马铃薯蛋白作为一种新型的抗菌剂对断奶仔猪生产性能.docx
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马铃薯蛋白作为一种新型的抗菌剂对断奶仔猪生产性能
马铃薯蛋白作为一种新型的抗菌剂对断奶仔猪生产性能、肠道中微生物和免疫力的影响
马铃薯（SolanumtuberosumL.cv.Goguvalley）蛋白作为一种
新型的抗菌剂对断奶仔猪生产性能、营养物质消化率、
肠道中微生物和免疫力的影响
Potato（SolanumtuberosumL.cv.Goguvalley）proteinasanovelantimicrobialagentinweanlingpigs
付建福[1]（译），Z.Jin等（著）
摘要：
选择23±3日龄，初重基本一致的杜长大断奶仔猪（6.42±0.74Kg）进行28d试验,随机分为5个处理,每个处理4个重复,每个重复14头猪,自由饮水和采食。
试验主要探讨饲喂不同水平的马铃薯蛋白对断奶仔猪生产性能、营养物质消化率、免疫、小肠形态、大肠和粪便中的细菌菌落数的影响。
日粮分为：
对照组（PC）（基础日粮+150ppm的安普霉素和10ppm的硫酸粘杆菌素），试验组（PP）（基础日粮中添加0，0.25，0.50和0.75%的马铃薯蛋白）。
基础日粮分两个阶段：
第一阶段（0-14d）和第二阶段（14-28d）。
马铃薯蛋白是从马铃薯新品种提取而来，并显示它最小抑制浓度为300至500μg/ml。
对照组与试验组（0.25-0.75%的马铃薯蛋白）中断奶仔猪生产性能相比，试验组（0-0.75%）的生产性能随着马铃薯蛋白的添加水平的增加，呈现二次线性增加的趋势。
经过28d试验，对照组的仔猪与试验组相比，提高了断奶仔猪全期的ADG（P<0.05）和G:
F（P=0.09）。
但是，试验组中的断奶仔猪的ADG（P<0.05）,ADFI（P=0.052）和G：
F（P=0.098）随着日粮中马铃薯蛋白添加量的增加，呈线性的增加。
对照组与试验组相比，干物质和粗蛋白的消化率较高。
在试验的第二阶段，试验组随着马铃薯蛋白添加量的增加，干物质消化率呈线性增加。
除了14d和28d，对照组比试验组的断奶仔猪粪便中的细菌总数和大肠杆菌有所下降，和随着日粮中马铃薯蛋白添加量的增加，断奶仔猪呈线性的减少粪便、盲肠、结肠和直肠中的微生物数量。
试验组可以提高植物血凝素的水平，血凝素效价在21d时PC组中的断奶仔猪最高。
在28d血凝素的效价随着PP日粮中的马铃薯蛋白粉的添加量呈二次增加（P=0.07）。
PC日粮与PP日粮相比，降低断奶仔猪的隐窝深度（P=0.06），提高绒毛高度：
隐窝深度（P=0.082）的趋势。
这些结果可以表明，马铃薯蛋白可以替代抗生素在饲料中的使用，因为它具有抗菌活性，有效减少大肠杆菌的数量，也可以提高断奶仔猪生产性能。
关键词：
抗菌活性，生产性能，肠道微生物，营养物质消化率，马铃薯蛋白，断奶仔猪
1.前言
抗生素发现就开始应用在猪生产中，给养猪业带来了巨大的发展，但是抗生素的继续使用和滥用，会导致致病菌的耐药性和药物残留等问题（Schwarz等，2001）。
由于人们越来越重视食品安全，2006年1月欧盟开始全面禁止抗生素做为促生长剂使用。
为了维持动物的生产性能，人们开始寻找一些抗生素的替代物（Bae等，1999）。
近年来，抗菌肽（AMP）是生物细胞特定基因编码经特定外界条件诱导产生的一类多肽。
抗菌肽可以从动植物组织和机体的分离和提取。
抗菌肽是小基因信号肽，研究表明抗菌肽能抑制革兰氏阴性菌、真菌和分歧杆菌的繁殖（Zasloff，2002）。
马铃薯是广泛种植的植物，作为人类的全球性的食物，它具有抗细菌（Han等，1996），和抗真菌的特性（Do等，2004）。
一种新的马铃薯品种在戈古流域开发，众所周知，它能抵抗疾病。
在人类健康研究中发现，马铃薯可以增加双歧杆菌和乳酸杆菌的数量，并能减少大肠杆菌的数量（Lee，2005）。
因此，马铃薯中的蛋白具有抗菌的活性（Kim等，2005）。
在本研究中，马铃薯蛋白作为抗生素的替代物在断奶仔猪日粮中的应用和评价了马铃薯蛋白对断奶仔猪的生产性能、营养物质消化率和肠道微生物区系的影响。
