益生菌发酵扶正解毒散项目.docx

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益生菌发酵扶正解毒散项目

申报项目实施方案

项目名称：

益生菌生物转化扶正解毒散关键技术研究及应用

第一章基本情况

1、项目概述

1.1项目立项背景

当前，畜牧业滥用抗生素的问题较为严重，抗生素、化学合成药及激素类药物在养猪生产中的大量使用给养殖动物及环境带来极大的危害，影响食品安全和人民健康。

同时，造成动物消化道菌群失调和器官损伤，导致畜禽内源性感染和二重感染。

另外，动物病原菌产生的耐药性，可通过食物链转移给人类，危害人类的健康。

但是，目前动物疾病如病毒性、细菌性、营养性疾病流行严重且病情较为复杂，因此，抗生素替代品的开发是一个亟待解决的问题。

农业部于2015年7月20日颁布的全国兽药（抗菌药）综合治理五年行动方案（2015-2019）中指出，加大兽用抗菌药替代药物的研发力度，鼓励和支持新兽药研发，提高评审效率，加强相关新产品、新技术储备、及时将证明安全有效的产品纳入允许使用范围，鼓励推广使用，从源头上降低兽药残留水平。

河南牧业经济学院益生菌发酵中药科研团队从2010年开始进行益生菌生物转化中药技术的研究，目前，已开发出多种液体和固体发酵产品，申请国家发明专利13项，已授权5项。

通过近几年在临床生产中进行应用，具有调节机体免疫力、改善肠道菌群、提高畜禽生产性能、无药物残留、无耐药性，且具有营养和药用的双重作用。

扶正解毒散是传统经典组方，在提高猪体免疫力方面效果显著，并具有抗病毒、抗菌、改善机体生理状态的功能，应用广泛且效果显著。

益生菌生物转化扶正解毒散的作用机理：

中药成分经过乳酸菌及其代谢产物（酶、有机酸）生物转化后，中药有效成分被充分释放，使其具有更强的生物活性和疗效，且具有“安全、绿色、无残留”等特性。

利用乳酸菌生物转化扶正解毒散而制得集“中药、酶制剂、益生素”与一体的产品，将会更有力地推动畜牧业的健康发展。

第二章可行性分析

1、必要性

中国是养猪大国，生猪存栏约5亿头，年出栏约7亿头，占世界产量的50%左右，猪肉消费约占国民肉类消费的65%。

但是目前抗生素在猪生产中的滥用现象十分广泛，造成的药物残留超标、细菌耐药性和环境污染等问题也十分严重，鉴于食品安全等方面的考虑，开发无抗、无残留、无毒副作用药物和饲料添加剂替代抗生素迫在眉睫。

乳酸菌生物转化扶正解毒散作为绿色、无污染、无残留的动物保健产品，加大对其资金扶持，符合国家农业部对于遏制畜禽滥用抗生素，促进食品安全的产业政策。

河南牧业经济学院益生菌发酵中药科研团队制定了长远的发展规划，力争2018年乳酸菌生物转化扶正解毒散及其衍生产品年生产量达到600t，年销售额达到1200万元，实行公司销售制，力争产品覆盖全国绝大多数省份。

2、市场需求与预测效益

2.1市场需求

当前养猪业正处于一个变革期，尤其是兽药企业正在经历阵痛，如何改变过去以往以抗生素为主打产品转变为绿色、健康产品，是很多兽药企业迫切需要的。

乳酸菌生物转化扶正解毒散是一种在生产过程中无污染，而且能提高动物免疫力的产品、改善动物肠道健康。

扶正解毒散主要成分为黄芪、板蓝根和淫羊藿，均为纯天然物质，无残留、无耐药性，安全可靠，而且兼有营养和药效双重功能。

乳酸菌具有平衡动物体内菌群，促进生长、提高消化率、减少腹泻、提高免疫力等作用，扶正解毒散和乳酸菌的结合可以使二者的优势充分发挥，对于畜禽生产具有非常重要的作用，不仅可以获得良好的防病、治病和促生长效果，而且可以使抗药性和药物残留问题迎刃而解。

