分子生物学实验报告.docx

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分子生物学实验报告

本科学生综合性实验报告

姓名学号

学院生命科学学院

专业、班级应用生物教育

实验课程名称分子生物学实验

教师及职称倪娟（老师）

开课学期2014至2015学年下学期

云南师范大学教务处编印

实验室

睿智楼422实验室

实验时间

星期三（7—8节）

实验序号及名称

实验二、哺乳动物组织基因组DNA提取

1、实验目的

（1）.掌握动物基因组DNA提取的操作方法。

（2）.掌握琼脂糖凝胶电泳的操作的方法。

2、实验仪器及试剂

Ⅰ.Instruments

Highspeedrefrigeratedcentrifuge（高速冷冻离心机）、Glasshomogenizer（玻璃匀浆器）、ElectrophoresisSystem（电泳系统）、Ultraviolettransilluminator（紫外透射仪）、Ultracoldstoragefreezer（超低温冰箱）、Autoclave（高压灭菌锅）、Pipettes（微量加样器）、Electronicbalance（电子天平）、Acidometer（酸度计）

Ⅱ.Material

Liverofmice

Ⅲ.Reagents

Tris、SDS、EDTA、HCl、NaOH、Sodiumacetate（NaAc）、Aceticacid（HAc）、

Phenol、Chloroform、Ethanol、Isoamylol、

TEbuffer、ProteaseK、RNaseA、Agarose、DNAmolecularweightmarkers、Boricacid、Sugar、Bromophenolblue、

Fluorescentdye（Gelview）

3、实验原理、实验流程、装置示意图

Ⅰ.实验原理：

本实验利用去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠）是为了使蛋白变性并溶解细胞膜中的脂质从而导致细胞裂解，而细胞裂解物又常用蛋白酶K进行水解处理。

随后用酚︰氯仿进行抽提，以去除残留的蛋白质，这时蛋白质将进入有机相，或者假如己变性的话将呈现在有机相与水相之间。

乙醇沉淀处理则可以浓缩DNA，同时去除核苷酸、氨基酸以及低分子量的寡核苷酸和肽。

为了进一步保护DNA样品的完整性，通常需要在缓冲液中添加乙二胺四乙酸（EDTA）以整合Mg2+，这样将会减少脱氧核糖核酸酶（DNase）的活性，因为该酶必须在有Mg2+存在时才会起作用。

本实验方法分离得到的染色体DNA长度为100-150kb，适用于构建基因组文库和Southern杂交分析。

如果要求得到较大分子量的DNA，则必须省略其中的振荡步骤。

Ⅱ.实验流程：

储备液的制备破碎、酶解细胞（过夜）抽提DNA、乙醇沉淀纯化DNA琼脂糖凝胶电泳检测DNA

观察实验结果

Ⅲ.装置示意图：

酚抽提除去蛋白质的示意图

Ⅳ.核酸的分离纯化、测定及研究方法

一、分离核酸的一般原则

因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中，故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基础。

（一）核酸的分离和纯化时应遵循两个原则

①保证核酸一级结构的完整性；

②排除其它分子的污染。

（二）核酸的纯度要求

①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；

②其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；

③排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。

（三）核酸分离纯化的注意事项

为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意：

①尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；

②减少化学物质对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4～10条件下进行；

③防止核酸的生物降解。

细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。

其中DNA酶需要金属二价阳离子Mg2+，Ca2+的激活，因此使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等基本上可以抑制DNA酶的活性。

而RNA酶不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素；

④减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。

高温：

如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的某些化合键也有破坏作用。

核酸提取过程中常规操作温度为0～4℃以降低核酸酶的活性从而减少对核酸的生物降解。

机械剪切力：

包括强力高速的溶液振荡、搅拌，细胞突然置于低渗液中；细胞爆炸式地破裂及DNA样品的反复冻融等。

这些操作细节在实验操作中应加倍注意。

机械剪切作用的主要危害对象是大分子量的线性DNA分子，如真核细胞的染色体DNA等。

二、核酸分离纯化的一般步骤

●破碎细胞→去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子→沉淀核酸→去除盐类、有机溶剂等杂质→纯化干燥→溶解。

