八年制细胞与分子生物学实验备考BY顾豪.docx
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八年制细胞与分子生物学实验备考BY顾豪
八年制细胞与分子生物学实验备考
Part1十五个实验概要
Experiment1细胞有丝分裂
间期：
有明显的细胞核，染色质分布较均均，由于染色质易与碱性染料结合，故细胞核的染色比细胞质深。
核中可见1～3个染色较浅的呈球状的核仁
前期：
细胞核膨大，染色质逐渐螺旋化为丝状的染色丝，其后染色丝进一步缩短变粗，形成一定形态和书目的染色体（这时候的每条染色体由两条染色单体组成，但在光镜下一般不易看清），核膜、核仁逐渐消失
中期：
每条染色体中的成对染色单体逐渐分开（但着丝粒仍未分离）全部染色体（2n=16）移向细胞中央的赤道面上，形成赤道板。
在赤道板到两面有许多纺锤丝连接细胞两极和染色体的着丝点，成为纺锤体，但不易观察到，此时染色体形态最典型
后期：
着丝粒纵裂为二。
这是，每条染色体的两条染色单体已完全分开，由于纺锤丝的牵引，分别向细胞的两极移动，形成了数目相等的两组染色体（这是所观察到的染色体数目比原来增加1倍，是由于S期内DNA含量倍增的结果）
末期：
染色体移到两极并解旋为染色质，细胞中部出现细胞板，并逐渐向边缘发展。
当染色质构成核网时，核膜、核仁重新出现。
细胞板达到两边，分裂结束，形成两个子细胞，细胞又进入间期状态。
Experiment2动物染色体的制备
原理：
染色体只有在分裂期的细胞，特别是中期细胞中表现出典型形态便于观察和计数，所以必须采取特殊的技术方法，从发生有丝分裂的组织和细胞悬液中得到。
最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备。
骨髓细胞数量多、分裂旺盛，不需体外培养和无菌操作，便于取材。
秋水仙素的作用：
抑制纺锤体的形成，使细胞停留在分裂中期
KCl低渗溶液：
使细胞膨胀，促使中期染色体散开
固定液：
有固定作用，对染色体还有一定的分散作用
Giemsa染色液：
染色
结果：
低倍镜下，可见到许多大小
不等被染成紫红色呈圆形的间期细胞核以及分散在它们之间的中期分裂象。
小鼠染色体一般呈“U”形，染色体2n=40
Experiment3蟾蜍血细胞的体外融合
原理：
细胞融合又称体细胞杂交，通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程。
是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞，此杂交细胞具有很强的生命力，增殖旺盛。
细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要手段，也是制备单克隆细胞株的重要技术。
肝素：
血液抗凝
PEG溶液：
促进细胞凝集
Hanks溶液：
终止PEG作用，平衡缓冲溶液使PEG的浓度降低至诱导融合的要求。
詹纳斯绿：
染液
Experiment4AKPKm测定
原理：
在温度pH和酶浓度一定时，酶促反应初速度与底物浓度的关系满足
Km是酶的特征常数，反映了酶与特定底物的亲和力大小。
测定Km值通常用双倒数法，推导上述米-曼氏方程式可得一直线方程：
在横坐标上的截距即可算出Km值。
AKP最适pH为10，而酶蛋白最稳定pH为8，测定其Km值时反应体系选择其最适pH。
本实验取pH为10。
Experiment5葡萄糖定量方法─标准管法测定葡萄糖含量
原理：
在葡萄糖氧化酶的催化作用下β-D葡萄糖氧化成过氧化氢和葡萄糖酸，在过氧化酶的存在下，过氧化氢与苯酚、4-氨基安替比林与偶联酚缩合成可被分光光度计测定的红色醌类化合物。
其红色在510nm波长处有最大吸收峰，颜色的深浅在一定范围内与血葡萄糖浓度成正比。
结果：
人体正常血糖：
3.9～5.8mmol/L
Experiment6蛋白质定量测定方法─标准曲线法测定蛋白质含量
原理：
双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物，在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色络合物，此反应即为双缩脲反应。
