内皮细胞培养步骤总结.docx

内皮细胞培养步骤总结.docx

《内皮细胞培养步骤总结.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《内皮细胞培养步骤总结.docx（13页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

内皮细胞培养步骤总结

内皮细胞培养步骤（总结,）

1..培养人脐静脉内皮细胞：

1材料与方法

1．1材料

1．1．1新生儿脐带在无菌条件下，于健康产妇分娩后立即取新生胎儿脐带。

长度>20cm，两端扎紧投入到4℃脐带保存液中，1h内送细胞培养室。

1．1．2仪器与试剂倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；超净工作台（苏州净化仪器厂）；5％C02培养箱（美国Heraeus公司）；离心机（上海安亭仪器厂）；25cm2培养瓶、六孔培养板（美国CA）star公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；促内皮细胞生长添加物（ECGS）、M199培养基、I型胶原酶（美国Sigrna公司）；明胶、胰酶（美国A1Tlresco公司）；灭菌生理盐水（锦州医学院附属第一医院制剂室）；鼠抗人Ⅷ因子单克隆抗体、辣根酶标记的二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1．2方法

1．2．1试剂配制：

（1）脐带保存液：

生理盐水、葡萄糖100mmoL／L、100U／ml青霉素一100U／m1链霉素。

（2）磷酸盐缓冲液（PBs）。

（3）D—Hanks液。

（4）0．1％I型胶原酶：

用PBS配制。

（5）0．05％胰酶一0．02％乙二胺四乙酸二钠盐（ED—TA）溶液：

用D—Hanks液配制。

内皮细胞培养液：

含20％胎牛血清、ECGS、肝素，100U／m1青霉素一100U／m1链霉素的M199培养基。

（7）0．2％明胶：

用PBS配制。

以上试剂均过滤除菌。

1．2．2人脐静脉内皮细胞的分离与原代培养：

参照Jaffe和LinS等方法并加以改进。

在无菌条件下取新生胎儿脐带，长度>20cm。

剪去脐带两端和脐带上有夹痕及血肿部分，尽量挤干净脐带内血液。

用生理盐水冲洗脐带表面至无血色。

用输血器内接有穿刺器的软管，找到脐静脉，将软管针头一端插入脐静脉，用止水夹固定，另一端接20m1注射器，吸取PBS反复冲洗脐静脉直至无血色液体流出为止；将脐带另一端用止血钳夹闭，向脐静脉中灌入0．1％I型胶原酶溶液，使之充盈，夹闭软管，37℃水浴中孵育20min，其间轻轻挤压并旋转脐带，以使酶溶液充分接触血管内壁，然后将细胞一酶溶液收集于预先装有温培养液小三角瓶中。

用2倍于消化液的温PBS冲洗脐静脉，一并收集于小三角瓶中，将细胞悬液装入10ml离心管，1000r／min离心10min，弃上清，吹打悬浮，再次离心10min，重悬细胞并接种于铺有明胶的25cm2培养瓶中，置于37℃5％C02饱和湿度培养箱中培养，24h后更换培养液，以后每隔2d换液1次。

1．2．3人脐静脉内皮细胞的传代培养当原代细胞融合80％以上后，加入0.05％胰蛋白酶一0.02％EDTA溶液消化，倒置显微镜下观察，当细胞皱缩变圆、彼此分离时弃消化液，加入细胞培养液终止消化，收集细胞悬液。

1000r/min离心10min，弃上清，制成单细胞悬液。

此时可用0.5％台盼蓝染色，计算活细胞百分率，并以血细胞计数板计数。

调整细胞浓度为1×105个／ml，接种于培养瓶或培养板中继续培养。

待细胞长满，彼此融合成片时依上述方法继续传代培养。

补充：

1.材料：

a：

脐带>20cm：

建议最好不要取这么长，10～15cm不会影响得到的细胞数，因为你冲洗脐带的时候要把它垂直的提起来，以观察底部流出液体的颜色，要是太长的话，在超净台里很难做到的！

b：

脐带保存液：

生理盐水、葡萄糖100mmoL／L、100U／ml青霉素一100U／m1链霉素：

建议将双抗的量改为十倍，1000u/l，因为原代最大的敌人就是污染，而第一步的取材是最容易污染的，所以要加大量，以后培基里就可以不加双抗了，因为抗生素对细胞的生长不利。

