NiNTA superflow cartridge手册 中文版.docx
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NiNTAsuperflowcartridge手册中文版
Ni-NTASuperflowCartridge手册
用于手动或FPLC纯化His-tag蛋白
目录：
包装内容物（4）
储存和稳定性（4）
安全措施（4）
介绍（7）
Ni-NTASuperflowCartridge说明书（7）
QIA表达系统（7）
Ni-NTACartirdge接头（14）
天然或变性条件下纯化蛋白（15）
说明书
⏹天然条件下清澈的E.coli菌液的制备（16）
⏹变性条件下清澈的E.coli菌液的制备（18）
⏹从E.coli细胞制备6XHis-tag的胞质蛋白（19）
⏹天然条件下从昆虫细胞中制备细胞菌液（20）
⏹使用注射器手动纯化6XHis-tag蛋白（21）
⏹使用自动层析系统纯化6XHis-tag蛋白（22）
问题的解决（23）
附录A：
Buffer成分（25）
附录B;Ni-NTASuperflowCartridge的清洁与再生（27）
包装包含物
Catno.Ni-NTASuperflowCartridge
（1）Ni-NTASuperflowCartridge（5）说明书
3072151
307251001
3076011
3076151
307651001
技术支持
在QIAGEN，我们为我们的技术支持的质量和有效性而感到骄傲我们的技术部门是由有广泛实验经验的技术人员和专家组成的，他们都从事分子生物学而且熟练使用QIAGEN的产品。
如果您有任何问题或实验中遇到困难关于Ni-NTASuperflowCartridge或QIAGEN的产品，请尽快联系我们。
QIAGEN用户是我们改进和专业化产品的主要信息来源。
这些信息对于我们的科研人员与其他的科学家一样重要。
因此您如果有什么关于产品的建议或新的需要和技术等等请尽快联系我们。
对于技术支持和更多的信息请联系QIAGEN的技术服务部或者当地经销商
储存和稳定性
Ni-NTASuperflowCartridge应该储存在2-8度。
不要冷冻。
Cartridges在这样的条件下可以储存一年而性能不会发生任何改变。
产品局限性
Ni-NTASuperflowCartridge仅供科研使用。
没有声明或表述是用来为诊断，预防或治疗疾病而提供信息。
所有预料到的麻烦和注意事项东应该使用中注意。
对于重组DNA实验，我们推荐所有用户参照NIH指导方法，或者其他的可用性指导方针。
产品授权和满意的保证
QIAGEN保证产品的效果在我们的产品文献中都有描述。
顾客对于产品的特殊用途必须决定它的适用性。
如果不是由于使用造成的产品性能问题，QIAGEN将会免费更换或退货。
我们有权更换、更改或是调整任何产品以增强性能和设计。
如果QIAGEN产品没有达到您的要求，联系我们的当地技术部门或是销售商。
我们将相信您的理由或者交换产品----只要您愿意。
分离条件应用于QIAGEN科学仪器，服务产品，干冰用于产品运输。
请询问更多的信息
你还可以要求得到QIAGEN的条款和条件的副本，他会在我们的发票后提供给您。
如果您有什么关于产品说明和性能的问题，请联系QIAGEN技术服务和当地经销商。
安全措施
当工作时使用化学药品时，通常要穿实验服装，带一次性手套和护目镜。
更多的信息请咨询MSDSs。
您可以在网站下载PDF或打印QANGEkit和kit组成
以下危险和安全性用语适用于Ni-NTASuperflowCartridge。
包含乙醇和镍铵酸。
伤害性的，感光的，易燃的。
危险和安全用语：
R10-22-40-42/43。
S13-26-36-46
