机体保护肽的固相合成分离纯化及制备研究图文精.docx
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机体保护肽的固相合成分离纯化及制备研究图文精
分类号：
——
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单位代码：
学号：
１０６９７２００３２４８０
西北大学
硕士学位论文
题目：
垫签堡堑丛鱼旦扫金盛：
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作者：
堕皇
指导教师：
学科（专业）：
答辩日期：
主竖生专业技术职务：
垡堂ｆ金盘垡生）型丝筮２００６．０６学位授予日期：
机体保护肽的固相合成、分离纯化及制备研究
摘要
本文采用Ｆｍｏｃ圃相合成技术首次合成了机体保护肽。
从树脂的活化、氨基酸的偶连率、脱保护试剂及切割试剂等方面研究了机体保护肽的合成工艺，使用半制备规格反相高效液相色谱进行了纯化，并用ＭＡＬＤＩ．ＴＯＦｍａｓｓ飞行质谱仪对合成产物进行了分析，建立了完整的实验室和半制备规模的机体保护肽合成一纯化工艺路线。
在优化的半制备规模的机体保护肽合成一纯化工艺路线中，与理论产量相比，纯度为９９％的机体保护肽纯品的最终收率为３６．５％。
论文包括以下四个部分：
１．文献综述：
简述了多肽固相合成技术，并对主要的多肽分离纯化与鉴定技术进行了介绍，最后概述了生物活性肽类药物的应用情况与研究展望。
２．采用Ｆｍｏｃ固相合成法，使用Ｗａｎｇ树脂与２一Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ树脂两种树脂合成机体保护肽，比较了两种树脂的合成效果。
通过对树脂的活化、氨基酸的偶连率、脱保护试剂及切割试剂等合成条件的研究优化了合成工艺，并对机体保护肽的合成规模进行了放大。
合成的多肽经过ＭＡＬＤＩ．ＴＯＦｎｌａｓｓ鉴定表明正确无误。
３．使用反相高效液相色谱对两种树脂合成的机体保护肽粗品进行了分析，比较了分析结果。
之后对合成粗品进行了分离纯化，优化了分离纯化条件，最后进行了半制备规模的纯化，并使用反相液相色谱及ＭＡＬＤＩ．ＴＯＦｍａｓｓ对纯化产品进行了纯度检测。
４．总结了实验的结果与意义，对今后的实验工作进行了展望。
关键词：
固相合成，机体保护肽，反相高效液相色谱，ＭＡＤＩ．ＴＯＦｍａｓｓ，制备
ＳｔｕｄｉｅｓｏｎＳｏｌｉｄ—ＰｈａｓｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄ
ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＯｒｇａｎｉｃＡｓｓｉｓｔａｎｔＰｅｐｔｉｄｅ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｉｎｔｈｉｓｔｈｅｓｉｓ，ＯｒｇａｎｉｃＡｓｓｉｓｔａｎｔＰｅｐｔｉｄｅ（ＯＡＰ）ｗｅｒｅｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄａｔｆｉｒｓｔｔｉｍｅｂｙＦｍｏｃ—ｓｏｌｉｄ—ｐｈａｓｅｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｕｎｄｅｒｖａｒｉｏｕｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓａｓｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｒａｔｅ，ＤｅｂｌｏｃｋａｎｄＣｌｅａｖａｇｅｗａｓｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｐｅｐｔｉｄｅｗａｓｓｅｐａｒａｔｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙｓｅｍｉ—ｐｒｅｐａｒａｔｉｎｇＲＰ—ＨＰＬＣ．ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｂｙＭＡＤＩ－ＴＯＦｍａｓｓ．ＴｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＯＡＰｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｆｉｎａｌｌｙ．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ＯＡＰｏｆｐｕｆｆｔｙ９９％Ｃａｎｂｅｏｂｔａｉｎｅｄｉｎｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆ３６．５％ｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｖａｌｕｅ．
Ｔｌｌｅｔｈｅｓｉｓｉｎｃｌｕｄｅｓｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｆｏｕｒｐａｒｔｓ：
