12基因工程的基本操作程序教学案.docx

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12基因工程的基本操作程序教学案

1．2基因工程的基本操作程序

备课人:

张煜第一课时

【课标要求】

1．简述基因工程基本操作程序的四个步骤

2．尝试设计某一转基因生物的研制过程。

【本节重难点】

重点：

基因工程基本操作程序的四个步骤

难点：

（1）从基因文库中获取目的基因

（2）利用PCR技术扩增目的基因

【学习过程】

预习案

1、基因工程的一般过程主要包括、、

、。

2、获取目的基因的方法包括、、

。

3、基因表达载体包括、、、

。

一、获取目的基因（目的基因的获取）

1．目的基因：

符合人们需要的，编码蛋白质的

2．原核细胞和真核细胞的基因结构

（1）原核细胞的基因结构

（2）真核细胞的基因结构

（3）原核细胞和真核细胞基因结构的比较

原核细胞

真核细胞

不同点

编码区是

编码区是间隔的、

相同点

都由能够编码蛋白质的和具有调空作用的组成的。

3．获取目的基因的方法

获取目的基因的方法通常包括从生物细胞中直接分离和人工合成（化学合成）。

（1）从基因文库中获取目的基因

①基因文库：

将含有某种生物不同基因的许多，导入受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。

基因组文库：

基因文库中包含了一种生物的基因

②种类

cDNA文库：

基因文库中包含了一种生物的基因

③基因文库的构建

基因组文库cDNA文库

从基因文库中得到目的基因的依据

依据目的基因的有关信息，例如，根据基因的、基因的、基因在染色体上的、基因的，以及基因的等特性来获取目的基因。

（2）利用PCR技术扩增目的基因

①PCR技术是在体外通过有选择的大量扩增或序列的技术，是的缩写。

通过此技术，可获得大量的目的基因。

②原理：

____________________。

，

③前提：

有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成_________。

④条件：

DNA模板、

⑤扩增过程：

a．变性（℃）：

目的基因DNA受热变性后接连为单链

b．退火（℃）：

与单链相应互补序列结合

c．延伸（℃）：

在的作用下进行延伸

Taq酶的特点是。

⑥方式：

以方式扩增，即（n为扩增循环的次数）

PCR技术与DNA复制的比较：

DNA复制

PCR技术

相同

点

原理

原料

模板

不同点

场所

解旋方式

特点

结果

（3）人工合成法

适用于基因比较，核苷酸序列又。

人工合成基因的方法有两条途径：

一是反转录法：

是以目的基因转录成的______________为模板，借助反转录酶合成碱基互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA的过程。

二是化学合成法：

是根据蛋白质的__________序列，推测出相应的__________序列，再按照_______________原则推测出其结构基因的__________序列，然后人工合成目的基因。

例1下列获取目的基因的方法中需要模板链的是（）

①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因③反转录法④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成

A．①②③④B．①②③C．②③④D．②③

注意：

获得原核细胞的目的基因可采取直接分离；获得真核细胞的目的基因一般是人工合成。

当堂检测

1．下列不属于获得目的基因的方法的是（）

A．利用DNA连接酶复制目的基因B．利用DNA聚合酶复制目的基因

C．从基因文库中获取目的基因D．利用PCR技术扩增目的基因

2．PCR技术扩增DNA，需要的条件是（）

①目的基因②ATP③四种脱氧核苷酸④DNA聚合酶等⑤mRNA⑥核糖体

A．①②③④B．②③④⑤C．①③④⑤D．①②③⑥

3．根据mRNA的信息推出获取目的基因的方法是（）

A．用DNA探针测出目的基因B．用mRNA探针测出目的基因

C．用mRNA反转录形成目的基因D．用PCR技术扩增mRNA

4．在已知某小片段基因碱基序列的情况下，获得该基因的最佳方法是（）

A．用mRNA为模板逆转录合成DNAB．以4种脱氧核苷酸为原料人工合成

C．由蛋白质的氨基酸序列推测mRNA

D．将供体DNA片段转入受体细胞中，再进一步筛选

11．资料显示，近十年来，PCR技术（DNA聚合酶链式反应技术）成为分子生物实验的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制的特性，在试管中进行DNA的人工复制（如下图），在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使分子生物实验所需的遗传物质不再受限于活的生物体。