24小时紧急情况
紧急医疗信息24小时内可以从PoisonInformationCenterMainz,Germany得到，有英语、法语和德语三种。
电话：
+49-6131-19240
介绍
QIAGENNi-NTASuperflowCartridge是预先装好Ni-NTASuperflow的1ml和5ml柱子，用来纯化6XHis-tagged蛋白，可以使用注射器、蠕动泵，或者液相层析系统（例如AKTA或FPLC）
Ni-NTASuperflowCartridge
1mlCartridge
5mlCartridge
介质
Superflow（6%高胶连琼脂糖）
珠子直径
60-169微米
柱子体积
6.7mmX28mm
14.7mmX29.8mm
最大承受压
5bar，0.5MPa
5bar，0.5MPa
典型背景压力（BufferNP-10,10%甘油）
1.0Bar，0.1MPa
（1ml/min）
2.0Bar，0.2MPa
（5ml/min）
推荐流速
1ml/min（155cm/h）
5ml/min（170cm/h）
最大流速
10ml/min（1560cm/h）
40ml/min（1360cm/h）
柱连接
表3，14页
表3，14页
短期储存PH稳定值（≤2H）
2-14
2-14
长期储存PH稳定值（＞2H）
3-12
3-12
吸附能力
至少20mg（1μ膜@20KDa）
至少100mg（5μ膜@20KDa）
系统兼容性
自动层析系统（例如AKTA，FLPC，BioLogic，BioCAD，Visionworkstation）
Cartridge材料
聚丙烯
连接器
1/16”（入口）；M6（出口）
Superflow自身最大可以使用的压力是10Bar。
但是，Cartridges的稳定性仅在小于5Bar保证
高流速可能导致恢复6XHis-tagged蛋白减少
蛋白不同吸附能力不同
QIA表达系统
QIA表达系统以6Xhistag为基础，这是一个亲和标签由6个连续的His残基组成。
这个亲和标能够被QIAGEN独特的专利产品Ni-NTA金属吸附层析柱显著的选择吸附。
QIA表达系统这个独特的特性提供了大量的显著优势（表一）而并不适合其他亲和标签和层析方法
表一：
QIA表达系统的特点和优势
特点
优势
在6XHis和Ni-NTA间高亲和性和选择性吸附
在一步法标准纯化过程中的祷告纯度蛋白
6XHistag与Ni-NTA作用不受基质结构约束
一步纯化能够在天然和变性条件下
使用温和的洗脱条件
吸附、冲洗、洗脱失高度的可再生，对蛋白结构没有影响
纯化蛋白可以直接应用于下游软件
6XHistag比其他常用标签小的多
标签不会影响重组蛋白的结构和功能
6XHistag在生理PH不带电荷
6XHistag不会干扰分泌
6XHistag不会产生抗原性
重组蛋白不用事先切除标签
Ni-NTASuperflow
Ni-NTASuperflow由连接Superflow树脂的Ni-NTA组成。
它将出众的机械稳定性和显著的流动特性及高效的动力吸附能力相结合。
吸附6XHis-tagged蛋白的能力是5-20mg/ml。
这种树脂对于效率生产登记和FPLC的要求允许使用一步法纯化6XHis-tag蛋白。
Ni-NTA能力出众，适应试剂范围广泛，例如2MNaCl，10mMDTT，8M尿素，及许多去污剂（表二）
局限性
Ni-NTA基质不要暴露在高浓度的还原剂中，例如DTT，DTE；高浓度下，这些试剂还原Ni离子还可能阻止吸附6XHIS-Tag蛋白。
Ni-NTA基质在还原剂中会变成棕色。
很多情况下，β-巯基乙醇能够在浓度不高于20mM时使用，DTT兼容性证明浓度可以到10mM。
EDTA，EGTA或其他任何强螯合剂吸附Ni离子并将他们从NTA上夺走。
NTA基质缺乏NI时变白。