2.方法（你的不是很详细噢，补充几点）

a：

一般15cm左右的脐带用8ml胶原酶就可以了

b：

37度消化时间不要20min，那样会消化很多杂质比如成纤维细胞下来的，15cm足以

c：

传代的时候用0.25％的胰酶，这样就不用离心了，效果也还不错的说

内皮细胞在异种排斥反应中的作用（REVIEW）

目前异种移植的排斥反应主要包括超急性排斥反应（hyperacuterejection，HAR）、急性血管性排斥反应，acutevascularrejection，）或称延迟性排斥反应（delayedxenograftrejection，DXR）和细胞介导的排斥反应。

其中移植物血管内皮细胞活化所引起的一系列病理改变是引起异种排斥反应的主要环节[1]。

由于内皮细胞是移植物与受者免疫系统之间最直接的屏障，内皮细胞不仅是移植排斥反应主要的靶部位，而且本身的一系列反应也介导了移植物的损伤，扮演着双重身份。

内皮细胞的活化是由于天然抗体的结合和补体活化所产生的应答和相互作用的结果，是HAR和DXR发生的主要原因[2]。

已有大量文献报道通过抑制内皮细胞的活化可以延长异种移植物在受者体内的存活时间。

鉴于其在异种排斥中的重要地位，内皮细胞的研究越来越受到移植学者的关注。

一、内皮细胞的活化

血管内皮细胞位于血管腔内膜表面，为单层紧密排列、互相联结的一层薄膜，构成了一道循环血液与局部组织之间的屏障。

这种静息的内皮细胞不具有激活凝集素和抑制白细胞的附壁功能，因为内皮细胞的表面表达或分泌许多有助于抗凝和行使其它功能的分子，包括：

NO、前列腺素、血管紧张素、内皮素、硫酸肝素、血栓调节素和ATPDase（CD39）等，使内皮细胞具有调节血管紧张性、维持凝血平衡、调节细胞粘附和抑制炎症反应等功能[2,3]。

当内皮细胞受到损伤或与IL-1、肿瘤坏死因子和内毒素等接触后，即发生一系列代谢和结构的变化，这一过程称为内皮细胞激活。

移植物恢复血供后，受者异种天然抗体首先接触的靶细胞就是供者移植物的血管内皮细胞，之后进一步结合，激活补体，引起移植物内皮细胞活化[2]。

Bach将异种排斥反应中内皮细胞的激活分可为2个阶段：

①早期阶段由补体活化产物诱导，无基因的转录和蛋白合成，称Ⅰ型激活,包括:

内皮细胞形态变化,表面硫酸肝素丢失,Ｐ-选择素和vＷＦ（vonWillebrandfactor）在内皮细胞表面表达，与HAR关系密切；②Ⅱ型内皮细胞激活涉及到基因转录和蛋白合成，导致内皮细胞表面表达粘附分子、细胞因子和前凝血因子等，与DXR相关[1,4]。

其中在Ⅱ型内皮细胞激活过程中核转录核因子（NuclearFactor-κB,NF-κB）起到非常重要的作用，NF-κB是一种基因多显性转录因子，在静息内皮细胞内，NF-κB和IκB结合形成异二聚体，能抑制NF-κB进入细胞核。

内皮细胞的活化涉及一些基因的激活，包括粘附分子（如E-选择素，ICAM-1）、细胞因子（如IL-1、IL-8等）、生长因子和凝血系统一些成分的基因，这些基因的启动子区域都含有NF-κB的结合部位，内皮细胞活化后，IκB磷酸化降解，导致NF-κB进入细胞核，与这些基因启动子上的NF-κB结合位点结合，上调这些基因的表达[4,5]。