含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应。
蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与铜离子络合成紫红色化合物。
其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，可以用比色法进行鉴定。
Experiment7酶联免疫吸附试验（ELISA）─双抗体夹心法
原理：
酶联免疫吸附试验是一种固相酶免疫测定的方法，目前广泛应用于各种抗原和抗体的检测。
其基本原理是将抗原或抗体固定在固相载体表面，并保持其免疫活性，再与酶标记抗体或抗原联结，并保留酶的活性，然后加入酶反应的底物，后者被酶催化变为有色产物，反应颜色的深浅可与相应抗原或抗体的量相关。
在本实验中
（1）用一直抗体包被固相载体；
（2）加入受检的标本（含待测抗原），使抗原与固相上的抗体结合；（3）加入以辣根过氧化物酶标记的已知抗体，使之与抗原结合。
标记的酶可催化底物（四甲基联苯胺）起显色反应，从而指示特异性抗原抗体反应的存在。
Experiment8血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
原理：
血清蛋白的pI都在7.5以下，在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子的形式存在，分子大小，形状也各有差异，所以在电场作用下，可在醋酸纤维薄膜上分离成A、α1、α2、β、γ五条区带。
电泳结束后，将醋酸纤维薄膜置于染色液，使蛋白质固定并染色，再脱色
结果：
A、α1、α2、β、γ
Experiment9免疫电泳与对流免疫电泳
原理：
免疫电泳是将电泳与双向琼脂扩散相结合的一种抗原分析方法。
首先根据抗原中各种蛋白质组分的电荷和分子量大小的不同，在电场作用下有不同的迁移率，从而可将抗原混合物中的各种不同组分分开，然后使其与特异性抗体进行双向扩散，发生免疫学沉淀反应。
对流免疫电泳是电泳技术与双向琼脂扩散技术相融合而形成的一种定向加速的凝胶内免疫沉淀反应。
与双向琼脂扩散技术中抗原与抗体分别向四周自由扩散不同，对流免疫电泳在凝胶中加一直流电场，抗原和抗体受到电泳和电渗两种力量的综合作用而向某一方向定向加速移动，因此可以提高灵敏度，明显缩短反应时间。
Experiment10小鼠脾单个核细胞的分离─密度梯度离心法：
原理：
本次实验根据颗粒沉降原理，将不同密度的小鼠脾脏细胞置于淋巴细胞分离液上进行水平式离心，使单个核细胞在其沉降运动中位于分离液洁面上；达到分离小鼠脾单个核细胞的目的。
已知小鼠淋巴细胞和单核细胞的密度约为1.088，而红细胞与粒细胞的密度均大于1.088。
因此，用密度为1.088±0.001的淋巴细胞分离液通过密度梯度离心方法，可从小鼠脾脏细胞分离得到单个核细胞。
而分离人单个核细胞的淋巴细胞分离液密度为1.077±0.001.
Experiment11凝胶柱层析分离鉴定蛋白质
原理：
利用交联葡聚糖凝胶G-50的凝胶过滤作用，将脲酶和胰岛素分开，以Folin-Denis反应检查流出液中的蛋白质。
此反应主要靠蛋白质中的酪氨酸和色氨酸与含磷鉬钨酸的酚试剂生成蓝色鉬蓝，蓝色深浅与蛋白质含量成正比关系。
以纳氏试剂检查脲酶活性，此反应是先将脲酶流出液分解尿素产生胺，而氨可与纳氏试剂作用生成黄色的碘代双汞胺。
脲酶试剂：
分子筛层析
结果：
先分离出脲酶，再分离出胰岛素，出现两个峰值
Experiment12DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析
原理：
聚酰胺薄膜层析是一类较特殊的吸附分配层析。
混合物随流动相通过聚酰胺薄膜时，由于被分离的物质与聚酰胺薄膜上的酰胺基团形成氢键，各种物质形成氢键能力强弱不同，决定了吸附力的差异，吸附力强展层速度较慢，吸附力弱展层速度较快，同时展层溶剂与被分离物质在聚酰胺粒子表面竞争形成氢键，选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺薄膜表面之间分配系数产生最大差异。
一般讲，易溶于展层剂的所受到的动力作用大，展层速度块，反之速度就慢。