请据图回答：

（1）加热至94℃的目的是使DNA样品中的_______键断裂，该过程在生物体细胞内是通过__________酶的作用完成的。

分析可知新合成DNA分子中A=T，C=G，这说明DNA分子的合成遵循______________________。

（2）与细胞内DNA复制相比，PCR技术所需要的DNA聚合酶的最适温度比较___________

第二课时

二、（基因表达载体的构建）——基因工程的核心

1．制备重组DNA分子的目的：

使目的基因在受体细胞中能，并且可以，同时，使目的基因能够。

2．制备重组DNA分子过程：

（1）用一定的　　切割质粒，使其出现一个切口，露出　　。

（2）用　　　　切割目的基因，使其产生　　。

（3）将切下的目的基因片段插入质粒的　　处，在加入适量　　，　　使其连接,形成重组DNA分子（重组质粒）。

3．基因表达载体=+++

（1）启动子：

是一段有特殊结构的，位于基因的，它是

识别和结合的部位，有了它才能驱动基因，最终获得所需要的蛋白质。

（2）终止子：

也是一段有特殊结构的，位于基因的，相当于一盏红色信号灯，使在所需要的地方停止下来。

（3）标记基因：

作用是为了，从而将含有目的基因的细胞出来，如基因。

思考：

只考虑两两结合，可以产生几种重组DNA分子？

例2科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。

起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。

然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子（抗虫基因首端），导人棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。

科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子（抗虫基因末端），导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。

由以上过程推知，作为目的基因的运载体应具备的结构是（）

A．目的基因、启动子B．目的基因、终止子

C．目的基因、启动子、终止子D．目的基因、启动子、终止子、标记基因

三、转化受体细胞（将目的基因导入受体细胞）

将目的基因受体细胞，并且在受体细胞内和的过程，称为转化。

常用的受体细胞有：

大肠杆菌、、、和

　　等。

转化的原理是：

借鉴细菌或病毒的途径。

1、将目的基因导入植物细胞

（1）农杆菌转化法

①农杆菌特点：

易感染植物和裸子植物，对___________植物没有感染力；Ti质粒的可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上。

②转化过程：

目的基因插人→重组Ti质粒（基因表达载体）

农杆菌→导入植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体上→目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。

（2）法：

是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。

（3）法：

这是我国科学家独创的一种方法，是一种十分简便经济的方法。

（我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的）

（4）受体细胞：

可以是--直接发育成转基因植株；也可以是

---通过植物组织培养成转基因植株。

2、将目的基因导入动物细胞

（1）方法：

注射技术。

（2）受体细胞：

---（体细胞不能表现_________）

（2）操作程序：

目的基因表达载体→取卵（受精卵）→显微注射→注射了目的基因的受精卵移植到____性动物的_________内发育→新性状动物。

3、将目的基因导入微生物细胞

（1）常用方法：

法（或）

（2）常用受体细胞：

、

（3）使用的化学药品：

------增加细胞壁的通透性。

（4）原核生物作为受体细胞的优点：

繁殖、多为、遗传物质相对较少等。

（5）操作程序：

处理大肠杆菌细胞→细胞→表达载体溶于缓冲液与感受态细胞混合→_________细胞吸收DNA分子。

例3采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是（）

①将毒素蛋白注射到棉受精卵中②将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中③将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导人细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养④将编码毒素蛋白的DNA序列，与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵

