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蜘蛛香分子标记纯翻译文档

蜘蛛香的ISSR分子标记与一些生化特性的相关性

ArunJugran,,SandeepRawat,PreetiDauthal,SuvenduMondal,

IndraD.Bhatt,RanbeerS.Rawal

摘要：

为建立ISSR分子标记与蜘蛛香抗氧化活性的关系，我们对5个较远的植物群体进行了分析：

用3种不同的体外测定法来植物群的总酚含量，类黄酮含量和抗氧化活性的情况，结果发现它们在整个植物群中有显著变化（P<0.01）。

其中，在Kalika群体中发现有较高的总酚含量（14.63±0.05mgGAE/gdw），高黄酮含量（6.96±0.11mgQE/gdw），高单宁含量（3.85±0.54mgGAE/gdw）和高抗氧化活性（ABTS-4.82±0.18mMAAE/100mg;DPPH-4.92±0.02毫米AAE/100mg及FRAP-7.54±0.02mMAAE/100mg）。

我们通过利用13个ISSR对品种中的31个的基因型进行分子标记，可以看出：

有97个较高平均水平遗传多样性的片段[多态位点（PPB）的比例-69.90％，Shannon信息指数（I）-0.39]。

通过DPPH分析法发现在这97个ISSR分子标记中，只有HB8-5，HB12-1和17898B-8这三个标记表现出与抗氧化活性有显著（P<0.05）的相关性。

因此，我们建议当一些品种中没有像连锁图谱和数量性状基因座（QTL）这样的遗传信息时，与高抗氧化活性相关的这些标记在基因型或者种群上的更高程度的选择将有助于的育种项目的实施。

关键字：

抗氧化剂；遗传多样性;ISSR;药用植物

1.引言:

缬草蜘蛛香（败酱科），俗称“Tagar”或“印度缬草”，生长在海拔为1000-3000米（海平面以上）的温带喜马拉雅的野生地区。

这些品种为多年生草本植物，特点是根状茎，偶尔也有匍匐茎；直立、不分枝的花茎有相当显著的形态变化。

蜘蛛香属于雌雄异株植物：

杂性或者偶尔杂性同株（Prakash,1999）；另外，众所周知的是：

其有着医疗价值和其他民族植物学的价值（Mathela等人，2005;Singh等人，2010）。

该植物的活性成分-缬草，从其根状茎中衍生而来，可用于各种疾病的治疗（Prakash,1999），这些物种的根和茎也可用于温和镇静的植物医药的制剂（Houghton,1999）。

我们从植物化学方向调查了该物种的一些情况（Mathela等人，2005年;Singh等人，2006年，2010年）且最近很多报告已经确立了该植物体内由于存在多酚以及其自由基清除性能（Parr和Bolwel,2000;ScalbertandWilliamson,2000）而产生的抗氧化潜能（Kalim等人,2010）和对某些慢性疾病与变性疾病有着广为人知的预防效果（Meyer等人，1998;Record等人，2001）。

已经有利用AFLP标记来开展对蜘蛛香的遗传多样性研究（Rajkumaretal.,2011）。

在其他研究中，则利用AFLP和叶绿体SSR标记分析缬草wallrothii（群体结构和遗传变异情况（Grassietal.,2004）。

然而，并没有报告显示蜘蛛香的生化性状与分子标记的相关性。

由于ISSR分子标记下DNA的PCR扩增引物为重复序列组成的单一的11-18bp的片段，所以与其他的RAPD，AFLP标记相比具有优势。

相对于报道的RAPD（Karpetal.,1997;Virketal.,2000）的低再现性和低多态性以及AFLP标记分析（Karpetal.,1997）的高成本和技术专长，ISSR分子标记具有高度的可重复性和成本效益的优势（Powelletal.,1996）。

这样，在生物和农艺性状的相关性上，我们就开始很好地研究分子标记且也设想了它们在各种育种项目上的潜能。

例如，遗传变异和SSR/SRAP/ISSR分子标记在与如下农艺性状相关性方面的潜能性：

（i）桑树物种生化指标（Karetal.,2008）;（ii）甜樱桃品种果实性状（Ganopoulosetal.,2011）;（ⅲ）沙棘物种对干收缩病的抗性（Ruanetal.,2009）;（iv）大麻的化学型的选择（Pacificoetal.,2006）;（v）花生叶锈病和晚期叶斑病的抗性（Mondal和Badigannvar,2010）等。