使用任何还原剂或螯合剂都要当心，如果不确定，就在小量的Ni-NTA基质上作检测。
高浓度的Buffer包含强的给电子集团或者氨基酸例如Arg、Glu、Gly、His，菌液中应该尽量避免。
细胞应该被溶解。
不要用强的螯合剂如EDTA，强的还原剂如DTT，或者离子去垢剂如SDS。
虽然有些例子表明这些试剂小剂量的应用没有问题，但是我们还是不推荐使用。
更多的详细信息，见表二
Ni-NTASuperflow试剂的兼容性
试剂
作用
建议
缓冲液试剂
Tris，HEPES，MOPS
二级胺或三级胺会还原Ni离子
可以用低于100mM。
推荐使用磷酸盐
螯合剂
EDTA，EGTA
从基质螯和Ni离子
低于1mM有成功的先例，但是应该小心使用
硫化试剂
β-巯基乙醇
DTT，DTE
阻止二硫键形成。
高浓度还原Ni离子
高浓度（大于1mM）基质可逆的变棕，取决于Ni的还原。
低于10mM证明没有影响纯化和增加Ni的脱落
低于20mM可以使用。
还原条件下不要储存基质
低于10mMDTT可以使用。
还原条件下不要储存基质
去垢剂
非离子去垢剂（Triton，Tween，NP40）
阳离子去污剂
CHAPS
阴离子去污剂（SDS、sarkosyl）
TritonX-114
去除背景蛋白和核算
去除内毒素
低于2%可用
低于1%
低于1%
不推荐，但是低于0.3%有成功地先例
低于2%
变性剂
盐酸胍
尿素
增溶蛋白
低于6M
低于8M
氨基酸
Gly
Glu
Arg
His
与Ni-NTA吸附，并与6XHistag竞争
不推荐
不推荐
不推荐
低浓度可用（20mM）于阻止非特异性吸附，高浓度（大于100mM）从Ni-NTA基质洗脱6XHis-tagged蛋白
其他添加剂
NaCl
MgCl2
CaCl2
甘油
乙醇
BugBuster蛋白提取试剂
咪唑
碳酸氢钠
血红蛋白
铵
柠檬酸酸盐
阻止离子间互作
阻止蛋白的疏水作用
阻止蛋白的疏水作用
与Ni-NTA吸附，并与6XHistag竞争
300mM至2M都可以用
小于4M
小于5mM
小于50%
小于20%
按推荐使用
低浓度可用（20mM）于阻止非特异性吸附，高浓度（大于100mM）从Ni-NTA基质洗脱6XHis-tagged蛋白
不推荐
不推荐
不推荐
低于60mM
Cartridge连接器
Ni-NTASuperflowCartridge可以手动纯化蛋白（用注射器），也可以自动纯化（使用层析系统，例如AKAT或FPLC系统）。
Cartridge进样口和出样口的尺寸和要求的连接器及手动和自动纯化所需适配器详细情况如下表
表三Ni-NTASuperflowCartridge所需连接器
如样口
出样口
Ni-NTACartridge
1/16”female（AKTA）
M6male（FPLC）
使用注射器手动纯化
1/16”male/luerfemale（Amersham,code18-1112-51）
自动纯化连接器（AKTA1/16”连接器）
不需要
UnionM6female/1/16”female（Amersham,code18-1123-94）
自动纯化连接器（M6装置，FPLC）
UnionM6male/1/16”female（Amersham,code18-3858-01）
SRTC-2，M6female（0.5mmi.d.）
（Amersham,code18-3856-01）
天然或变性条件下的纯化
在变性还是天然条件下纯化6XHis-tagged蛋白取决于蛋白的位置和可溶性，6XHis-tag的特性，下游技术的要求以及生物活性都必须要保持，因此如果复性过程是可用的，变性纯化和随后的蛋白折叠复性就要考虑周全
天然条件下纯化
如果纯化首选而且必须在天然条件下，那么6XHis-tagged蛋白必须要溶解。