内皮细胞活化后可以多种途径进行应答，产生一系列活化后反应[2]，包括：

①内皮细胞收缩、血管失去完整性、内皮下基质暴露、细胞和蛋白质从血管内进入器官组织，导致出血和水肿；②粘附分子表达增加，例如，E-选择素、ICAM-I等；③分泌多种细胞因子和其它分子，例如IL-1、IL-6、IL-8和PAF等；④参与多种造成抗凝与促凝之间失衡的机制等。

由于NF-κB在内皮细胞活化的机制中起着非常重要的作用，所以抑制NF-κB的活性可以抑制内皮细胞的激活。

最初抑制NF-κB的研究集中在IκB的过度表达，IκB是NF-κB的天然抑制剂，IκB的过度表达能有效的抑制IκB，阻止促炎基因的上调，但可增加内皮细胞对TNF介导细胞凋亡的敏感性。

利用P65基因的突变体P65RHD，能阻断NFκB的活化，抑制促炎基因的上调表达，而且并不增加内皮细胞对TNF介导的细胞凋亡的敏感性，另外P65基因突变体的作用效果也证实了在DXR中Ⅱ型内皮细胞激活的假设[4,6]。

此外，利用腺病毒载体转染移植物内皮细胞，使其表达抗凋亡基因A20,bcl-2和bcl-xl等不仅可以抑制内皮细胞的凋亡，而且能抑制NF-κB的活性，阻止促炎基因的提高表达,抑制内皮细胞活化[7,8]。

因此，可以应用转基因技术使移植器官血管内皮细胞表达这些保护性基因，达到抑制内皮细胞活化的目的。

二、内皮细胞与异种抗体

1.  异种反应性天然抗体

受者体内的异种反应性天然抗体（xenoreactivenaturalantibodies,XNA）介导的补体激活，损伤并激活移植物血管内皮细胞，导致移植物弥漫性血管内凝血等病理机制是引起HAR的最主要原因。

天然抗体是指那些不需抗原刺激就在机体内预存的抗体，不同种属的生物之间相互有预存抗体。

机体主要通过天然免疫而获得特异性天然抗体，如ABO同种血凝素和异种反应性天然抗体等。

XNA可分为抗-Gal抗体和抗非-Gal抗体，其中抗-Gal抗体与供体器官血管内皮细胞表面的Galα1,3-Gal抗原的相互作用是引起HAR最主要的原因。

猪和人的内皮细胞最显著的表型差异就是猪内皮细胞表达天然抗原半乳糖α1，3-半乳糖（Galα1,3-Gal），而且这种Galα1,3-Gal天然抗原正是阻碍猪到人异种移植的主要屏障。

Galα1,3-Gal是在α1,3-半乳糖苷转移酶（α1,3-GT）的作用下合成，人类和其他旧世界灵长类动物的此基因在进化中因基因缺失或替代成为假基因，所以人和旧世界灵长类动物体内不含有这种Galα1,3-Gal抗原决定簇。

但人和旧世界灵长类动物体内预存有针对异种天然抗原Galα1,3-Gal的XNA，人体有1%B细胞可以产生抗-Gal抗体，天然抗-Gal抗体首先通过胃肠道途径，一些肠道细菌和特定菌群等持续刺激B细胞，使其产生天然抗-Gal抗体[9]。

在非协调性异种移植实施后，受者体内的XNA将与异种移植物内皮细胞上表达的异种抗原发生免疫反应。

Lambrigts等[10]在研究中将猪的器官移植给新生的狒狒（体内无抗Gal-IgM，但含有Gal-IgG），发现即使存在高浓度抗Gal-IgG也不会引起HAR，但如果将猪的器官移植给成年狒狒则发生HAR，说明在人类这种XNA主要为IgM抗体。