１．Ａｔｆｉｒｓｔ．ｔｈｅｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｋｎｏｗｌｅｄｇｅｏｆｐｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｗａｓｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ．ＴｈｅｎｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐｌｅｏｆｐｅｐｔｉｄｅａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＷａｓｒｅｆｅｒｒｅｄ．ＡｔｌａｓｔｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｓｐｅｃｔｏｆＢｉｏａｅｔｉｖｅｐｅｐｔｉｄｅＷａｓａｌｓｏｂｒｉｅｆｌｙｒｅｖｉｅｗｅｄ，
２．ＴｈｅＯＡＰＷａｓｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｂｙＦｍｏｃｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅｍｅｔｈｏｄ．Ｗａｎｇｒｅｓｉｎａｎｄ２－Ｃｈｌｏｒｏ仃ｉｔｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅｒｅｓｉｎｗｅｒｅｂｏｔｈｕｓｅｄｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．ｔｈｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｗａｓｃｏｍｐａｒｅｄ．Ｔｈｒｏｕ曲ｔｈｅｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｕｎｄｅｒｖａｒｉｏｕｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＣ０ｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅｂｅｓｔｓｙｎｔｈｅｓｉｓｒｅｓｕｌｔｗａｓａｃｈｉｅｖｅｄ．Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉ吐ｔｏｆｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｐｅｐｆｉｄｅｓＷａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｏｂｅｃｏｒｒｅｃｔｂｙＭＡＬＤＩ—ＴＯＦｍａｓｓａｎａｌｙｓｉｓ．３．Ｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ０ＡＰｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｂｙｔｗｏｒｅｓｉｎｗｅｒｅｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｗｉｔｈｒｅｖｅｒｓｅｄ—ｐｈａｓｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｔｈｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．Ｔｈｅｓｅｍｉ—ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｂｙＲＰ—ＨＰＬＣｗａｓｔｒｉｅｄ．ＴｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙＲＰ—ＨＰＬＣａｎｄＭＡＬＤＩ—ＴＯＦｍａｓｓ．
４．Ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｒｅｓｕｌｔｓａｎｄｓｅｎｓｅｗｅｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ．Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇｗｏｒｋｉｎｇｓｃｈｅｄｕｌｅｗａｓｌｉｓｔｅｄ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：
Ｓｏｌｉｄ—ＰｈａｓｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＯｒｇａｎｉｃＡｓｓｉｓｔａｎｔＰｅｐｔｉｄｅ，ＲＰ—ＨＰＬＣＭＡＤＩ—ＴＯＦｍａｓｓ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
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西北大学学位论文知识产权声明书８９３６６６
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学位论文作者签名：