2.1.1符合社会需求

有益微生物生物转化中药技术发展的最强大的动力来自社会需求。

现代畜牧业行情要求发展有自主知识产权的创新中药，时代发展要求中兽药现代化，需要毒副作用小、功效显著的中药。

现代中药生物转化新技术十分符合上述要求。

2.1.2技术可行

生物技术、发酵技术、分离技术、检测技术、药理实验技术等随着时代的进步，已经发展到能够满足中药发酵创新研究需要的水平。

2.1.3广阔的新领域

乳酸菌及其优良的代谢特性和相对空白的中药发酵应用领域为中药发酵开辟了广阔的新领域。

2.1.4衍生领域多

乳酸菌生物转化中药的产品很适合推广到功能食品、饲料、化妆品等新领域。

物转化中药研究势必推进生物活性物质的研究。

生产可控性好、便于工业化生产。

2.2经济效益分析

2.2.1预期经济效益

在经济上，近年来，我国因疾病、兽药残留、重金属等有毒有害物质超标而被进口国拒绝、扣留、退货、索赔和终止合同的事件时有发生。

乳酸菌生物转化扶正解毒散及其衍生物的应用能够解决畜牧生产上药物及其他添加剂残留问题，为我国出口产品创汇打下坚实的基础。

通过提供新产品，能够提高生产中动物生产、疾病预防和防治能力，能够产生明显的经济效益。

项目建成后，按年生产能力2000t计算，按照20元/kg计算，年实现销售收入4000万元。

按现有生产成本：

年需要中药费、菌种费用1800万，设备费200万，厂房费50万元，人员工资1000万，电费、水费等120万元，管理费等杂费100万元，年实现销售利润730万元。

2.2.2社会效益分析

通过项目实施，发展一个乳酸菌生物转化扶正解毒散及其衍生物的生产基地，带动工人就业260人（包括车间生产人员和销售人员），示范带动30个养殖基地，2200个养殖户，按照每个养殖场、户养猪100头计算，使用乳酸菌生物转化扶正解毒散每头增加利润30元计算，年增加农民收入669万元，同时在搞好示范养殖户的基础上，实行以点带线、以线带面的推广模式，促进河南省及周边省份产品的推广，使乳酸菌生物转化扶正解毒散及其衍生物在全国地区推广率达大幅度提高。

2.2.3生态效益分析

乳酸菌生物转化中药对生态环境影响甚少，在菌种生产、中药生物转化过程中，无有害物质的排放，且耗能较低；养猪生产中使用乳酸菌生物转化中药能减少氨气、二氧化硫、二氧化碳的排放，对环境产生有利的影响。

第三章项目主要内容

1重点支持的主推技术

主推技术为乳酸菌生物转化液体扶正解毒散技术、乳酸菌生物转化固体扶正解毒散技术以及与之配套的畜禽绿色健康养殖技术。

1.1乳酸菌生物转化液体扶正解毒散技术

通过筛选出1株乳酸菌，利用中药黄芪、板蓝根、淫羊藿作为培养乳酸菌的培养基成分，进行培养基的优化筛选，然后进行菌种的制备、二次发酵和大罐发酵制备，大大提高生物转化效果。

其技术一般分三个阶段，即培养基的筛选、培养条件优化和大罐发酵，现将主要技术简述如下：

1.1.1培养基筛选技术

称取适量黄芪、板蓝根、淫羊藿、扶正解毒散分别于蒸煮锅中，加入5倍于中药重量的水，煮沸30分钟取提取药液，然后依上法再分别加3倍、2倍的水进行第二和第三次的提取。

分别混合三次提取液浓缩至二倍于每种中药的重量。

将乳酸菌甘油冻存管菌种接入MRS肉汤培养基中，37℃培养24h。

将制备的黄芪、板蓝根、淫羊藿、扶正解毒散提取液按1%、5%、10%、20%、40%、80%、100%的比例，添加适量MRS肉汤营养成分，不足部分用蒸馏水补充至100%，分别命名为H1-7号、B1-7号、Y1-7、F1-7号培养基，分装于500mL的三角瓶中。

将培养的种子液以3%的量接种于21种发酵培养基中，37℃恒温培养72h，分别在24h、48h、72h时镜检，并测定培养液内活菌量，研究不同中药不同比例添加量对乳酸菌生长的影响。

称取适量扶正解毒散于蒸煮锅中，加入5倍于中药重量的水，煮沸30分钟取提取药液，然后依上法再分别加3倍、2倍的水进行第二和第三次的提取。

分别混合三次提取液浓缩至二倍于复合中药的重量。

将乳酸菌甘油冻存管菌种接入MRS肉汤培养基中，37℃培养24h。

将制备的扶正解毒散提取液，添加适量红糖、蛋白胨、酵母粉设计9种发酵培养基，分别命名为1-9号培养基，分装于500mL的三角瓶中。

将培养的种子液以3%的量接种于9种发酵培养基中，37℃恒温培养72h，分别在24h、48h、72h时镜检，并测定培养液内活菌量。

用筛选后得到的最优培养基作为基础培养基，设定培养条件为pH值7.0、培养温度37℃、装液量350mL（500mL三角瓶）、接种量3%进行发酵培养。

1.1.2培养条件优化

采用单因子试验法，对培养基最佳初始酸碱度进行测定。

用1mol/L的氢氧化钠对筛选好的培养基进行pH值调节，设定pH值5、6、7、8、9五个试验组，每组两个重复，待培养结束（按培养基筛选结果）测定每毫升发酵液活菌数。