A、①②B、②③C、③④D、①④

目的基因导入不同受体细胞的比较

生物种类

植物细胞

动物细胞

微生物细胞

常用方法

受体细胞

转化过程

四、目的基因的检测与鉴定

1、分子水平检测

（1）检测转基因生物的上是否插入了目的基因

检测方法：

技术，即将转基因生物的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为，使探针与基因组DNA杂交，如果出现，就表明目的基因已插入染色体DNA中。

（2）检测目的基因是否

检测方法：

技术，即从转基因生物中提取出mRNA，用标记的目的基因作探针，与杂交提取出的mRNA杂交，如果出现，则表明目的基因转录出了mRNA。

（3）检测目的基因是否

检测方法：

，从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若有出现，表明目的基因已形成蛋白质产品。

2、个体水平鉴定

例：

用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入或摄入抗虫基因（目的基因），如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了并得到。

例4、目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。

下列属于目的基因检测和鉴定的是

①检测受体细胞是否有目的基因②检测受体细胞是否有致病基因③检测目的基因是否转录信使RNA④检测目的基因是否翻译蛋白质

A．①②③B．②③④C．①③④D．①②④

当堂检测

1．下图表示一项重要的生物技术，对图中物质a、b、c、d的描述，正确的是（）

A．a通常存在于细菌体内，目前尚未发现真核生物体内有类似的结构

B．b识别特定的核苷酸序列，并将A与T之间的氢键切开

C．c连接双链间的A和T，使黏性末端处碱基互补配对

D．若要获得真核生物的d，则一般采用人工合成方法

2．下列不属于目的基因与运载体结合过程的是（）

A．用一定的限制酶切割质粒露出黏性末端

B．用同种限制酶切割目的基因露出黏性末端

C．将切下的目的基因的片段插入到质粒切口处

D．将重组DNA导入受体细胞中进行扩增

3．下列哪项不是基因表达载体的组成成分（）

A．启动子B．终止密码子C．标记基因D．复制原点

4.在基因表达载体的构建中，所需要的酶是（）

①限制酶②DNA连接酶③解旋酶④DNA聚合酶

A．①②B．①②③C．①②④D．①②③④

基因工程练习题

1．在基因工程操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的是（）

A．人工合成目的基因B．目的基因与载体结合

C．将目的基因导入受体细胞D．目的基因的检测与鉴定

2．将目的基因导入微生物细胞之前，要用Ca2+处理细胞，处理过的细胞叫（）

A．感受态细胞B．敏感性细胞C．吸收性细胞D．接受细胞

3．农杆菌转化法转移目的基因进入受体细胞，目的基因的最终位置是（）

A．Ti质粒上B．受体细胞染色体上C．裸露细胞核中D．存在细胞质中

4．苏云金芽孢杆菌的抗虫基因导入棉花细胞是否已表达，其检测方法是

A．是否能检测到标记基因　　B．是否有抗生素抗性

C．是否能分离到目的基因　　D．是否有相应的性状

5．要检测目的基因是否成功地插入了受体DNA中，需要用基因探针，基因探针是指（）

A．用于检测疾病的医疗器械B．用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子

C．合成β-球蛋白的DNAD．合成苯丙羟化酶的DNA片段

6．下图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图。

已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。

判断下列说法正确的是

A．将重组质粒导入细菌B常用的方法是显微注射法或基因枪法

B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的细菌

C．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的就是导入了质粒A的细菌

D．目的基因成功表达的标志是受体细胞能在含有氨苄青霉素的培养基上生长

7．基因工程是DNA分子水平的操作，下列有关基因工程的叙述中，错误的是（）

A．限制酶只用于切割获取目的基因

B．载体与目的基因必须用同一种限制酶处理

C．基因工程所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶

D．带有目的基因的载体是否进入受体细胞需检测

8．（多选）用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。

下列叙述正确的是（）

A．常用相同的限制性核酸内切酶处理目的基因和质粒

B．DNA连接酶和RNA聚合酶是构建重组质粒必须的工具酶

C．可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒

D．导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达

9．（多选）我国科学家运用基因工程技术将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因导入棉花细胞并成功表达，培育出了抗虫棉。