2.材料与方法
2.1马铃薯蛋白的制备和最低剂量的分析
马铃薯块茎从马铃薯新品种中获得，储藏在4℃，相对湿度为95-100%的黑暗地方。
块茎在蒸馏水浸泡2h，放在地面上，接着放在蛋白质提取液，混合提取液，15min，为了充分提取蛋白质，接着在1260转/min离心15min。
上清液冷冻干燥，最后获得马铃薯蛋白。
冷冻干燥的马铃薯蛋白从马铃薯块茎提取，溶解在无菌、去离子的蒸馏水中制备成10000μg/ml溶液，为了微量检测最小抑菌浓度（MIC）。
菌株分别为大肠杆菌，金黄色葡萄球菌、猪霍乱沙门氏菌和鸡沙门氏菌。
MIC的终点是马铃薯蛋白的浓度对这样菌株不能生长时的浓度。
2.2动物和日粮
选择280头杜长大，平均体重为6.42±0.74Kg;23±3日龄的断奶仔猪，公母各半，随机的分为5个处理，每个处理4个重复，每个重复14头断奶仔猪。
自由饮水和采食。
试验日粮为抗生素组（PC），马铃薯蛋白组（PP）（0，0.25，0.50和0.75%的马铃薯蛋白）。
试验基础日粮分为两个阶段（第一阶段，0-14d和第二阶段，14-28d）。
第一阶段的日粮见表1，日粮含有3400kcal/kg的消化能和将1.65%的赖氨酸。
第二阶段日粮见表1，日粮含有3350kcal/kg的消化能和1.43%的赖氨酸。
所有的日粮中的营养成分达到或超过NRC（1998）推荐的标准。
表1：
试验日粮的组成及营养水平
项目
PC
马铃薯蛋白，%
0
0.25
0.50
0.75
0-2W
2-4W
0-2W
2-4W
0-2W
2-4W
0-2W
2-4W
0-2W
2-4W
成分，%
玉米
33.09
42.00
33.58
42.48
33.28
42.21
33.02
41.92
32.73
41.64
乳清粉
28.00
25.00
28.00
25.00
28.00
25.00
28.00
25.00
28.00
25.00
乳糖
5.00
2.00
5.00
2.00
5.00
2.00
5.00
2.00
5.00
2.00
豆粕，48%CP
13.84
19.08
13.76
19.00
13.65
18.86
13.51
18.73
13.38
18.58
大豆浓缩蛋白
6.00
5.00
6.00
5.00
6.00
5.00
6.00
5.00
6.00
5.00
血浆蛋白粉
5.00
5.00
5.00
5.00
5.00
鱼粉
4.25
2.25
4.25
2.25
4.25
2.25
4.25
2.25
4.25
2.25
豆油
2.20
1.90
2.04
1.75
2.20
1.90
2.35
2.06
2.51
2.22
石灰石
1.02
0.88
1.02
0.88
1.02
0.88
1.02
0.89
1.02
0.89
磷酸三钙
0.23
0.58
0.23
0.58
0.23
0.58
0.23
0.58
0.23
0.58
L-Lys.HCl,78%
0.16
0.13
0.16
0.13
0.16
0.14
0.16
0.14
0.17
0.15
DL-Met,100%
0.16
0.13
0.16
0.13
0.16
0.13
0.16
0.13
0.16
0.14
TRP，10%
0.15
0.15
0.15
0.15
0.15
0.15
0.15
0.15
0.15
0.15
食盐
0.10
0.10
0.10
0.10
0.10
0.10
0.10
0.10
0.10
0.10
氯化胆碱，25%
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
维生素预混料
0.30
0.30
0.30
0.30
0.30
0.30
0.30
0.30
0.30
0.30
矿物质预混料
0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
安普霉素，10%
0.15
0.15
硫酸粘霉素，1%
0.10
0.10
马铃薯蛋白
0.25
0.25
0.50
0.50
0.75
0.75
组成
ME，kcal/kg
3400
3350
3400
3350
3400