●核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核酸分子的特点而定。

对于某特定细胞器中富集的核酸分子，采用先提取细胞器后再提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。

4、实验方法、步骤及现象

Ⅰ.实验步骤（ExperimentalProcedures）：

（一）储备液的制备

1.5mol／LNaCl

2.1mol／LTris·HClpH8.0

3.0.5mol／LEDTApH8.0

4.dddH2O

5.3mol／LNaAcpH5.2

6.生理盐水（0.85％NaCl）

7.10％SDS

8.5×TBE

9.10mg／mL蛋白酶K-20℃保存

10.10mg／mL无DNA酶的RNA酶-20℃保存

11.6×凝胶加样缓冲液

（二）破碎、酶解细胞（过夜）

冰浴处理生理盐水

玻璃匀浆器冰冷的生理盐水清洗（3次）

配置工作液处死小鼠取出肝脏（0.2g）

组织匀浆液

酶解液

2ml匀浆液组织细胞液

玻璃匀浆器匀浆移至1.5ml离心管

5000r／min30—60s弃上清加400ul吹散

离心无菌水

加400ul

酶解液水浴处理（55℃、12—18h）

（三）抽提DNA、乙醇沉淀纯化DNA

等量分装在两支离心管内

加入20ul的RNase加入等体积①提取液（翻转混匀）

37℃水浴1h4℃10min

酶解样品待抽提的样品、抽提、静置离心

配制

TE缓冲液加等体积②提取液500ul

10000r／min离心10min移出水相至离心管抽提静置4℃10mi

离心10000r／min离心10min移出水相NaAc无水乙醇放入

超低温冰箱-20℃1-2h融化、离心12000r／min离心15min弃上清液加入75%冷乙醇洗涤离心

12000r／min离心15min弃上清液干燥加TE50ul

混匀DNA（4℃存放）

（四）、琼脂糖凝胶电泳检测DNA

AgaroseGelElectrophoresis：

Preparationofthegel

制备0.3％琼脂糖凝胶

LoadingDNAsamples

DNAsamples16µl+Loadingbuffer4µl

Gel

电压120V

Gelphotography

1.制备0.3％琼脂糖凝胶。

称取0.06g琼脂糖，放人锥形瓶中，加入20mL的0.5×TBE缓冲液，放入微波炉加热至完全溶化，则为0.3％琼脂糖凝胶液。

（由于蒸发作用，溶解前在容量瓶上作一个记号，溶解后用三蒸水补足）

2.制胶器的安装。

3.将熔化的琼脂糖凝胶液转入Gelview专用的三角瓶中，然后加入Gelview2µl。

4.将冷到60℃左右，缓缓倒入制胶器（注意不要形成气泡）。

5.待胶凝固后（80min），轻轻拔掉梳子，将凝胶盘从制胶槽中取出，放入电泳槽内。

6.加入电泳缓冲液（0.5×）至电泳槽中。

5×TBE（电泳缓冲液）100mL

●5.4gTris，

●2.75g硼酸，

●2mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）

●加蒸馏水到100ml

●pH8.0

6×上样缓冲液

●0．25％溴酚蓝：

取60ml三蒸水，将250mg溴酚蓝溶解于其中

●40％（W／V）蔗糖水溶液：

在上述溶液中加入40g蔗糖

通过紫外透射仪检测凝胶，然后获取图片。

并将产物条带与已知分子量的标淮条带进行比较，便可以对合适分子量大小的产物进行鉴定。

Ⅱ.实验现象：

（1）随着电泳的开始，点样孔里面的材料也慢慢在电极的作用下渗入到琼脂糖凝胶里面；

（2）酚抽提除去蛋白质时，试液分层：

上层为水相，下层为酚相；

（3）电泳后，在紫外灯下可以看到呈现出淡黄色的荧光物质条带。

5、参考文献

《分子生物学实验指导》（第三版）.魏群著.