鉴于上述情况，本研究试图建立蜘蛛香ISSR分子标记与生化特性特别是抗氧化活性的相关性，其研究结果将有助于高抗氧化活性基因的鉴定，这将进一步在该物种的育种项目中得以利用，从而促进商业化的种植。

2材料与方法

2.1植物材料

在印度的库蒙喜马拉雅地带，根据野生地区的实际情况，从5处较远的植物群体中采集样品，其中，每个群体选40-50个基因型，然后种植在喜马拉雅环境与发展研究所的GB的草药园，戈西-Katarmal，阿尔莫拉和北阿坎德邦（印度）。

印度德拉敦调查植物园验证了这些物种的植物学身份，然后把样品储存在印度德拉敦调查植物园和喜马拉雅环境与发展研究所的GB的草药园的植物标本馆（见表1）。

从每个群体的单个植株中采集5-8基因型的叶子和4个基因型的根茎，然后用于植物化学和遗传学研究。

2.2植物化学分析

从每个群体的单株中随机选择4块根状茎，用自来水冲洗干净，并放在50◦C的干热灭菌器中烘干。

烘干后，把根状茎磨成细粉，然后在1.0g的细粉中加入25ml80％（体积/体积）的甲醇制成悬浮液，用来提取根状茎的总酚含量，类黄酮含量和单宁含量。

然后缓慢搅拌悬浮液12个小时并用超声波（型号ANIS09001，东芝，新德里，印度）处理10分钟；把提取液放入10000rpm离心机中离心15分钟后收集上清液，再将其过滤，最后在进行化学分析之前放入4◦C冰箱保存。

表1五个蜘蛛香群体的地理分布和生境情况

序号

地点

海拔（米）

纬度（N）

经度（E）

入藏号

生境

1

Kstarmal

1250

29°38′25′′

79°3720

BSD-119783（BSI）

混交林,潮湿的栖息地

2

Manjkhali

1700

29°40′00′′

79°33′00′′

BSD-113209（BSI）

松林,陡坡

3

Kalika

1800

29°39′51′′

79°29′03′′

BSD-113201（BSI）

松林,陡坡

4

Sitlakhet

1900

29°35′40′

79°32′42′′

GBPIHED-3201-1

混交林,潮湿的栖息地

5

Doonagiri

2100

29°47′37′′

79°27′38′′

BSD-119783（BSI）

草地,陡坡,潮湿的栖息地

2.2.1总酚含量

用福林酚比色法（SingletonandRossi,1965）测定材料的总酚含量。

首先把甲醇提取物稀释至2.50ml，然后加入0.25ml的福林酚试剂，再加入2.5ml的7％的碳酸钠中和；90分钟后用日立U-2001紫外可见分光光度计（日立，东京，日本）所测得的结果是蓝色吸光度值在765nm处。

其结果表示为每毫克的五倍子酸中所含有的每克的干重数（mgGAE/gdw）。

2.2.2.总类黄酮含量

用三氯化铝比色法测定黄酮含量（Changetal.,2002）：

用1.5ml的蒸馏水稀释0.5ml的提取物，然后再加入0.5ml的10％的三氯化铝配成混合物，在混合物中加入1M（0.1ml）的醋酸钾和2.8ml的蒸馏水。

30分钟后使用紫外可见分光光度计测得的吸光度值在415nm处，其结果表示在每毫克槲皮黄酮中所含的干重的克数（mgQE/gdw）。

2.2.3.总单宁含量

用Nwinuka等人（2005）的方法测定总单宁含量。

简言之，就是在0.5mlFolin–Dennis试剂和1ml饱和的碳酸钠溶液中加入5ml甲醇提取物；然后用蒸馏水将该溶液稀释至10ml，在25◦C室温下静置20分钟。