3350
3400
3350
3400
3350
CP,%
23.50
21.0
23.50
21.0
23.50
21.0
23.50
21.0
23.50
21.0
Ca,%
0.80
0.80
0.80
0.80
0.80
0.80
0.80
0.80
0.80
0.80
P,%
0.40
0.40
0.40
0.40
0.40
0.40
0.40
0.40
0.40
0.40
Lys,%
1.65
1.43
1.65
1.43
1.65
1.43
1.65
1.43
1.65
1.43
Trp,%
0.33
0.26
0.33
0.26
0.33
0.26
0.33
0.26
0.33
0.26
Met+Cys,%
0.93
0.83
0.93
0.83
0.93
0.83
0.93
0.83
0.93
0.83
2.3试验步骤
记录每头猪的体重和饲料消耗，从而计算每个阶段断奶仔猪的ADG、ADFI和G：
F。
0.25%三氧化二铬作为内源指示剂添加在日粮中分析营养物质的消化率，方法描述在Hahn等（2006）。
所有的猪在8-14d和22-28d饲喂混有三氧化二铬的日粮。
每个阶段的最后3d收集粪便，分析DM和CP的消化率。
粪在60℃下干燥，再把3天的粪便混合和粉碎，通过1-mm的筛子。
为了研究日粮对回肠氨基酸的表观消化率、小肠形态和大肠食糜中的微生物区系，每个处理组随机选择2个重复，在28d时屠宰。
收集回肠末端的食糜，保存在冰里。
大肠（盲肠、结肠和直肠）的内容物的收集，是为了分析微生物区系。
定期（0d、7、14、21和28d）对新鲜粪样测量其细菌数量。
十二指肠、空肠和回肠的内容物用生理盐水冲洗，并把这些肠段浸没在固定液（3%戊二醛、2%多聚甲醛和1.5%丙烯醛）中。
用来分析肠壁形态。
2.4化学和细菌分析
试验日粮和粪便的分析参照AOAC（1990）的方法。
铬的测量用自动的分光光度计，参照Fenton（1979）的方法。
氨基酸的分析通过高效液相色谱法分析（Knabe等，1989）。
蛋氨酸和胱氨酸氧化后用过甲酸分析（Moore，193）。
粪样和大肠中的食糜微生物区系参照Torrallardona等（2003）的方法。
微生物菌落计算用细菌总数，大肠杆菌、葡萄球菌表示。
2.5免疫试验
评价体液免疫反应，在第14d时，每个重复中的2头断奶仔猪注射2.5ml的20%绵羊红细胞溶液。
在注射后第7d和14d，前腔静脉采血。
血液在1260r/min离心15min，收集血清，在56℃灭活30min，最后放在-20℃下保藏直到分析。
绵羊血红细胞的抗体效价（SRBC）的测定用血凝反应，参考Wegmann和Smithies（1966）的方法。
2.6统计分析
试验是完全随机试验设计，使用GLM程序统计分析（SASInstInc，Cary，NC）。
利用t检验，比较PC与0，0.25，0.5和0.75%的马铃薯蛋白。
线性和二次检验日粮中的马铃薯蛋白添加量对动物的影响。
P<0.05表示差异显著和P<0.10表示具有差异的趋势。
3.结果
3.1最小抑菌浓度（MIC）试验
马铃薯蛋白对不同类型的细菌的MIC的测定值见表2.在300μg/ml的水平，无鸡沙门氏菌的生长，然而在400μg/ml能抑制大肠杆菌和猪霍乱沙门氏菌的生长，当浓度达到500μg/ml时，抑制葡萄球菌的生长。
基于MIC的结果，可以得出日粮中马铃薯添加量为0.25，0.5和0.75%。
表2：
马铃薯蛋白对不同类型的细菌的最低抑制浓度（MIC）
细菌的类型
马铃薯蛋白的浓度，μg/ml
600
500
400
300
200
MIC
金黄色葡萄球菌
-
-
+
+
+
500
猪霍乱沙门氏菌
-
-
-
+
+
400
鸡沙门氏菌
-
-
-
-
+
300
大肠杆菌
-
-
-
+
+
400
3.2生长性能
马铃薯蛋白对断奶仔猪的生长性能的影响见表3。
在第一阶段：
PC与PP组相比，对断奶仔猪的ADG和ADFI无显著性差异。
然而，PC与PP相比，提高了断奶仔猪的G：
F（P<0.05）。
在第一阶段中，随着马铃薯蛋白在日粮的添加水平，线性的提高了断奶仔猪的ADG（P=0.05）和ADFI（P=0.086）。