最适接种量的测定：

将培养好的液体菌种分别以1%、2%、3%、4%、5%的接种量接种于培养基，待发酵结束，测定每毫升发酵液活菌数,以测定接种量对菌种生长性能的影响。

最适培养温度的测定：

以培养温度为变量，设置25℃、30℃、35℃、37℃、42℃五个对照组，每组两个重复，待发酵完成，测定每毫升发酵液活菌数，评价温度对乳酸菌生长性能的影响。

最佳装液量的测定：

在500mL的三角瓶中，分别装入200mL、300mL、400mL培养基，每个试验组设两个重复，待发酵完成，测定每毫升发酵液活菌数,确定最佳装液量。

最优培养基及培养条件的验证：

将以上所得的各种最佳培养基及培养条件进行组合，进行验证试验，检测指标为每毫升发酵液中乳酸菌活菌数，然后确定最终结果。

1.1.3发酵罐扩大试验

为了进一步确定试验结果的可靠性与实用性，利用全自动发酵罐及筛选后的培养基进行扩大试验，并检测产品质量（有效活菌数、pH值）。

步骤如下：

投料：

在发酵罐进料前先对其进行清洗1～2次，直至罐内清洁为止，以70%的装液量计算并称量所需各组分的量并投入其中，调节至合适酸碱度，并加入2%的消泡剂（甘油聚氧丙烯醚），投料结束后将进料口密闭。

灭菌：

对发酵罐内培养基进行在位灭菌，灭菌条件121℃、60min，灭菌结束后用自来水通过罐体夹层使其冷却。

接种：

待温度降至40℃时接种，在接种口周围设置火焰圈，打开接种口，将菌种倒入罐内，封闭接种口。

发酵：

设定发酵条件（按以上试验结果），开始发酵。

镜检：

在发酵24h后每隔6h镜检一次，待pH值稳定时发酵结束。

测数：

对发酵好的菌液进行测数（平板菌落计数法），并记录结果。

1.2乳酸菌生物转化固体扶正解毒散技术

由于乳酸菌是一种厌氧菌，所以利用乳酸菌作为固体发酵菌种生物转化扶正解毒散时具有发酵条件简单、不易受杂菌污染和耗能低的优点，通过生物转化固体扶正解毒散，制备出固态产品。

其技术一般分三个阶段，即固体培养基的筛选、培养条件优化、复合多糖、有机酸的测定，现将主要技术简述如下：

1.2.1固体培养基的筛选

菌种活化：

取出在冰箱冻存的乳酸菌甘油冻干管，迅速解冻，分别接入已灭菌的MRS液体培养基中，37℃条件下厌氧培养24h。

然后将两种菌分别以3%的接种量接种到已灭菌的MRS液体培养基中，37℃恒温培养24h，镜检，即得发酵所用的混合液体菌种。

中药添加量的确定：

首先以黄芪、板蓝根、淫羊藿、扶正解毒散的添加量为25%、50%、75%、100%分别分为四个组来培养乳酸菌，然后活菌计数，研究菌落生长情况。

为控制营养不均影响试验结果，前三组分别加25%营养基质（麸皮：

玉米：

苹果渣=1:

1:

1），第四组全用纯中药作为培养基，另外总体比例不足100%的，用惰性固体填充剂补充。

各组加水量（水与固体培养基的百分比）都为35%。

在121℃温度下灭菌21分钟，冷却后按5%的接种量将混合菌种接入各组培养基，37℃条件下厌氧培养72h，分别测各组固体培养基中乳酸菌的活菌含量，以确定用但味中药、和复合中药对乳酸菌进行固体培养的可能性以及确定最适的中药添加量。

1.2.2乳酸菌生物转化固体扶正解毒散工艺优化

发酵时间的确定：

扶正解毒散的添加量为50%，接种量5%，含水量为35%，培养温度为37℃，发酵时间为30d，分别在发酵第0d、6d、12d、18d、24d、30d测乳酸菌的含量、pH值以及有机酸的含量，以有机酸含量确定最终的发酵时间。

接种量的确定：

发酵培养基同上，接种量分别为3%、5%、10%、15%，含水量为35%，培养温度为37℃，发酵时间为30d。

分别在发酵第0d、6d、12d、18d、24d、30d测乳酸菌的含量、pH值以及有机酸的含量，以有机酸含量确定最终的发酵时间。

加水量的确定：

含水量分别为30%、40%、50%、60%、70%，接种量为5%，其它同上。

分别在发酵第0d、6d、12d、18d、24d、30d测乳酸菌的含量、pH值以及有机酸的含量，以有机酸含量确定最终的发酵时间。

1.3乳酸菌生物转化扶正解毒散应用技术

根据乳酸菌生物转化扶正解毒散的特性和不同阶段猪只利用保健品的方式不同，将乳酸菌生物转化液体扶正解毒散产品主要用于哺乳仔猪和保育猪，乳酸菌生物转化固体扶正解毒散主要用于种猪、母猪和育肥猪，将乳酸菌生物转化扶正解毒散技术在养猪业进行推广应用，通过测量其生产性能指标和免疫功能指标可以比较出其应用效果，逐步将乳酸菌生物转化扶正解毒散技术应用于养猪业，摒弃以前传统的靠抗生素大量使用的陋习，建立起预防保健、调节平衡、固本扶正的养殖新理念。

减少抗生素的滥用，从而促进食品安全。