用紫外可见分光光度计测出有蓝绿色色的吸光度且吸光度值在700nm处。

结果表示在每毫克单宁酸中所含的干重的克数（mgTAE/gdw）。

2.3抗氧化活性

用三种不同的体外测定的方法即：

ABTS、DPPH和FRAP分析法来测定抗氧化物的活性（Rawatetal.,2011）。

所有这些测定的标准曲线表示为每摩尔的抗坏血酸相当于100克的干重（mMAAE/100gdw）。

2.4.DNA提取和PCR扩增

从草药花园采集1克每种基因型的叶片，用液氮进行研磨，然后用CTAB法提取叶组织中总基因组的DNA（Doyle和Doyle，1987）。

用ISSR分析的PCR扩增反应在0.2ml离心管中进行，反应体系为20μl。

分别有2μl的10×反应缓冲液，2mMMgCl2，200μM的dNTPs，10pmol的引物，20ng的DNA模板，1U的TaqDNA聚合酶（Genetix,Delhi,India）。

PCR热循环程序为：

预变性94◦C5分钟，然后进入扩增循环，在每个循环中，94◦C1分钟使模板变性，在非梯度温度42–55◦C（表2）退火1分钟，72◦C延伸2分钟完成一个循环，重复35个循环，最后在72◦C延伸7分钟。

4◦C保存，以备后期进行凝胶分析。

从德国默克生物科学处采购了30对引物（）并且进一步分析得出有13对ISSR引物具有清晰的带型和可重复性特点（表2）。

PCR扩增在T-梯度PCR系统上进行（Biometra公司，哥廷根，德国）。

扩增的产物在2％琼脂糖凝胶电泳上进行分离，并且在UVI箴铂凝胶成像系统下可以看出分离结果（Version11.9,Cambridge,UK）。

DNA的RulerTM基因梯混合（GENETIX，新德里，印度）可用作DNA片段大小的标记。

在每一个实验中，除了以水为对照的DNA之外，其它的空白对照包含了所有PCR成分。

2.5数据分析

本研究中进行了4次重复分析植物化学物质包括总酚，类黄酮和单宁酸含量以及抗氧化的活性，并用SYSTAT程序（威尔金森，1987）对数据进行方差分析，在MicrosoftExcel2007中确定其相关系数（R）及决定系数（R2）。

具有可重复性的ISSR片段在有条带处画1，不存在条带出画0，并使用每个分子标记构成一个二元矩阵。

用1.31版本的POPGENE（Yeh等人,1999）可测定每个群体的每个片段或者每个条带出现的的频率，也可估计多态位点（PPB），Shannon信息指数（Shannon和Weaver,1949）和Nei’s基因多样性指数（1973）的百分比。

这样每一对群体之间的遗传距离就可以计算出来（Nei,1978）。

使用1.3版的“群体遗传学分析工具（TFPGA）”软件（Miller,1997）对数据进行算术加权平均（UPGMA）聚类处理（Swofford和Olsen,1990）：

聚类分析的可靠性在于可以通过相同的软件借助1000个引导程序的相互作用进行评估；使用6.1版GenALEx软件（Peakall和Smouse，2006）可以使分子方差（AMOVA）分析用来划分抗氧化活性的遗传变异。

继999随机排列评估之后，估计方差分量同样可以进行评估；每个标记和抗氧化活性的相关性可以用SYSTAT软件进行简单的回归分析来计算（Wilkinson,1987）；通过利用GeneAlEx软件（Peakall和Smouse，2006），纬度和经度的信息可以用于计算成对种群之间的地理距离（Peakall和Smouse,2006）。