尽管如此，虽然有许多蛋白出现在包涵体，一般还是有一些可溶物质能够在天然条件下纯化。
潜在的无关的影响Ni-NTA基质的无标签蛋白一般在天然条件下要高于变性条件，这个反映在首次的洗液中会出现大量的蛋白。
可以用含有低浓度咪唑的裂解液（LysisBuffer）和清洗液（WashBuffer）冲洗减少非特异性吸附无特异。
有时6XHIs-tag会被天然蛋白的三级结构包埋，因此可溶蛋白要求在能够被Ni-NTA纯化之前要求变性。
作为对照，在变性条件下的平行试验应该要实行：
如果只能在变性条件下纯化，Tag能够容易的移到蛋白相反的另一端。
变性条件下纯化
许多表达系统表达出的高水平的重组蛋白都能够形成不溶的集合体；Ecoli中形成众所周知的包涵体。
变性Buffer包含6M尿素或6M盐酸胍，通常用来完全溶解包涵体和6XHis-tag蛋白。
变性条件下，蛋白中的6XHistag会完全暴露因此Ni-NTA基质吸附效率会提高，而且基质减少了非特异性吸附，纯化效率也会升高。
变性条件下纯化的6XHis-tagged蛋白可以直接用来试验，或者复性再折叠。
蛋白复性和重折叠能够在Ni-NTAcartridge洗脱之前完成，或在溶液中也可以；建议参考QIAexpressionist
说明书：
天然条件下Ecoli菌液的制备
材料和试剂
细胞颗粒，BufferNPI-10，溶菌酶，Benzonase核酸酶（一级纯度，25U/ml，Merck，catno.1.0169.0001）,2XSDS-PAGE样品Buffer，可选择仪器：
超声仪
Buffer组成参见AppendixA
步骤：
1、冰上解冻细胞颗粒，用BufferNPI-10重悬细胞，每克湿重用2-5ml
需要多少细胞取决于6XHis-tagged蛋白的表达水平和使用的表达系统。
Ni-NTA基质的吸附能力是蛋白依赖性的，一般为20mg/ml。
BufferNPI-10包含10mM咪唑用来降低无标签蛋白和污染蛋白的吸附，并用少量Wash步骤后增加纯度。
如果标签蛋白在这些条件下没有被吸附，咪唑的量因该减少到1-5mM。
如果6XHis蛋白显示出高吸附亲和力，那咪唑的浓度可以增至20mM。
2、加入溶菌酶终浓度1mg/ml（50000units/ml）和Benzonase核酸酶（3U/ml）冰上孵化30Min
选择性的，可以加入RNaseA（10μ/ml）和DNaseI（5μ/ml），冰上10-15分，或用小容量的钝的注射器的针头吸吹数次溶解。
2a、（可选）冰上超声波破碎
用200-300W的six10s的脉冲，每个脉冲间隔10S的冷却期。
3、4度10000Xg离心菌液20-30分，沉淀细胞残基，收集上清
可能会有一定比例的细胞蛋白，包括6XHis-tagged蛋白，仍然未溶而存在于细胞沉淀。
为了得到更多的标签蛋白，材料在变性条件下纯化之前必须在变性条件下溶解。
4、加入5μ2XSDS-PAGE样品Buffer于5μ上清中，-20度储存以备SDS-PAGE
5、纯化过程见说明书
说明书：
变性条件下Ecoli菌液的制备
材料和试剂
细胞颗粒；2XSDS-PAGE样品Buffer；BufferB；可选择：
BufferB/7M尿素和Benzonase核酸酶（7M尿素不变性，8M尿素变性）
Buffer组成参见AppendixA
步骤：
1、冰上15分溶解细胞颗粒，BufferB重悬，每克湿重5ml
1a、（可选）冰上15分钟溶解细胞颗粒，BufferB/7M尿素中重悬，每克湿重5ml，加入Benzonase核酸酶，室温（20-25度）孵育30分钟
需要多少细胞取决于6XHis-tagged蛋白的表达水平和使用的表达系统。
Ni-NTA基质的吸附能力是蛋白依赖性的，一般为20mg/ml。