通过各物质的吸附力和分配系数不同，使得被分离的物质在聚酰胺薄膜层析中得到分离。
结果：
聚酰胺薄膜上出现9～10个点。
Experiment13鼠肝DNA的提取和纯化
原理：
DNA是染色体的主要组成成分，是遗传的物质基础。
DNA在生物组织中往往以核蛋白的形式主要存在于细胞核中，分子量甚大，人的染色体DNA（单倍体23条染色体）平均分子量约为6×10（10）道尔顿，约相当于1.3×10（5）kb。
提取DNA最基本的要求是保持DNA大分子的完整性及纯度，避免机械张力（剪切）引起DNA分子的降解，注意对杂质及蛋白质的去除，防止细胞内存在的DNA酶对DNA的酶解。
苯酚-氯仿混合液：
使蛋白质变性，混合液分层
冰无水乙醇及70%乙醇：
乙醇吸收DNA分子周围的水分，DNA失水形成白色絮状沉淀
RNase：
降解RNA
蛋白酶K：
裂解细胞，消化蛋白质，使核蛋白解聚并使细胞内存在的DNA酶失活。
结果：
A260/A280接近1.80说明样品纯度越高。
Experiment14PCR技术检测β-actin基因
原理：
PCR的原理类似于天然DNA的复制，主要利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，模仿体内的复制过程，在附加的一对引物（人工合成的寡核苷酸片段，它与待扩增片段两条链的两段DNA序列分别互补）之间引发聚合酶反应。
DNA样品：
提供DNA合成的模板
引物：
提供3’-OH末端，特异性扩增，界定扩增范围
4种dNTP：
双链合成的原料
TaqDNA聚合酶：
5’→3’聚合，3’→5’内切
其他试剂：
Mg2+：
Taq酶活性中心需要
Tris-HCl：
提供最适pH:
6.8~7.8
KCl：
促进引物退火（使引物加到DNA链上）
明胶：
稳定酶的作用
Experiment15琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段
原理：
在pH8.0-8.3的缓冲液中，核酸分子带负电荷，向正极移动。
由于不同大小和构象的核酸分子电荷密度大致相同（忽略碱基上的部分电荷，每个核苷酸残基都带二个负电荷），因此在自由泳动时，各种核酸分子的迁移率相似，无法分开。
然而，在浓度适当的琼脂糖凝胶中，由于分子筛效应，使大小和构象不同的核酸迁移率出现差异，从而把它们分开。
溴乙锭：
染色剂（吖啶橙）
结果：
在紫外灯下可以看见220bp的荧光带出现在溴酚蓝的后面。
DNA片段的荧光强弱由DNA含量决定，而DNA的迁移率反映了DNA片段的大小。
Part1前辈考场记题
11临八细胞与分子生物学实验考试by赵志宇
一、每题6分，共30分
1、双抗体夹心法定义、操作过程、注意事项（P75）
2、聚丙烯酰胺凝胶电泳与〜等电聚焦电泳区别（P5电泳技术，P16等电）
3、小鼠脾单个核细胞的分离，离心后从上到下都是什么成份，然后一个计数的计算（P45）
4、两种核酸抽提的基本原则（纯度、完整性）如何鉴别
5、PCR原理、体系内各组分作用（P59）
二、三选二（每个5分，共10分）
1、对流免疫电泳原理（P19）
2、写2种蛋白质定量方法，就其中一种详细说明（P47〜P55蛋白质技术）
3、Ampholine（P17）、聚酰胺薄膜（P32）、秋水仙素（P92）、细胞融合中PEG（P87）的作用
BY钱芳菲
一、名解
1、免疫电泳
2、密度梯度离心法
二、实验
1、一个ELISA实验——双抗体夹心法的概念、注意事项
2、一个等电聚焦电泳实验（要求写出试剂、分离情况）
三、问题
1、Ampholine、聚酰胺薄膜、DNA提纯中SDS、EDTA的作用
2、PCR原理、反应体系中各物质作用
1、PCR原理：
该技术是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的情况下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。
DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段DNA片段来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。