用同样的软件进行Mantel检验可以研究遗传距离和地理距离之间的关系（Mantel,1967）。

表2用于蜘蛛香的遗传多样性分析的ISSR引物序列以及退火温度

序号

名称

序列

序列长度

扩增得片段数

退火温度（◦C）

1

814

CTCTCTCTCTCTCTCTTG

18

6

52.1

2

844A

CTCTCTCTCTCTCTCTAC

18

5

52.1

3

17898A

CACACACACACAAC

14

10

45.1

4

17898B

CACACACACACAGT

14

8

44

5

17899A

CTCTCTCTCTCTCTCTGC

18

3

45.1

6

HB10

GAGAGAGAGAGACC

14

8

42

7

HB11

GTGTGTGTGTGTCC

14

11

45.3

8

HB12

GTGTGTGTGTGTCC

14

7

46.5

9

HB13

GAGGAGGAGGC

11

6

45.6

10

HB14

CTCCTCCTCGC

11

5

45

11

HB15

GTGGTGGTGGC

11

10

46

12

HB8

GAGAGAGAGAGAGG

14

10

51

13

HB9

GTGTGTGTGTGTGG

14

8

51

3．结果和讨论

3.1.植物化学的多样性

如表3所示，群体间的总酚和类黄酮含量呈显著差异（P<0.01）：

如在群体Kalika中有较高的总酚含量：

14.63±0.05mgGAE/gdw，黄酮含量：

6.96±0.11mgQE/gdw，单宁含量：

3.85±0.54mgGAE/gdw，而在群体Katarmal中总酚含量：

8.70±0.93mgGAE/gdw，黄酮含量：

5.02±0.18mgQE/gdw，单宁含量：

2.95±0.09mgGAE/gdw（见表3）。

而相比之下，在同一个科中（Surveswaran等人，2007），蜘蛛香总酚含量的平均值：

12.35mgGAE/gdw要远高于Nardostachyusjatamansi0.34mgGAE/gdw和缬草：

1.42mgGAE/gdw（Bhattetal.,2012）.然而，在其他研究中已经报道蜘蛛香在50％甲醇提取物中测得有高含量的总酚（73.13±0.50mgGAE/g）和高含量的黄酮类化合物（7432±0.26mgQAE/克）（Kalimetal.,2010）。

物种内的这种巨大差异可能是由于采集样品来自于从不同的生境条件和不同的海拔范围这样的环境的变化以及由此造成的遗传的变异（Connoretal.,2005）。

因此，我们通常认为，在喜马拉雅采集的药用植物由于生境条件的不同将会造成化学成分的巨大差异（Andola等人，2010）。

表3蜘蛛香不同群体中植物化学物质含量与抗氧化活性情况

群体

总酚含量（mg/g）

总黄酮含量（mg/g）

总单宁含量（mg/g）

ABTS（mM/100mg）

DPPH（mM/100mg）

FRAP（mM/100mg）

Katarmal

8.70±0.93

5.02±0.18

2.95±0.09

2.94±0.18

3.74±0.16

4.26±0.14

Majkhali

13.50±0.14

6.36±0.11

3.60±0.42

4.36±0.11

4.52±0.03

7.37±0.32

Kalika

14.63±0.05

6.96±0.11

3.85±0.54

4.82±0.18

4.92±0.02

7.54±0.42

Sitlakhet

13.83±0.36

5.75±0.06

3.40±1.22

4.42±0.04

4.84±0.04

7.25±0.21

Doonagiri

11.13±0.41

6.82±0.09

3.25±0.04

3.56±0.18

4.73±0.36

5.34±0.16

Mean

12.35

6.182

3.41

3.78

4.36

5.90

f-Value

99.114**

188.649**

1.191ns

102.293*

27.870**

118.368*

LSD（p<

0.01）

0.313

0.376

0.563

1.015

0.244

1.313

注：

所有的值是4个重复与标准偏差的平均值。

极显着性水平：

P<0.01。

3.2.抗氧化活性

如表3所示，通过三种体外试验的方法测定群体间蜘蛛香的抗氧化活性发现：

群体间的抗氧化活性有显著差异（P<0.01）。

在群体Kalika中抗氧化活性有最大值（ABTS-4.82±0.18mMAAE/100mg;DPPH-4.92±0.02mMAAE/100mg及FRAP-7.54±0.42mMAAE/100mg），而在群体Katarmal中抗氧化活性有最小值（ABTS-2.94±0.18mMAAE/100mg;DPPH-3.74±0.16mMAAE/100mg及FRAP-4.26±0.14mMAAE/100mg;见表3）。

当与研究相同的物种或同科中不同物种的其他报告相比，本研究在抗氧化活性测定方面表现有较大的差异，（Surveswaran等人，2007;卡林等人，2010）。

Pearson相关系数分析显示海拔高度和DPPH活性有显著（P<0.01）的关系，同时揭示了总酚含量与抗氧化活性（ABTS-r=0.995;FRAP-r=0.987）之间的的显著（P<0.01）关系。