2、室温下摇动细胞15-60分钟或者用漩涡振荡器轻轻震荡，注意避免泡沫
当溶液为半透明时表明溶解完全。
3、室温10000Xg离心菌液20-30分钟沉淀菌碎片
收集上清（清澈的菌液）
4、加入5μ2XSDS-PAGE样品Buffer于5μ上清中，-20度储存以备SDS-PAGE
5、纯化过程见说明书
说明书：
从Ecoli菌液中制备6XHis-tagged胞质蛋白
胞质蛋白是蛋白分泌到了Ecoli内膜和外膜之间的胞质中的蛋白。
适当的分泌物是可能的，当目的蛋白具有N端信号肽时，他可能在转移时被切掉。
为了使用Ni-NTA纯化胞质空间的分泌蛋白，6XHistag必须被加到目标蛋白的C末端。
N末端的6XHistag将会与转移信号一起处理掉。
材料和试剂
30mMTris.Cl；20%蔗糖，PH8.0；500mMEDTA；5mMMgSO4；BufferNPI-10
Buffer成分参见附录A
步骤：
1、孵育诱导1升的Ecoli产物
2、4000Xg离心20分收集细胞产物。
重悬沉淀于30mMTris.Cl；20%蔗糖，PH8.0；每克湿重80ml。
保持冰上操作，逐滴加入500mMEDTA至1mM。
冰上孵育细胞5-10分钟，轻轻震荡。
3、细胞悬浮液在4度8000Xg离心20分钟，弃去上清，用同样体积的冰的5mMMgSO4重悬沉淀。
冰盒中震荡或摇动10分钟。
4、4度8000Xg离心20分钟
上清此时为浓的渗出性液体，其中包含有胞质蛋白
5、继续纯化之前需要对上清进行透析除去裂解液。
说明书：
天然条件下从昆虫细胞制备细胞溶液
以下步骤对于昆虫细胞内的6XHistag蛋白表达的纯化可以作为一个起始的步骤。
尽管如此，进一步的优化可能是必须的。
肃然在昆虫中的表达效率一般高于哺乳动物的，但是用杆状病毒感染昆虫细胞进行表达还是有一定的困难。
表达蛋白水平比在细菌表达系统中得到的要显著的低，一般的少量的细胞材料就可以了。
昆虫细胞中总的蛋白含量约为20mg/107个细胞。
重组蛋白的表达范围为0.05%-50%，理论上的蛋白最大产量为10μg/107个细胞.
对于昆虫细胞的裂解，BufferNPI-10中应该补充1%的LgepalCA-630（NonidetP40）
材料和试剂
细胞颗粒；PBS，BufferNPI-10（含有1%的LgepalCA-630（NonidetP40））
Buffer组成参见附录A
步骤：
1、用PBS清洗感染的细胞，1000Xg离心5分钟收集细胞
2、用BufferNPI-10（含有1%的LgepalCA-630（NonidetP40））溶解细胞，没1-2X107用4ml。
冰上孵育10分钟。
裂解Buffer应该包含有咪唑。
对于6XHis-tagged蛋白，小于20mM咪唑不会影响
吸附材料。
尽管如此，如果标签蛋白在这些条件下没有被吸附，咪唑浓度就应该降
低到5-10mM
3、4度10000Xg离心菌液10分钟沉淀细胞碎片和DNA，收集上清
上清中包含6XHis-tagged蛋白
4、加入5μ2XSDS-PAGE样品Buffer于5μ上清中，-20度储存以备SDS-PAGE
5、纯化过程见说明书
说明书：
使用注射器人工纯化6XHis-tagged蛋白
预先准备：
使用柱子之前，滤膜过滤（0.2或0345μm）或离心菌液（大于10000Xg）保证无杂质
材料和设备
包含6XHis-tagged蛋白的清澈的细胞液。
BufferNPI-10，NPI-20，NPI-250（天然条件）或BufferB、C、E（变性条件）。
所有的Buffe字使用前都因该过滤（0.2或0345μm）。
10ml注射器。
连接适配器。
步骤：
1、用BufferNPI-10（天然条件）或BufferB（变性条件）吸满注射器，连接合适的适配器，推注射器排除气体直至液体从适配器底部流出。
