每隔1d加rIL-2（300U/ml）。
（6）流式细胞术鉴定GPC3-CAR分子阳性Ｔ细胞比率。
将GPC3-CAR慢病毒感染组T细胞收集到15ml离心管中，200×g离心5min后弃上清，加入1mlPBS重悬细胞，200×g离心5min后弃上清，再加入0.2mlPBS重悬细胞（5×106个/ml）后流式细胞仪检测T细胞的绿色荧光表达情况，以表达绿色荧光的T细胞为GPC3-CAR表达阳性。
（7）ELISA检测GPC3-CAR-T细胞IFN-γ的分泌水平。
将GPC3阳性的Huh-7细胞与GPC3阴性的SK-HEP-1细胞接种于12孔板（5×104个/孔），待细胞贴壁后，CAR-T组按照效靶比0.5∶1、1∶1和2∶1分别加入2.5×104、5×104和1×105个GPC3-CAR-T细胞，空载病毒组按照效靶比0.5∶1、1∶1和2∶1分别加入2.5×104、5×104和1×105个空载病毒感染的T细胞，对照组只加入2.5×104、5×104和1×105个GPC3-CAR-T细胞。
每组设3个复孔，共培养24h后3000×g离心10min，收集上清液，用ELISA试剂盒检测IFN-γ水平。
将100μl收集的各组上清液加入到相应孔中，之后按试剂盒说明书操作，测量450nm波长处光密度（D）值，并根据标准曲线计算各样本的IFN-γ（μl/ml）水平。
3.2实验结果
4.2.1Westernblotting检测GPC3-CAR分子在CAR-T细胞内表达（属于定性检测）
Westernblotting检测结果（图1）显示，在GPC3-CAR-T细胞中可见蛋白相对分子质量约为16kD和55kD蛋白带2条，而对照组T细胞仅见16kD内源性CD3ζ条带，而GPC3-CAR的相对分子质量为55kD，提示GPC3-CAR-T细胞确实能表达GPC3-CAR分子。
3.2.2流式细胞术检测慢病毒感染T细胞后表达的GPC3-CAR分子
GPC3-CAR重组的慢病毒感染T细胞后，用流式细胞术检测T细胞中GPC3-CAR分子表达结果（图2）显示，约54.88%GPC3-CAR慢病毒感染的T细胞（GPC3-Tcell）表达GPC3-CAR分子。
3.2.3ELISA检测GPC3-CAR-T细胞IFN-γ的分泌水平
在ELISA检测细胞因子释放实验中，与GPC3阳性Huh-7细胞共培养，GPC3-CAR-T细胞组CAR-T细胞比空载慢病毒感染的空载病毒组产生更多的IFN-γ[（21371.4±1808.3）vs（152.8±12.5）pg/ml,P<0.01]（图A）。
然而，当这两组T细胞与GPC3的SK-HEP-1细胞共培养时，IFN-γ的分泌量仅轻微增加[（153.9±13.2）vs（150.6±21.9）pg/ml,P>0.05]（图B）。
4生产过程主要工艺参数和质控参数
4.1生产过程主要工艺参数
见下表4-1。
表4-1主要生产过程工艺参数一览表
序号
工序
关键控制项目
控制参数
1
GPC3-CAR分子设计
scfv的亲和力
10-4-10-8M
胞内区共刺激分子数量
2
添加酶切位点
序列5’端和3’端添加不同的酶切位点，以便定向克隆
2
GPC3-CAR慢病毒表达载体构建
GPC3-CAR质粒酶切和慢病毒转移载体酶切
酶切时间2h
GPC3-CAR质粒酶切和慢病毒转移载体连接
GPC3-CAR质粒酶切和慢病毒转移载体摩尔比为3:
1
连接产物转化
热激时间90s
293T细胞密度
接种密度为50%，转染时细胞密度为70%
培养基要求
含110mg/L丙酮酸钠、10%FBS的高糖DMEM
慢病毒转染效率
80%以上
慢病毒收集时间
48h和72h