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己矿“年占月，善日’∥移∥蝉咖版竿细西北大学学位论文独创性声明
本人声明：
所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究上作及取得的研究成果。
据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。
与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。
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学位论文作者签名：
“年占月，（）日幽，互
第一章文献综述
１．１固相多肽合成简介
１９６３年，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ［１】提出固相合成多肽的思想Ⅲ，经过４０多年的完善和发展，现在固相多肽合成技术已经成为多肽合成中的一种常规技术，Ｍｅｒｒｉｅｆｉｅｌｄ本人也因为在固相多肽合成中所作出的突出贡献而在１９８４年荣获了诺贝尔化学奖（ＮｏｂｅｌＰｒｉｚｅｉｎＣｈｅｍｉＳｔｒｙ）。
２０世纪９０年代，在固相多肽合成的基础上发展起来的组合化学（ＣｏｍｂｉｎａｔａｒｙＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）［３］更成为目前药物筛选中最热门的方法。
１１．１固相多肽合成技术
固相多肽合成有三种方式：
固定羧基端，即由Ｃ端向Ｎ端合成；固定氨基端，即由Ｎ端向Ｃ端合成（４】；固定侧链基团的双向合成‘５１。
但自Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ开始，得到广泛应用的仍然是第一种合成方式，既由Ｃ端向Ｎ端合成。
其合成基本过程：
先将所要合成肽链的Ｃ端氨基酸的羧基以共价键的形式同固相合成树脂相连，然后以结合在树脂上的氨基酸的氨基作为反应活性位点，与下一个氨基酸的羧基反应生成肽键，接长肽链。
重复（缩台、洗涤、去保护、中和和洗涤、下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上切割下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。
固相多肽合成包括：
氨基酸保护策略、固相合成树脂以及肽键缩合试剂三个关键部分。
１）氨基酸保护基‘６】
固相多肽合成中一般需要将ａ．氨基以及侧链活性基团保护起来。
目前使用比较多的ａ一氨基保护基为：
叔丁氧羰基（Ｂｏｃ）和９．芴甲氧羰基（Ｆｍｏｃ）两种。
Ｂｏｃ基团需要反复采用５０％的三氟乙酸（ＴＦＡ）来脱除，肽树脂切割一般采用氢氟酸（ＨＦ），对环境以及实验设备都有较高的要求，而Ｆｍｏｃ基团可以使用哌啶轻易地脱除，切割采用ＴＦＡ，与Ｂｏｃ法相比，具有反应条件温和、合成效率高以及切割条件温和等优点，逐渐取代了Ｂｏｃ基团而成为目前固相多肽合成的首选。
一
氨基保护基。
表１．１ＦＭＯＣ保护氨基酸侧链保护基团
－ｆａｂｌｅ１－１Ｓｉｄｅ－ＣｈａｉｎＰｒｏｔｅｃｔｉｎｇＧｒｏｕｐｆｏｒＦｍｏｃＡｍｉｎｏＡｃｉｄ
在常用的１８种氨基酸中需要保护的氨基酸有１２种，这些需要保护的基团包括：
羟基、巯基、氨基、羧基、酰胺基、胍基以及咪唑基。
侧链上这些基团的保护原则是：
采用同一类型的保护基，这样在相同的条件下可以同时脱除所有的保护基。
Ｆｍｏｃ策略中各种氨基酸的侧链活性基团及其保护基见表１．１。
２）固相多肽合成中固相合成树脂
固相多肽合成树脂一般由两个部分组成：
高分子载体、间隔手臂（１ｉｎｋ）。
用于固相多肽合成的高分子载体通常有两类［７］＝聚苯乙烯一二乙烯苯交联树脂（ＰＳ）与聚乙烯一乙二醇类树脂（ＰＥＧ—ＰＳ）及衍生物。
这些高分子载体需要满足几个条件：
具有一定的机械强度、在多肽合成溶剂中具有好的溶胀性能以及切割过程中保持稳定。
间隔手臂一般需要满足下面几个条件：
容易和高分子载体连接、具有至少一个反应活性位点、在合成过程中稳定以及能够在特定条件下定量切割下来而不影响所合成多肽的稳定性。
目前使用最多的高分子载体的交联度为１－２％，因为在这样的交联度下，树脂机械强度高且溶胀性能好。
Ｐｓ树脂具有价格便宜，担载量高，它的主要缺点就是在水、乙醇等氢键试剂（ｐｒｏｔｉｃｓｏｌｖｅｎｔｓ）中溶胀性低。
ＰＥＧ－ＰＳ树脂具有反应速度快，在大多数溶剂中都具有很好的溶胀性能等优点，主要缺点是价格昂贵、担载量低、机械稳定性能差，在激烈搅拌的合成过程中容易导致物质从树脂上流失。
树脂根据其导入的间隔手臂可分为：
氯甲基树脂、羟基树脂、氨基树脂等。
树脂的选择和合成多肽的序列以及所采用的合成策略紧密相关，关于各种树脂的特点及应用，许多多肽厂商都有很详细的介绍。
３）固相多肽合成肽键缩合试剂
一个好的肽键缩合试剂应满足下面几个要求：
溶解性好、连接效率高、性质稳定、消旋率低、低毒及来源广泛等。
现在使用的高效缩合试剂大都为苯并杂环化合物的酰塞化衍生物。