在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3’-OH末端，并以此为起点，沿模板5’→3’方向延伸，合成一条新的DNA互补链。
而新合成的链又可作为下一轮反应的模板，如此循环往复，每循环一次，DNA分子数即按指数倍增（2n）。
反应体系中各物质作用：
①模板DNA：
模板。
②引物：
开始阶段结合到DNA模板的一段互补序列部位，启动DNA双链的合成。
③4种脱氧核苷酸：
原料。
④耐热的DNA聚合酶：
催化。
⑤适宜的缓冲液：
用来保持酶的活性和帮助DNA解除缠绕结构。
2、①密度梯度离心法：
用离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。
若在该溶液里加入少量大分子、细胞溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子、细胞带状物。
利用这种现象，测定蛋白质、细胞等的浮游密度，或根据其差别进行分离的一种沉降平衡法。
②注意事项：
1、注意淋巴细胞分离液与脾细胞悬液的比例，一般以1:
2~1:
3为宜。
2、注意离心温度，最适温度为18~20°C。
过低则细胞丢失，过高则细胞失活。
分离得到的单个细胞可暂时保存在10%FCS-RPMI-1640培养液中，在4°C条件下（减低细胞代谢），可保存24h。
取出时不要迅速升温，以免细胞因温度“休克”。
3、加入脾细胞悬液时应十分小心，注意保护分离液界面，切勿混淆破坏分离液密度从而影响分离效果。
4、每个吸取细胞悬液的步骤，都要注意混匀细胞。
5、做细胞活力检查时，锥兰染色后应尽快计数完毕，时间过长则细胞活力可能降低。
③设计实验分离得到CD8+细胞：
利用免疫磁珠法：
磁珠表面包被CD8抗体，放入细胞混合液中，进行抗原抗体反应，在CD8+细胞表面形成玫瑰花结，将这些细胞置于强大的磁场下，结合了磁珠的CD8+细胞就会与其他未被结合的细胞分群，具超强顺磁场的磁珠脱离磁场后立即消失磁性，这样就可以达到分离得到CD8+细胞的目的。
3、双向免疫扩散实验：
将抗原抗体分别加到琼脂凝胶板上的小孔中，使两者相互自由扩散，经一段时间后，若两者特异性结合，即在比例适当处形成可见的白色沉淀线，根据沉淀线的位置、数量、形状以及对比各沉淀时间的关系，对抗原抗体进行定性分析的一种实验方法。
4、ELISA（酶联免疫吸附实验）：
将可溶性的抗原或抗体吸附到固相载体上，并保持其免疫活性，使之结合并吸附结合抗体或抗原，通过洗涤去除未结合成分，再与酶标记的抗体或抗原结合，并保留酶的活性，然后加入酶反应的底物，后者被催化变为有色产物，根据反应颜色的深浅进行免疫反应的定性和定量的方法。
5、聚酰胺薄膜作用：
混合物随流动相通过聚酰胺薄膜时，由于被分离物质与聚酰胺薄膜上的酰胺基团形成氢键，而各种物质形成氢键的能力不同，决定了吸附力的差异，吸附力强展层速度快，反之展层速度慢，同时展层剂与被分离物质在聚酰胺粒子表面竞争形成氢键，其与被分离物质之间的分配系数的不同，也影响了不同物质的展层速度。
聚酰胺薄膜的作用就是通过不同物质和展层剂，与聚酰胺薄膜上的酰胺基团竞争形成氢键的能力不同，从而实现不同种物质的分离。
6、Ampholine的作用：
其化学本质是多氨基多羧基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。
以聚丙烯酰胺为支持物，在直流电场作用下，能从正极到负极形成一个pH逐渐升高的平滑连续而且稳定的pH梯度，当蛋白质在电场力的作用下，便会在支持物中运动到相当于自身pI的pH区域中聚合成一条狭窄的区带而停留下来，从而实现等电点不同的物质的分离。
7、DNA纯化中EDTA（乙二胺四乙酸）的作用：
络合二价金属离子，当Mg2+被络合后，细胞内释放出来的DNA酶被抑制，避免DNA的降解，同时金属离子络合后，细胞膜稳定性下降，有利于膜的裂解。
SDS的作用：
使蛋白质变性，能破坏膜蛋白的构象，使膜裂解，又能使核蛋白中的核酸与蛋白质解离，并且SDS也具有抑制DNA酶的作用。
8、免疫电泳：
将电泳与双向琼脂扩散相结合的一种抗原分析方法。