慢病毒过滤杂质
0.45微米的过滤器过滤
4
GPC3-CAR慢病毒感染T细胞制备
Ficoll分离单个核细胞
2000rpm，20min，
慢升慢降
CD3/CD28磁珠与T细胞比例
3:
1
感染滴度
5
感染时间
10-14d
4.2生产过程主要质控参数
见下表4-1。
表4-1主要生产过程质控参数一览表
类别
样品
质控项目
质控方法
标准
规定
频次
处理
样本
检测
血
液
筛
查
HIV-1/2抗体
酶联免疫法
阴性
每份
HBsAg
酶联免疫法
阴性
每份
HCVAb
酶联免疫法
阴性
每份
Anti-TP
酶联免疫法
阴性
每份
细胞制备过程检测
细胞末次洗涤上清
需氧菌及真菌
全自动细菌分枝杆菌培养监测系统检测法
阴性
每批
厌氧菌及真菌
全自动细菌分枝杆菌培养监测系统检测法
阴性
每批
细胞培养D5
细胞形态
镜下观察
圆球状细胞，呈集落状聚团
每批
含细胞的培养液
无菌
直接培养法
不得检出
每批
细胞冻存
收集
细胞前
细胞形态
镜下观察
呈悬浮，应为集落圆团细胞
每批
细胞悬液
细胞计数
细胞计数仪检测
标示量的90%～120%
每批
细胞悬液
细胞活率
细胞计数仪检测
≥85%
每批
细胞悬液
无菌
需氧菌
及真菌
全自动细菌分枝杆菌培养监测系统检测法
阴性
每批
厌氧菌
及真菌
全自动细菌分枝杆菌培养监测系统检测法
阴性
每批
细胞悬液及上清
支原体
培养法及
DNA染色法
阴性
每批
细胞悬液
细胞表面抗原分析
流式细胞术（FCM）
符合规定
每批
细胞悬液
GPC3-CAR分子
表达率
流式细胞术
检测
符合规定
每批
细胞悬液
IFN-γ的分泌水平
ELISA检测
符合规定
每批
5生产工艺的验证
6生产过程的无菌控制
本品作为注射用生物制品，成品具有生物活性无法进行常规的灭菌程序，为保证靶向GPC3的自体CAR-T细胞的无菌，细胞在生产制备过程中分别通过人、机、料、法、环等几个方面进行无菌的管控工作。
――人员：
制备全过程涉及的制备人员、检测人员均应持有公司技术部门核发的《上岗证》，经过相关无菌操作的培训及考核合格上方可上岗工作；制备期间，其个人健康及卫生均应符合相关规定，各项操作均需参照《无菌操作管理规程》《洁净室卫生管理规程》执行；
――仪器：
制备全过程涉及的仪器设备均应运行正常且应及时填写《设备运行记录》；需灭菌使用的容器具，其灭菌过程应处于受控状态，灭菌符合规定，且在规定有效期内。
――物料：
细胞制备全过程所用原、辅料应经确认来自合格供应商，关键物料应有厂家出具的全检报告，无外源性污染。
物料进出洁净区按照《物料进入洁净区标准操作程序》进行消毒或灭菌后方可进入洁净工作区和用于生产制备。
――环境：
细胞制备区域环境监控应符合规定要求，定期对洁净制备区的沉降菌、尘埃粒子以及洁净空调系统的换气、平均风速等开展检测；如有传染病原体或污染物，均应得到有效隔离，并按照《实验室发现细胞污染的标准操作程序》执行。
――操作：
细胞制备工艺操作过程应符合对应SOP的规定；操作过程应满足无菌要求，制备现场应无污染及交叉污染。
细胞制备各工序完毕后均应及时清场，符合《清场管理规程》的要求。
制备记录、监控记录填写应符合规定要求，并与制备过程相符，有操作者，复核者签名，细胞制备档案内容应完整并经复核。
依据《细胞制备过程质量控制点》的要求送样并按规定要求进行检测，通过生产工艺各过程质控点监控产品是否受到微生物的污染，检测结果应符合规定。
QA人员依照《过程控制管理规程》，确保细胞制备过程相关因素受控，确保细胞质量的安全。
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