当有足够的XNA存在的情况下，XNA与表达在异种移植物血管内皮细胞上的Galα1,3-Gal抗原迅速结合，激活补体，导致内皮细胞损伤，启动内源性和外源性凝血途径，最终导致移植物出现弥漫性血管内凝血，而使移植物功能丧失。

基于XNA与Galα1,3-Gal抗原的免疫应答是引起HAR最重要的因素，迄今已经采取了多种方法来降低或消除Galα1,3-Gal抗原诱导的HAR。

例如，利用α-半乳糖苷酶可以剪切猪内皮细胞表面的Galα1,3-Gal抗原决定簇，降低Galα1,3-Gal的表达[11]。

另外Koma[12]在最近的研究中发现，α1,2-岩藻糖苷转移酶、α2,3-唾液酰基转移酶、α2,6-唾液酰基转移酶和N-已酰葡萄糖胺基转移酶Ⅲ都可与α1,3-GT竞争相同的受体底物而竞争性抑制其活性，显著减少Galα1,3-Gal天然抗原在移植物内皮细胞上的表达，并且目前已经利用基因工程技术构建出了表达TH基因的转基因猪[13-15]，这种转基因猪Galα1,3-Gal天然抗原的表达水平较低，可以降低对XNA的反应性，从而避免HAR的发生。

但上述方法只是部分或暂时去除异种移植物内皮细胞表面的Galα1,3-Gal抗原决定簇，达到“功能性敲除”Galα1,3-Gal的目的，但剩余的Galα1,3-Gal抗原仍然足以活化补体系统，使得移植物功能丧失。

研究表明，只有敲除异种移植物的Galα1,3-Gal基因，才能完全去除异种移植物内皮细胞表面的Galα1,3-Gal抗原决定簇[16,17]。

目前已有一些研究中心成功培育出敲除了Galα1,3-Gal基因的小鼠，当这些小鼠的内皮细胞暴露在人血清时，人体抗Galα1,3-Gal抗体与其结合比正常小鼠有显著降低，从而抑制了人类补体的活化[18]。

而且在最近研究中也已经在克隆胎羊靶细胞中敲除了Galα1,3-Gal基因[19]。

与此同时，在对猪的Galα1,3-Gal抗原的敲除研究中也取得了一定的进展，2002年Scince和Nature分别报道了Lai等[20]利用核转移技术成功的克隆了敲除α-半乳糖苷转移酶基因的猪，虽然他们只是敲除了等位基因上的一个α-半乳糖苷转移酶基因位点，但在克服异种移植排斥反应却取得了突破性的进展。

目前PPLTherapeutics已经获得α-Gal双等位基因敲除的纯合子猪并将正式用于器官移植的前期试验来验证其作用和效果[21]。

2.诱生抗体

目前可以利用清除受者体内的天然抗体和补体等方法可以抑制HAR的发生，但这时异种移植器官的异种抗原就会刺激受者机体可以产生与天然抗体在功能上和结构上都相似的抗体，称之为诱生抗体。

同天然抗体一样，诱生抗体也能导致移植物广泛血管内皮损伤，使异种移植物功能丧失。

HAR被抑制后，人和猴等非协调性器官移植受者将会诱生2种异种抗体[9]：

①高度特异性抗-Gal抗体；②抗多种异种抗原抗体（抗非-Gal抗体）。

而且这2种抗体都是IgG家族和T细胞依赖性抗体。

当异种移植物进入人体后，携带数目众多的Galα1,3-Gal抗原决定簇的异种糖蛋白抗原被释放入血，这些异种糖蛋白抗原通过其Galα1,3-Gal抗原决定簇与抗-GalB细胞受体结合而相互作用，抗-GalB细胞作为抗原提呈细胞将此抗原呈递至辅助T细胞，在辅助T细胞的作用下完成使抗-GalB细胞完成活化和增殖[22]，在人体内，这种活化最终导致大量高亲和力抗α-Gal抗体IgG的产生[9]。