2、连接注射器与cartridge的入口，把出口的塞子拿掉
3、10倍体积Buffer平衡cartridge
不要用高压强行使Buffer流出。
理想流速是1ml/min（1mlcartridge）和5ml/min（5mlrtridgecat）
4、移去注射器并填满清澈的菌液。
菌液流速要求与步骤3相同
5、用一个新的注射器和相同的流速（步骤3、4），10倍体积的BufferNPI-20（天然条件）或BufferC（变性条件）冲洗（Wash）cartridge。
6、用Buffer-NPI250（天然条件）或BufferE（变性条件）填满注射器，使用推荐的流速从cartridge洗脱（Elute）蛋白。
蛋白一般会被5-10倍柱体积液体洗脱
说明书：
使用自动层析系统纯化6XHis-tagged蛋白
说明书适用于液体层析系统（如AKAT货FPLC系统）。
在平衡，装载，冲洗，洗脱过程中的背景压力一般会由系统产生。
不要让压力超过5Bar（0.5MPa）
材料和仪器
包含6XHis-tagged蛋白的清澈的细胞液。
使用柱子之前，滤膜过滤（0.2或0345
μm）或离心菌液（大于10000Xg）保证无杂质。
BufferNPI-10，NPI-20，NPI-250（天然条件）或BufferB、C、E（变性条件）。
所有的Buffe字使用前都因该过滤（0.2或0345μm）。
连接适配器。
步骤;
1、用BufferNPI-10（天然条件）或BufferB（变性条件）吸满系统泵，cartridge连接泵的出口，小心操作，不要让气体进入系统。
2、移去cartridge出口的塞子，连在系统的管子上
3、10倍体积Buffer平衡cartridge
1ml/min（1mlcartridge）和5ml/min（5mlrtridgecat）
4、使用系统泵或superloop载入清澈的细胞液进入cartridge。
保证目标蛋白吸附在Ni-NTA基质上，保留流出的部分作为SDS-PAGE分析
5、用Buffer-NPI20（天然条件）或BufferC（变性条件）填满系统泵，冲洗（Wash）cartridge直至A280回到基础值
保留洗液用于SDS-PAGE分析
6、用Buffer-NPI250（天然条件）或BufferE（变性条件）从cartridge洗脱（Elute）蛋白
蛋白一般会被5-10倍柱体积液体洗脱。
用超过20倍体积的平缓的线性梯度洗液有助于分离蛋白。
问题解决方法
背景压力超过5Bar（0.5MPa）
a）柱子阻塞
实施定位清洗（附录B）
cartridge吸附的菌液可能含有碎片。
上柱前滤膜过滤或离心
b）使用了高粘性Buffer
有机溶剂或稳定装置例如甘油会导致背景压力的增大，降低流速
蛋白未被吸附
a）6XHistag没有出现
检查表达载体的结构。
保证阅读框的准确性
检查可能的转移起始端（N末端tag）或者未成熟的终止端（C末端）
b）6XHistag量很少
变性条件下纯化。
把标签转移到蛋白相反的末端
c）6XHistag降解
检查6XHistag是否与蛋白相连接
D）吸附条件不正确
检查Buffer的PH。
尿素的裂解经常导致PH的不稳定。
在使用前应该检查PH
蛋白洗脱在washBuffer
A）6XHistag部分被隐藏
变性条件纯化
B）Buffer成分不正确
检查变性WashBuffer的PH
纯化过程蛋白突然沉淀
A）温度太低
室温下进行纯化操作
B）蛋白形成聚合体
加入促溶试剂如0.1%TritonX-100或Tween-20，20mMβ-ME，2MNaCl，或稳定辅助因子如Mg离子。
这些都是Buffer必须的，能保持蛋白的溶解性
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