首先根据抗原中各种蛋白质组分的电荷和分子量大小的不同，在电场作用下有不同的迁移率，从而可将抗原混合物中的各种不同组分分开，然后使其与特异性抗体进行双向扩散，发生免疫学沉淀反应。
细生实验整理by徐冰聪
说明：
黑体字是实验报告上的填空和法八考试涉及到的地方
电泳：
一、血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
血清蛋白pI<7.5，在巴比妥缓冲液pH8.6中，以负离子形式存在
分出区带根据：
蛋白质的pI（决定了带电正负、带电量）、分子量
分出5条带（正极到负极）：
A、α1、α2、β、γ
氨基黑10B染色
膜条点样端近负极，点样线不碰盐桥
pI与分子量都相近的蛋白质会在一个区带中
电渗（电场中液相相对固定相的移动）：
用不带电的有色染料或有色葡萄糖点在膜中心，电泳后该点移动表示有电渗，反之则无
电场太高：
太热，使蛋白质变性，还会使水分蒸发使支持物离子浓度增加，甚至引起虹吸
二、聚丙烯酰胺凝胶等电聚胶电泳分离蛋白质
等电聚焦：
在pH梯度中，按蛋白质pI大小，在pH等于其pI的位置进行聚焦的行为
连续的pH梯度来自：
直流电场下作用的两性电解质载体Ampholine
配胶：
水，Acr,Bis，40%Ampholine，样品，10%过硫酸铵，20%TEMED
电极缓冲液：
上槽阴极0.01mol/LH3PO4，下槽阳极0.02mol/LNaOH
判断电泳结束：
电流大小接近零（电荷基本不再移动）
普通凝胶电泳和等电聚胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳与聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳）：
利用分子量分离；利用pI分离
两个pH；连续pH梯度
单磷酸化和双磷酸化的同一蛋白质成一条带；两条带（因为它们有两个pI而分子量近似）
层析：
一、凝胶柱层析
交联葡聚糖凝胶G-50的过滤作用，分离分子量48000的尿酶和5700的胰岛素
Folim-Denis反应检查流出液中的蛋白质
Folim-Denis反应：
酪氨酸、色氨酸与试剂生成兰色钼兰Mo3O6，深浅与蛋白质含量成正比
两个洗脱峰：
第一个是被完全排阻的尿酶，第二个是被部分排阻的胰岛素
蛋白质脱盐方法：
凝胶层析、透析、超滤、冷乙醇沉淀
影响分离的因素：
流速稳定、加样时不搅动胶面、不干柱、用0.1%EDTA-Na2浸泡再用少许蒸馏水洗来去除重金属离子
二、DNS——氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析
固定相：
聚酰胺，样品与其酰胺基团形成氢键，决定了吸附力，阻碍氨基酸流过
流动相（展层溶剂，使样品在聚酰胺薄膜表面之间分配系数差异最大）：
苯-冰醋酸和甲酸-水，聚酰胺表面竞争形成氢键，推动氨基酸流过固定相
DNS-氨基酸制备：
氨基酸中加DNS-Cl丙酮溶液，40度30分钟，热风吹去丙酮，酸化至pH2-3，溶于乙酸乙酯。
两个相垂直的方向层析两次，先苯-冰醋酸后甲酸-水
展层剂达到膜上缘2mm处时终止层析
Rf值：
在流动相中溶解度越大、固定相吸附力越小，Rf越大
蛋白质定量测定方法
双缩脲反应：
双缩脲在碱液中与二价铜离子生成紫红色络合物
含两个及以上肽键的化合物都有双缩脲反应，颜色深浅与浓度成正比
标准曲线法：
利用不同浓度标准液的吸光度，描点、连线，标出样品点，读出样品浓度
标准管法：
样品浓度=样品吸光度x标准管浓度/标准管吸光度
凯氏定氮法：
双缩脲法：
优点：
快，不同蛋白颜色深浅相近，干扰物较少
缺点：
灵敏度差
Folin-酚试剂法：
优点：
提高双缩脲法灵敏度
缺点：
试剂配制困难，费时，标准曲线不是严格的直线，专一性差，干扰物多
紫外吸收法（280nm）：
优点：
简便，灵敏，快速，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰
缺点：
准确度差，干扰物多（嘌呤、嘧啶、核酸）
考马斯亮蓝法：
优点：
灵敏度高，快速简便，干扰物少
缺点：
受精氨酸和芳香族氨基酸含量的影响，有少量干扰物（TritonX-100细胞骨架的观察中用到、SDS），标准曲线轻微非线性
BCA比色法：
优点：
单一试剂，终产物稳定，干扰物少
PCR