这些抗体在移植后2～4周达到最高峰，并且在移植物存在时一直保持高效价，它们主要是IgG2亚型，可以导致抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC作用）。

这种诱生的抗体反应十分强烈，使用在同种移植中能够抑制排斥反应的免疫抑制剂的剂量并不能抑制此反应[9,23]。

但Buhler等[24]的研究发现抗CD40L抗体可以完全抑制诱生的抗-Gal抗体的产生，只是这种抑制作用是暂时的，一但停用抗CD40L抗体，诱生抗-Gal抗体仍然会产生。

抗非-Gal抗体的产生是由于猪血管内皮细胞上表达有大量的异种抗原肽，在将猪的器官移植入人体内时可以发生免疫反应，在受者体内产生大量抗非-Gal抗体，这些抗体是由数目众多的B细胞克隆所产生的[9]。

应用针对B细胞和T细胞的免疫抑制方法可能会抑制这些抗体的产生，Buhler在研究中发现在将猪的单核细胞输入狒狒体内的模型中，应用抗CD40L抗体和环孢素A也可以抑制抗非-Gal抗体的产生[24]。

3.适应（accommodation）

虽然异种抗体可以与异种移植物内皮细胞上的异种抗原发生作用，导致异种排斥反应的发生。

但这种异种抗体与异种移植物内皮细胞的相互作用并不总是导致移植物损伤，有些时候，这种相互作用会形成一种适应状态[25]，这种现象最初是由Platt等[26]在进行ABO血型不相符的同种肾移植时发现的。

研究表明长期清除受者天然抗体和抑制补体系统以防止血管排斥反应可能并非必不可少。

根据ABO血型不相容同种移植经验，在移植物植入前后去除天然抗体和补体及抑制其他因子，一段时间后即使天然抗体和补体及其他因子恢复到正常水平后也不能刺激内皮细胞活化引起排斥反应，其可能原因是在移植物植入后且天然抗体“不存在”的期间，移植物内皮细胞有相当的时间从低温暴露，低氧应激和再灌注所造成的损伤中恢复正常。

在异种移植中也可观察到同样的现象[2]，如Bach等用抗μ抗体和抗IgM-XNA免疫抑制剂清除IgM-XNA数周后植入异种器官，获得延迟排斥效果，数周后即使天然抗体水平恢复，也不出现排斥反应[27]。

Delirouras等[25]发现，猪内皮细胞暴露于低水平的人类抗体中，6天后可以获得对抗TNF-α介导的凋亡的能力。

说明这种异种抗体与异种移植物内皮细胞的相互作用对异种移植还有着“积极”的一面。

Cooper对之作了定义[28]：

如果应用抑制天然抗体和补体的方法，使异种移植物存活一定时间（2～3周），而后停止治疗，若在天然抗体和补体滴度回升时，排斥反应仍不发生，这一现象称为“适应”（accommodation），也被称为机体对抗体和补体的“获得性抵抗力”。

适应表现为：

①改变抗移植物抗体，使更少的抗体与移植物结合或结合力减弱；②改变人体器官内皮细胞上的抗原表达，如靶物质的糖类加上唾液酸基因，可保护它们不与天然抗体结合；③改变移植物血管对抗体和补体损伤的易感性等。

而内皮细胞的变化可能是上述改变的本质原因[2]。

在未处理的受者，一旦异种移植器官血流再通，它的每个内皮细胞上就有多达100000个天然抗体分子的沉积，随后导致补体沉积，内皮细胞将在几秒或几分钟内被突然大量地损伤。