下列叙述正确的是（）

A．基因非编码区对于抗虫基因在棉花细胞中的表达不可缺少

B．重组DNA分子中增加一个碱基对，可能导致毒蛋白的毒性丧失

C．抗虫棉的抗虫基因可通过花粉传递至近缘作物，从而造成基因污染

D．转基因棉花是否具有抗虫特性是可以通过检测棉花对抗生素抗性来确定的

10．（多选）科学家通过基因工程的方法，能使马铃薯块茎内含有人奶主要蛋白。

以下有关该基因工程的叙述，正确的是（

）

A．采用反转录的方法得到目的基因有内含子

B．基因非编码区对于目的基因在块茎中表达是不可缺少的

C．马铃薯的叶肉细胞可作为受体细胞

D．用同一种限制性内切酶，分别处理质粒和含目的基因的DNA，可产生黏性末端而形成重组DNA分子

11．酵母菌的维生素、蛋白质含量高，可作食用、药用等，是提取核苷酸、三磷酸腺苷等多种生化产品的原料，还可用于生产维生素、氨基酸等。

科学家将使啤酒产生丰富泡沫的LTPl基因植入啤酒酵母菌中，使其产生LTPl蛋白，酿出泡沫丰富的啤酒，具体的操作过程如下：

请据图回答问题：

（1）若图中LTPl基因与B结合产生的C是_____________，通常在体外完成，此过程必需有DNA限制性核酸内切酶和_____________酶。

（2）标记基因的作用是。

（3）检测LTPl基因在啤酒酵母菌中是否表达可以通__________________________。

12．下图是利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图，请据图作答。

（1）能否利用人的皮肤细胞来完成①过程？

，为什么？

。

（2）过程②必需的酶是酶，过程③必需的酶是酶。

过程⑥所用的酶是_______；过程⑦所用的酶是_______。

（3）若A中共有a个碱基对，其中鸟嘌呤有b个，则③④⑤过程连续进行4次，至少需要提供胸腺嘧啶个。

（4）在利用AB获得C的过程中，必须用切割A和B，使它们产生，再加入，才可形成C。

（5）取自大肠杆菌的物质B，其名称是______，在基因工程中起____的作用。

B上通常带有某些标记基因，其作用是_________________________________________。

（6）为使⑧更易进行，可用___________处理D，以增大其通透性。

（7）图中的B应该符合的条件为_______________________________________

________________________________。

（8）能起到B的作用的有_______________________________________________，

（9）图中的D是基因工程中的_______细胞，能作为这种细胞的有_____________

_____________等。

13．图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tetR为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。

已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。

据图回答：

（1）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有_______________、_______________、_______________三种。

若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行_______________。

（2）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。

之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是_______________；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是_______________。

（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是___________，其合成的产物是___________。

　　（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是_______________。

1．2基因工程的基本操作程序答案

AAACBDBAABCABDB7AACDABCBCD

11

（1）氢解旋碱基互补配对原则

（2）高（3）1/16（4）D

12.

（1）重组质粒DNA连接酶

（2）

（3）啤酒酵母菌能产生出泡沫丰富的啤酒

13.

（1）不能　皮肤细胞中的胰岛素基因未表达，不能形成胰岛素mRNA　

（2）逆转录酶　解旋酶限制酶　DNA连接酶

（3）

（4）同种限制酶相同的粘性末端DNA连接酶

（5）质粒　载体　便于筛选出导入了重组质粒的工程菌

（6）CaCl2　

（7）能在宿主细胞中稳定保存并复制、具标记基因、具多个限制酶切割位点　

（8）质粒、动植物病毒、λ噬菌体衍生物　

（9）受体　大肠杆菌、土壤农杆菌、酵母菌、动植物细胞