同样地，用ABTS和FRAP测定法发现总单宁含量与抗氧化活性有显著的（P<0.01;表4）正相关性。

表4蜘蛛香中化学物质与海拔的关系

序号

海拔

总酚

总黄酮

总单宁

ABTS

DPPH

FRAP

海拔

1

总酚

0.069

1

总黄酮

0.781

0.615

1

总单宁

0.492

0.931

0.736

1

ABTS

0.548

0.995**

0.604

0.951*

1

DPPH

0.909*

0.858

0.790

0.762

0.826

1

FRAP

0.518

0.987**

0.527

0.912*

0.983*

0.777

1

注：

*显著水平p<0.05

**极显著水平p<0.01

3.3.遗传多样性

用15对引物（图1和表5）进行扩增发现，在每个群体中，97个200bp-4200bp大小的ISSR片段共有67.8个标记物是多态性的。

而每个群体多态型标记物的百分比介于55.67％和84.54％之间，平均值为69.90％，总的Shannon指数为0.39（表5）。

我们发现在群体Kalika中大多数都有遗传多样性（PPB-84.54％，I-0.48，He-0.32）而群体Sitlakhet遗传多样性较少。

高水平的遗传多样性可能与广泛的地理分布相关，这与群体内的差异水平有较大关联（HamrickandGodt,1989）。

片状分布的蜘蛛香不仅涵盖了广泛的分布范围（Prakash,1999），此外，作为一种天然的四倍体物种和多倍体的物种，蜘蛛香还在确定更高杂合度和遗传多样性（Levin,1983;SoltisandSoltis,2000）方面有显著作用。

我们都知道，一个物种的育种系统也是其可变性的重要决定因素（LovelessandHamrick,1984）。

在这方面，需要注意的是：

V.jatamansi是异系繁殖需要借助昆虫传粉的植物，当花冠处有羽毛状的蓇葖时，种子便可通过风力的作用进行传播。

因此，这些因素在决定物种的遗传变异方面的作用也不可忽视。

基于Nei的相异系数，UPGMA系谱图指出Manjkhali和Sitlakhet群体有较低的遗传差异性（0.0270），而Katarmal和Doonagiri则有较大的遗传距离（0.1035）。

聚类分析表示分为两大组，A组包括Manjkhali，Kalika，Sitlakhet和Katarmal而B组包括Doonagiri群体（图2所示）。

Mantel试验中没有表现出（r=-1.016，P<0.01）成对群体之间遗传和地理距离的任何相关性（Mantel,1967）。

分子方差分析法显示出群体内的较高和较显著变化（99％，P<0.05）（数据未示出）。

这些结果与Rajkumar等人利用AFLP标记（2011）确立的蜘蛛香内部种群有93％多样性的结论一致。

我们认为，这种具有高水平的种群内部的遗传多样性的植物可以自花授粉也可以异花授粉，且被认为是有着时代交叠的多年生物种（Egisdottir等人，2009）。

此外，该物种的种群遗传结构受各种进化的因素，包括交配系统，基因流，种子传播，复制的方式以及自然选择的影响（HamrickandGodt,1989）。

假若蜘蛛香的性系统是雌花两性花异株的（雌雄同株和雄性不育植物可以在相同的植物群中找到），那么将发生大大自交不亲和现象（Rajkumaretal.,2011）。

表5蜘蛛香不同群体中的遗传变异情况

群体

无基因型

Np

PPB%

Ao

Ae

He

I

Katarmal

5

71

73.20

1.73

1.47

0.27

0.38

Majkhali

8

74

76.29

1.76

1.52

0.30

0.44

Kalika

5

82

84.54

1.85

1.57

0.32

0.48

Sitlakhet

7

54

55.67

1.56

1.39

0.22

0.32

Doonagiri

6

58

59.79

1.6

1.43

0.24

0.35

Mean

6.2

67.8

69.90

1.70

1．48

0.27

0.39

Np：

多肽位点数；PPB%：

多肽位点的百分比；Ao：

观察的等位基因数目；Ae,：

有效等位基因数；He：

1973年Nei的基因多样性;I：

Shannon信息指数。

表6基于或高或低的抗氧化活性蜘蛛香群体以及ISSR分子标记而做出的分子方差分析的总结

来源

自由度

平方和

方差分量

百分比变化

显著值

群体之间

1

18.314

0.306

2%

0.019

群体内部

29

456.654

15.747

98%

0.212

总和

30

474.968

16.053

100%

表7根据基因座分子方差分析作出的的内部简单重复序列（ISSR）标记和抗氧化活性之间的相关性

植物化学标记

ISSR标记

自由度

He值

F值

p值

抗氧化活性（DPPH）

HB8-5

HB12-117898B-8

30

30

30

0.433（43