若在移植前去除天然抗体和补体，则可允许它们有机会慢慢恢复而“痊愈”，不产生内皮细胞如此大量地损伤。

“痊愈”的内皮细胞在其对恢复的天然抗体应答中，可能积极干扰超急性排斥反应的内皮细胞应答过程。

首先，内皮细胞受刺激后的初期不仅出现转录因子NF-κB的活化（NF-κB在许多特征性基因的上调中起重要的作用），而且也出现一个编码I-κB（NF-κB抑制因子）样分子的基因上调，I-κB蛋白能与NF-κB结合而抑制NF-κB功能，这样，依赖于NF-κB而上调的基因及其可能参与超急性排斥反应的基因产物将不能上调，因而在造成“适应”的一定条件下I-κB活性超过NF-κB，可防止内皮细胞活化，从而引起“适应”，而不是超急性排斥反应。

其次，有条件地刺激内皮细胞既可诱导内皮细胞对反应产生的毒素敏感，又可诱导其对相同毒素的适应[2]。

三、内皮细胞和补体

在异种移植导致移植物损伤中受者补体起到关键的作用，其激活是异种排斥反应发生的基本步骤。

通常认为异种移植中补体激活是由异种天然抗体所触发，抗体特异性与异种移植物内皮细胞结合，粘附C1q，启动补体经典途径。

但另有研究发现，猪内皮细胞也可以同时激活人补体激活的经典和旁路途径[2]。

研究发现，补体在内皮细胞活化，导致HAR过程中起着重要的作用。

补体与天然抗体沉积在内皮细胞表面，活化补体成分可把信号传递给内皮细胞，促进内皮细胞活化。

此外，补体裂解产物如C5a具有诱导中性粒细胞趋化、化学活化、脱颗粒和呼吸爆发的功能，以及可增强中性粒细胞整合素与内皮细胞上配体的亲和力。

C5a还可以刺激巨噬细胞和肥大细胞释放TNF和IL-1，而TNF和IL-1又可以活化内皮细胞，且这些细胞亦可直接以活化形式与内皮细胞结合，进一步加剧排斥反应[2]。

研究发现1%的人补体即可激活猪内皮细胞，导致内皮细胞上的硫酸肝素的丢失，5％的补体可以刺激猪内皮细胞从抗凝状态转变为促凝状态。

但补体并不能像细胞因子那样直接激活内皮细胞，而是通过诱导IL-1α分泌来激活内皮细胞。

应用IL-1受体拮抗剂和抗IL-1抗体可以抑制补体激活内皮细胞而导致的凝血和炎症反应，从而证实了IL-1在补体激活内皮细胞机制中的重要作用[29]。

目前大致采用2种主要方法防止补体激活：

①应用高纯度眼睛蛇毒因子或可溶性补体受体I来消耗补体；②利用转基因技术使异种移植物血管内皮细胞表达人源补体调节蛋白来抑制补体的活化。

尤其在利用转人源补体调节蛋白基因方面取得了一定的进展，人补体调节蛋白主要包括衰变加速因子（DAF/CD55）、膜辅助因子（MCP/CD46）、膜反应性溶解抑制物（MIRL/CD59）等。

其中CD46能抑制Ｃ3转化酶形成，从而抑制补体的激活。

CD59可以阻断攻膜复合体（MAC）的形成，避免其对移植物的损伤。

DAF可以抑制C3b和MAC在猪内皮细胞上的沉积[30]。

近年来在异种移植研究中发现，利用转基因技术使猪内皮细胞表达人补体调节因子的转基因猪在一定程度上可以抑制天然抗体所介导的补体活化，使移植物免遭超急性排斥反应的损伤作用[31，32,33]。

最近的研究还表明表达人类补体调节因子CD46，DAF和CD59的猪能够合成与人类自身相似的补体调节蛋白质[34],并且联合转染多种补体调节蛋白基因的转基因猪的效果明显优于转染一种补体调节因子，例如，转DAF和CD59的转基因猪效果优于转染单一DAF的转基因猪；联合转染CD46与DAF也有相似的效果[35]。

另外Shiraishi等[36]应用腺病毒载体介导CD55、CD46和CD59三个基因联合转染猪血管内皮细胞，可以明显的抑制补体激活，其效果也远远优于转染单一基因。