在第二阶段：
PC与PP相比，对断奶仔猪的ADG、ADFI和G：
F无显著性差异;然而，随着日粮中的PP添加量的增加，对断奶仔猪的ADG呈线性增加（P<0.05）,对断奶仔猪的ADFI（P=0.073）和G：
F（P=0.071）具有线性提高的趋势。
试验全期：
PC与PP相比，提高了断奶仔猪的ADG（P<0.05）和G：
F（P=0.090），然而断奶仔猪饲喂PP，随着日粮中的PP的添加量的增加，线性的增加了全期断奶仔猪的ADG（P<0.05），ADFI（P=0.052），和G：
F（P=0.098）。
表3：
马铃薯蛋白对断奶仔猪生产性能的影响
项目
PC
马铃薯蛋白，%
SEM
P值
0
0.25
0.50
0.75
PC：
PP
线性
二次
第一阶段（0-14d）
ADG，g
326
276
291
320
322
8.60
0.529
0.055
0.732
ADFI，g
466
415
440
475
472
11.4
0.910
0.086
0.587
G：
F，g/kg
698
664
661
674
683
4.60
0.033
0.101
0.477
第二阶段（14-28d）
ADG，g
424
355
358
377
418
10.31
0.139
0.034
0.347
ADFI，g
661
573
567
604
648
14.63
0.160
0.073
0.413
G：
F，g/kg
640
618
631
625
644
3.79
0.577
0.071
0.773
全期（0-28d）
ADG，g
374
315
324
349
371
7.97
0.022
0.023
0.691
ADFI，g
561
494
506
540
560
10.63
0.304
03052
0.866
G：
F，g/kg
667
637
641
646
661
4.19
0.090
0.098
0.549
3.3营养物质消化率
马铃薯蛋白对断奶仔猪的DM和CP的消化率的影响见表4。
在第一阶段，PC组与PP组相比，极显著的提高了断奶仔猪DM的消化率（P<0.01）和提高了断奶仔猪CP的消化率趋势（P=0.068）。
然而，日粮中的PP添加量对断奶仔猪的DM和CP的消化率没有呈现线性和二次的规律。
第二阶段，PC与PP相比，显著的提高了断奶仔猪的DM和CP的消化率（P<0.01）。
随着断奶仔猪日粮中PP的添加量的增加，线性的提高了仔猪的DM的消化率（P<0.05）。
表4：
马铃薯蛋白对断奶仔猪营养物质消化率的影响
项目
PC
马铃薯蛋白，%
SEM
P值
0
0.25
0.50
0.75
PC：
PP
线性
二次
第一阶段
DM，%
83.94
80.83
81.45
80.53
82.97
0.48
0.005
0.267
0.408
CP，%
82.13
78.87
79.27
78.66
81.11
0.58
0.068
0.317
0.446
第二阶段
DM，%
84.03
80.28
81.20
81.34
82.50
0.36
0.003
0.019
0.836
CP，%
82.36
79.13
81.16
78.87
80.78
0.40
0.005
0.439
0.937
PC与PP相比，对断奶仔猪回肠中的氨基酸的消化率无显著性差异。
但是，随着断奶仔猪日粮中马铃薯蛋白添加量的增加，回肠中His（二次，P=0.093），Glu（线性，P=0.053），Gly（线性，P=0.070）和Pro（线性，P=0.073）的消化率而提高（见表5）。
表5：
马铃薯蛋白对断奶仔猪的回肠氨基酸表观消化率的影响
项目
PC
马铃薯蛋白，%
SEM
P值
0
0.25
0.50
0.75
PC：
PP
线性
二次
必需氨基酸，%
Arg
84.8
80.7
80.3
78.6
83.8
1.2
0.25
0.52
0.30
His
80.0
77.1
70.3
76.0
78.9
1.4
0.22
0.37
0.09
Ile
79.4
73.1
70.3
73.9
80.1
1.5
0.45
0.22
0.54
Leu
78.9
75.9
80.2
76.8
73.8
1.4
0.61