《分子生物学》—实验—高等学校—教学参考资料；IV.Q7—33.

《分子生物学》（第三版）.刘进元（编译）等.

《分子生物学》，Turner,P.等主编。

—3版。

—北京：

科学出版社，2009

6、实验数据处理

Ⅰ.实验结果

小鼠基因组DNA电泳条带图

从上图所示的DNA电泳条带图可以看出，小鼠的基因组DNA的电泳条带几乎在一条线上，但是有些条带不是很明显，性状不是很好。

而有些条带很明显，说明在实验过程中的实验步骤都完成得较好，以至于得到较好的条带。

Ⅱ.实验总结

（1）在此次综合性实验中，我们首先要预习，明白所加入试剂的作用，进而加入的量要控制好，各小组组员在剂量的添加时，要互相合作；

（2）要学会实验仪器的使用，如移液枪的操作、离心机的操作等，并且加样的时候要特别注意量程的使用，实验结束后要把移液枪回到量程；

（3）对于分子生物学实验要求我们各部分都要做得很到位，要不然做了很久的实验，结果却没有成功就很遗憾了。

7、实验分析与讨论

本次实验成败之处及其原因分析、改进措施：

在本次实验中小组成员积极主动的参加进来，大家有不懂的彼此交流讨论，最后还算成功的完成了本次综合性实验。

不足：

（1）实验仪器操作不当；

（2）我们小组抽提样品不是很纯，含有一些杂质，可能是在酚抽提除去蛋白质时不慎将蛋白质混进水相；

（3）在加入提取液时，操作不规范，加样不是很准确；

（4）也可能是由于凝胶浓度过低导致条带性状不佳。

改进措施：

在进行实验之前要进行充分的预习，上课时有不明白的地方就要与同学一起讨论或者提出来问老师，以便能够快熟准确的解决实验操作过程中产生的问题；在操作时要细心认真，不能马虎大意；操作结束后认真记录结果后收拾台面，打扫卫生；最后，认真写实验报告。

教师评分

当我被上帝造出来时，上帝问我想在人间当一个怎样的人，我不假思索的说，我要做一个伟大的世人皆知的人。

于是，我降临在了人间。

我出生在一个官僚知识分子之家，父亲在朝中做官，精读诗书，母亲知书答礼，温柔体贴，父母给我去了一个好听的名字：

李清照。

小时侯，受父母影响的我饱读诗书，聪明伶俐，在朝中享有“神童”的称号。

小时候的我天真活泼，才思敏捷，小河畔，花丛边撒满了我的诗我的笑，无可置疑，小时侯的我快乐无虑。

“兴尽晚回舟，误入藕花深处。

争渡，争渡，惊起一滩鸥鹭。

”青春的我如同一只小鸟，自由自在，没有约束，少女纯净的心灵常在朝阳小，流水也被自然洗礼，纤细的手指拈一束花，轻抛入水，随波荡漾，发髻上沾着晶莹的露水，双脚任水流轻抚。