四、  内皮细胞与凝血

异种移植常伴随显著的凝血功能异常，血小板活化及血管损伤。

实际上移植物血管内凝血是异种移植排斥反应的特征之一[37]。

凝血过程的激活与受者免疫应答关系密切，在血管化异种移植中纤维蛋白沉积与血小板聚集是复杂排斥反应过程中免疫和炎症反应的结果。

在这一机制中，内皮细胞的激活与否起到十分关键的作用[2]。

正常的内皮细胞表面含有许多有助于抗凝和行使其他功能的分子，其中最重要的2种为硫酸肝素和血栓调节素。

硫酸肝素由一个蛋白质核心和与之相连的糖胺聚糖链组成，当抗凝血酶Ⅲ与硫酸肝素连结后即活化成为一种强有力的抗凝剂，干扰凝血途径中的关键成分凝血酶及其他因子的作用；与硫酸肝素连结的还有超氧化物歧化酶（SOD），它可以破坏与活化内皮细胞连结的活化中性粒细胞所产生的氧基团（O2-）。

血栓调节素可与凝血酶结合，使血液中存在的蛋白C（PC）成为活化PC（APC），与血液中另一成分蛋白S一起通过破坏凝血因子Ⅴa和Ⅷa来干扰凝血途径的激活，进而阻碍血栓形成，即具有抗凝作用。

ATPDase（CD39）是表达在静息内皮细胞表面的另一种分子，当内皮细胞激活后其活性降低。

ATPDase有将腺苷酸三磷酸（ATP）和腺苷酸二磷酸（ADP）代谢成腺苷酸环腺苷一磷酸（AMP）的功能。

在5’－核苷酸酶的作用下，AMP转变为腺苷酸。

ADP可以强烈刺激血小板聚集，ATP和ADP都可以刺激多种细胞变为致炎细胞。

所以ATPDase去除ATP、ADP可以消除ATP、ADP的促凝血和致炎的刺激。

另外，腺苷酸也有抗凝血、抗炎症刺激的功能，所以ATPDase还可以通过促进腺苷酸的合成来抑制血小板聚集和炎症反应[38]。

内皮细胞活化后，使血管的完整性受损与基质相联的组织因子（tissuefactor,TF）增加。

活化内皮细胞表面也可表达TF，这些TF的暴露，使得活化内皮细胞因子Ⅶ或因子Ⅶα能与之结合，启动外源性凝血过程。

另外活化的内皮细胞激活补体，引起补体连锁激活启动的凝血途径可能也是异种移植排斥反应中广泛血栓形成的部分原因[2]。

正如Fecke等发现非协调性异种移植排斥反应依赖于天然抗体和猪内皮细胞上的Galα1,3-Gal天然抗原的相互作用。

这种相互作用使补体活化，且活性物质沉积于细胞膜上导致内皮细胞功能紊乱和血栓形成[39]。

其中多种机制可造成抗凝（与静息内皮细胞相关）和促凝（与活化内皮细胞相关）之间的失衡[2]：

①血小板活化因子（PAF）可促进血小板的活化及血小板血栓的形成；②内皮细胞活化可诱导硫酸肝素缺失，导致抗凝血酶Ⅲ作用消失，这种缺失需有天然抗体和补体，天然抗体加上C5a已足够介导此缺失，其与补体连锁激活的整个过程无关；③血栓调节素在内皮细胞活化时缺失而丧失与凝血酶结合的能力；④纤维蛋白溶解酶原激活因子，可以破坏纤维蛋白凝块，而内皮细胞活化时纤维蛋白溶解酶原激活因子抑制物（PAI-1）的分泌可抑制纤维蛋白溶解酶原激活因子的天然作用，存在一个与PAI-1产生相关联的网络促凝血作用；⑤含有攻膜复合体成分的活化内皮细胞胞膜破裂，凝血酶原酶激活