0.53
0.29
Lys
83.0
82.7
84.3
79.9
78.2
1.0
0.45
0.11
0.45
Met
79.1
72.9
75.0
77.1
78.0
1.7
0.60
0.33
0.88
Phe
81.1
78.8
83.1
77.8
76.9
1.4
0.63
0.47
0.43
Thr
78.2
69.9
75.0
76.9
72.2
1.8
0.47
0.63
0.25
Val
75.4
72.4
79.1
71.9
73.9
1.8
0.93
0.89
0.59
非必需氨基酸，%
Ala
80.9
77.3
78.1
75.5
76.2
1.4
0.25
0.67
0.99
Asp
83.3
79.5
84.0
81.1
82.5
0.9
0.77
0.49
0.44
Cys
78.8
74.8
81.2
76.1
77.0
1.4
0.87
0.92
0.41
Glu
85.4
79.6
80.2
84.1
85.2
1.2
0.55
0.05
0.76
Gly
73.9
63.7
63.9
66.5
71.9
1.6
0.11
0.07
0.42
Pro
80.8
73.2
76.0
77.1
81.6
1.4
0.51
0.07
0.77
Ser
82.2
77.7
81.0
77.2
80.0
1.0
0.31
0.77
0.93
Tyr
77.1
74.0
78.3
74.8
79.1
1.3
0.94
0.40
0.99
3.4粪和大肠中的细菌菌落数
马铃薯蛋白对断奶仔猪粪中细菌的数量的影响见表6。
PC与PP相比，第14d粪中的细菌数量总数和第14、28d粪中的大肠杆菌数量显著降低（P<0.05）。
但是，PC与PP相比，第0、7和21d时粪中的细菌总数、大肠杆菌和葡萄球菌的数量无显著性差异。
马铃薯蛋白降低了粪中的细菌总数、大肠杆菌和葡萄球菌数量。
随着日粮中马铃薯蛋白的添加量的增加，在28d（线性，P<0.05）和在14d（线性，P<0.001）,降低粪中的葡萄球菌的数量（二次，P<0.05）;具有降低大肠杆菌的数量的趋势（二次，P=0.058）。
在21d，PP降低粪中葡萄球菌数量（线性，P<0.05），具有降低粪中的细菌总数（线性，P=0.062）和大肠杆菌的数量（线性，P=0.071）的趋势。
在7d，PP日粮具有降低粪中的细菌总数（线性，P=0.059）和葡萄球菌数量（线性，P=0.063）的趋势。
表6：
马铃薯蛋白对断奶仔猪粪中的细菌数量的影响
d
细菌类型
PC
马铃薯蛋白，%
SEM
P值
0
0.25
0.50
0.75
PC：
PP
线性
二次
0
细菌总数
8.87
8.91
8.89
8.90
8.88
0.01
0.517
0.655
0.972
大肠杆菌
6.54
6.66
6.57
6.60
6.56
0.03
0.682
0.447
0.760
葡萄球菌
5.09
5.17
4.96
4.95
4.95
0.04
0.158
0.188
0.347
7
细菌总数
8.67
9.22
9.08
8.91
8.46
0.11
0.403
0.059
0.560
大肠杆菌
6.14
6.64
6.33
6.30
6.08
0.12
0.576
0.228
0.885
葡萄球菌
4.78
5.23
4.99
4.76
4.46
0.12
0.894
0.063
0.923
14
细菌总数
8.64
9.49
9.15
8.92
8.23
0.12
0.047
0.001
0.305
大肠杆菌
5.77
7.12
6.11
6.18
5.84
0.13
0.042
0.001
0.058
葡萄球菌
4.11
4.92
4.17
4.10
4.08
0.09
0.898
0.001
0.026
21
细菌总数
8.34
9.00
8.68
8.52
8.23
0.11
0.413
0.062
0.964
大肠杆菌
5.45
6.70
6.08
5.89
5.68
0.17
0.250
0.071
0.586
葡萄球菌
3
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