身影轻飘而过，留下一阵清风。

可是晚年的我却生活在一片黑暗之中，家庭的衰败，社会的改变，消磨着我那柔弱的心。

我几乎对生活绝望，每天在痛苦中消磨时光，一切都好象是灰暗的。

“寻寻觅觅冷冷清清凄凄惨惨戚戚”这千古叠词句就是我当时心情的写照。

最后，香消玉殒，我在痛苦和哀怨中凄凉的死去。

在天堂里，我又见到了上帝。

上帝问我过的怎么样，我摇摇头又点点头，我的一生有欢乐也有坎坷，有笑声也有泪水，有鼎盛也有衰落。

我始终无法客观的评价我的一生。

我原以为做一个着名的人，一生应该是被欢乐荣誉所包围，可我发现我错了。

于是在下一轮回中，我选择做一个平凡的人。

我来到人间，我是一个平凡的人，我既不着名也不出众，但我拥有一切的幸福：

我有温馨的家，我有可亲可爱的同学和老师，我每天平凡而快乐的活着，这就够了。

天儿蓝蓝风儿轻轻，暖和的春风带着春的气息吹进明亮的教室，我坐在教室的窗前，望着我拥有的一切，我甜甜的笑了。

我拿起手中的笔，不禁想起曾经作诗的李清照，我虽然没有横溢的才华，但我还是拿起手中的笔，用最朴实的语言，写下了一时的感受：

人生并不总是完美的，每个人都会有不如意的地方。

这就需要我们静下心来阅读自己的人生，体会其中无尽的快乐和与众不同。

“富不读书富不久，穷不读书终究穷。

”为什么从古到今都那么看重有学识之人？

那是因为有学识之人可以为社会做出更大的贡献。

那时因为读书能给人带来快乐。

自从看了《丑小鸭》这篇童话之后，我变了，变得开朗起来，变得乐意同别人交往，变得自信了……因为我知道：

即使现在我是只“丑小鸭”，但只要有自信，总有一天我会变成“白天鹅”的，而且会是一只世界上最美丽的“白天鹅”……

我读完了这篇美丽的童话故事，深深被丑小鸭的自信和乐观所折服，并把故事讲给了外婆听，外婆也对童话带给我们的深刻道理而惊讶不已。

还吵着闹着多看几本名着。

于是我给外婆又买了几本名着故事，她起先自己读，读到不认识的字我就告诉她，如果这一面生字较多，我就读给她听整个一面。

渐渐的，自己的语文阅读能力也提高了不少，与此同时我也发现一个人读书的乐趣远不及两个人读的乐趣大，而两个人读书的乐趣远不及全家一起读的乐趣大。

于是，我便发展“业务”带动全家一起读书……现在，每每遇到好书大家也不分男女老少都一拥而上，争先恐后“抢书”，当我说起我最小应该让我的时候，却没有人搭理我。

最后还把书给撕坏了，我生气地哭了，妈妈一边安慰我一边对外婆说：

“孩子小，应该让着点。

”外婆却不服气的说：

“我这一把年纪的了，怎么没人让我呀？

”大家人你一言我一语，谁也不肯相让……读书让我明白了善恶美丑、悲欢离合，读一本好书，犹如同智者谈心、谈理想，教你辨别善恶，教你弘扬正义。

读一本好书，如品一杯香茶，余香缭绕。

读一本好书，能使人心灵得到净化。

书是我的老师，把知识传递给了我；书是我的伙伴，跟我诉说心里话；书是一把钥匙，给我敞开了知识的大门；书更是一艘不会沉的船，引领我航行在人生的长河中。

其实读书的真真乐趣也就在于此处，不是一个人闷头苦读书；也不是读到好处不与他人分享，独自品位；更不是一个人如痴如醉地沉浸在书的海洋中不能自拔。

而是懂得与朋友，家人一起分享其中的乐趣。

这才是读书真正之乐趣呢！

这所有的一切，不正是我从书中受到的教益吗？

我阅读，故我美丽；我思考，故我存在。

我从内心深处真切地感到：

我从读书中受到了教益。

当看见有些同学宁可买玩具亦不肯买书时，我便想到培根所说的话：

“世界上最庸俗的人是不读书的人，最吝啬的人是不买书的人，最可怜的人是与书无缘的人。

”许许多多的作家、伟人都十分喜欢看书，例如毛泽东主席，他半边床上都是书，一读起书来便进入忘我的境界。

书是我生活中的好朋友，是我人生道路上的航标，读书，读好书，是我无怨无悔的追求。