一、聚合酶链反应
用DNA聚合酶、双链DNA模板、4种dNTP、人工DNA引物，模仿体内复制过程
三十个循环，每个循环三个过程：
模板高温（95度）下变性成单链DNA；降温（58度）退火、引物互补结合上模板；聚合酶最适温度（72度）下引物延伸
反应系各成分作用：
引物：
正向、反向引物决定所要扩增的区域，为聚合酶提供3’-OH；模板：
DNA复制的模板；4种dNTP：
作为合成原料的核苷酸；Taq酶：
催化反应；镁离子：
保证酶活性；缓冲液：
提供合适的环境和pH
引物设计：
决定所要扩增的区域，为聚合酶提供3’-OH
退火温度：
Tm=2x（A+T）+4x（C+G），退火温度一般比Tm小5度
防污染：
保持实验室秩序、手套口罩帽子、小包装试剂一次性实验用品、短暂离心试剂，减少手套或移液的污染
二、逆转录PCR
RNA抽提
酸性异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法（AGPC）
异硫氰酸胍是最强的蛋白质变性剂，裂解释放RNA、同时失活RNA酶。
酸性环境对其活性有利
苯酚、氯仿是强的蛋白变性剂
酸性环境下，RNA进入上层水相，蛋白质进入下层有机相，DNA进入上下两层界面处的中间层
异丙醇使各相迅速分离
防止RNA被酶降解：
玻璃器皿高温烘烤，塑料器皿DEPC浸泡烘干；手套口罩；除Trizol所有试剂用DEPC处理；可用RNA酶抑制剂
鉴定提取的RNA的纯度、完整性：
测定样品在260、280的吸光度；电泳显示RNA是否被降解
细胞有丝分裂及细胞骨架观察
一、有丝分裂
间期：
明显的细胞核，可见核仁
前期：
核膨大，染色体开始形成，核膜、核仁逐渐消失
中期：
每条染色体的染色单体逐渐分开，着丝粒未分开，赤道板形成，纺锤体形成，染色体形态最典型
后期：
着丝粒纵裂，染色单体完全分开，由纺锤丝牵引向细胞两级移动，形成数目相等的两族染色体
末期：
染色体解旋为染色质，细胞板出现。
核膜、核仁出现。
细胞板达到细胞两边，形成两个子细胞
取距离洋葱根尖端三分之一的分生区细胞，分裂最旺盛
二、细胞骨架
细胞骨架由蛋白质丝组成的复杂网状结构，分微管、微丝、中间丝
TritonX-100能溶解细胞中的蛋白质、全部脂质，而留下细胞骨架的蛋白质
考马斯亮蓝R250染色
杀老鼠——动物染色体制备
染色体只有在分裂期的细胞，尤其是中期细胞中表现出典型形态
骨髓细胞数量多，分裂旺盛，不需体外培养、不需无菌操作，便于取材
秋水仙素能阻断纺锤体的装配，是有丝分裂停止于中期
掐死老鼠（～￣▽￣）～（颈椎脱臼法）
免疫
一、免疫电泳和对流免疫电泳
免疫电泳：
将电泳与双向琼脂扩散相结合的一种抗原分析方法
根据蛋白质电荷和分子量的不同，在电场作用下有不同的迁移率，从而将各组分分开，然后使其与特异性抗体进行双向扩散，发生免疫学沉淀反应
对流免疫电泳：
电泳技术与双向琼脂扩散技术相结合的一种定向加速的凝胶内免疫沉淀反应
在凝胶中加一直流电场，抗原抗体收到电渗和电泳两种力量的综合作用而向某一方向定向加速移动，提高灵敏度、缩短反应时间。
二、双向琼脂扩散
将抗原和抗体分别加到琼脂凝胶板上的小孔中，使两者自由扩散
一段时间后，若两者特异性结合，则在比例适当处形成可见的白色沉淀线
根据沉淀线位置、数量、形状、对比各线间的关系，对抗原或抗体进行定性分析。
检测抗体的效价
三、酶联免疫吸附法ELISA——双抗夹心
ELISA：
将抗原或抗体固定在固相载体表面，保持免疫活性，再与酶标记抗体或抗原结合，保持酶活性，加入酶反应的底物，底物被催化后可显色，颜色深浅与相应抗原或抗体的量相关
双抗夹心：
用已知抗体包被固相载体，待测物特异性结合于其上；采用辣根过氧化氢酶标记抗体；四甲基联苯胺作为底物。
其他
一、密度梯度离心法
根据颗粒沉降原理。
小鼠淋巴细胞和单核细胞密度1.088，红细胞、粒细胞大于1.088
用密度1.088±0.001的淋巴细胞分离液，通过密度梯度离心法，分离得到小鼠单个核细胞
分离人单个核细胞的淋巴细胞分离液密度为1.077±0.001
Ficoll-Hypaque分层液
细胞悬液沿管壁轻轻铺在分离液面上
应用滴管小心沿管壁四周轻轻
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