图卜１给出的就是两类苯并三唑及其衍生物［８】：
ＨＯＢｔ（１－羟基一苯并一三氮唑）和ＨＯＡｒ（卜羟基一吡啶并一三氮唑）。
这两种化合物通常作为碳二亚胺型肽键缩合试剂的添加试剂，用于避免消旋化及提高多肽缩合效率。
二》＼。
Ｈ
ＨＯＢｔ双：
＞ＨＯＡｔ＼。
Ｈ
图卜１１～羟基一苯并一三氮唑与卜羟基一毗啶并一三氮唑的结构
Ｆｉｇｕｒｅ１－１ＳｌｎｌｃｌｕｒｅｏｆＨＯＢｔａｎｄＨＯＡｔ
目前使用较多的高效肽键缩合试剂通常以ＨＯＡｔ和ＨＯＢｔ为基础，在卜羟基上引入活性反应基团。
根据连接键可分为：
Ｏ．Ｃ和Ｏ—Ｐ键，多形成六氟磷酸盐的形
式［９１。
图１．２给出几种具有代表性的高效肽键缩合试剂的化学结构。
ＮＮ，ｋ．ＰＦ６ｅ旺及Ｎ－涎－．ＰＦ宇
ＨＢＴＵｕ
一。
珠鼢阡、…
．
图１．２几种高效肽键缩台试剂的结构
Ｆｉｇ．１－２Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｅｆｆｉｃｉｅｎｔｃｏｕｐｌｉｎｇｒｅａｇｅｎｔｓ
由于ＰｙＢＯＰ和ＢＯＰ毒性太大，相对来说使用较少。
新型高效肽键缩合试剂仍然是目前多肽合成研究领域中的一个热点，同样，每年各多肽公司都会推出更加高效的肽键缩合试剂。
如２００２年，ＰｅｐｔｉｄｅｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．公司推出了ＨＣＴＵ【１０】，结构见图１．３。
与现有的肽键缩合试剂相比，它具有合成简单、稳定、低毒、高效以及消旋率低等优点。
＼Ｄ－
图１－３ＨＣＴＵ的结构
ＦｉｇｕｒｅＩ一３ＳｔｕｒｃｔｕｒｅｏｆＨＣＴＵ
１．１．２固相多肽合成中连接效率检测方法
尽管目前固相多肽合成方法已经相当成熟，但是在合成某些位阻大的氨基酸、疏水性大的肽段以及合成长肽时，仍然会面临合成中肽键缩合效率低而出现缺肽或肽合成终止等问题，这同时也是目前固相多肽合成中的一个难点。
因此，在合成过程中及时确定肽键缩合效率对指导多肽合成具有重要意义，现在，大多是通过检测树脂上氨基的量来判断连接效率，自２０世纪５０年代以来，人们已经发现并使用了多种氨基检测方法，根据检浏目的：
石】＝以分为定性检测和定量检测两种：
１）定性检测方法
定性检测方法一般是通过颜色反应来完成的，通过加入的物质与树脂上的氨基反应生成有色物质连接到树脂上，这样可以通过观察树脂表面颜色变化来判断。
这些方法包括Ｋａｉｓｅｒ法（茚三酮法）【１３】、三硝基苯磺酸（ＴＮＢＳＡ）法【１ｌ】、溴芬兰法㈦等。
用茚三酮颜色反应可以快速测定树脂上的氨基，从而判定酰化反应是否完全。
用茚三酮法检测聚苯乙烯树脂氨基的敏感性可达到５ｎｍｏｌ氨基，ｇ树脂。
这个敏感性已可以检测出缩合反应是否进行了９９％以上，是目前使用最为广泛的氨基酸定性检测方法。
２）定量检测方法
定量检测方法可以通过检测树脂上的氨基的量，检测氨基的方法有：
Ｋａｉｓｅｒ法（茚三酮法）［１３１、苦昧酸澍１４１、离子选择电极法（高氯酸）［１鄂、萘醛法㈣、水杨醛法［１７】等。
各种检测方法各有优缺点，其中苦昧酸法不但能和伯胺反应也可以和仲胺反应，反应特异性很差；Ｋａｉｓｅｒ法对如Ｐｒｏ等氨基酸的检测灵敏度低，现象不明显，另外，在Ｋａｉｓｅｒ法中需要使用ＫＣＮ，毒性高，反应温度高（１ＩＯ。
Ｃ），实际中操作困难：
水杨醛检测方法使用也比较广泛。
但是，用以上检测方法，对于长的肽链，由于每步接肽的效率不可能都达到１００％，因此定量检测就显得相当困难，目前仍没有一种合适的方法去解决。
１．１．３影响固祖多肽合成效率的０一折叠现象及解决方法
固相多肽合成虽然过程简单，但在合成中也经常遇到连接效率低的问题。
ＮＭＲ和ＦＴＩＲ研究表明台成中连接效率低与合成中多肽分子产生Ｓ折叠直接相关１１８～１９１。
为解决这一问题，可采用如下方法：
１）在ＤＭＦ、ＮＭＰ等反应溶剂体系中加入ＤＭＳＯ等极ｌ生溶剂可以减少合成中肽链的折叠；２）在反应溶剂中加入溴化锂、氯化铜【２２屯３１等解构剂‘２∞１１（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃｓａｌｔｓ）；３）通过使用Ｎａ－Ｆｍｏｃ－Ｎ“（２一Ｆｍｏｃ－ｈｙｄｒｏｘｙ一４一ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）衍生物可逆保护氨基酸酰胺Ｎ原予来避免聚集，在肽链合成中每隔６．８个氨基酸采用酰胺Ｎ原子保护可以避免Ｂ折叠结构形成［２４１；４）在肽链中引入类脯氨酸（ｐｓｅｕｄｏｐｒｏｌｉｎｅ），因为类脯氨酸残基可以干扰分子间的１３折叠结构形成【２５】：
５）通过加入冰乙酸调节反应体系中的ｐＨ值到６－７，干扰肽链间氢键的生成，提高缩合效率口６１；６）使用低担载量的树脂可以减少合成肽链聚集作用，从而减少０折叠生成。
另外，使用聚酰胺树脂，因为其结构与肽链相近，能减少发生折叠的可能性，特别适用于长肽的合成。
１．１．４固相多肽合成中新技术的应用
尽管固相多肽合成具有优越性，但是由于其合成的非均相性，所以仍然存在许多问题，如非线性动力学、反应慢、溶胀性问题以及合成中固相载体的降解等。
其中有些问题还相当突出，如合成较长的肽链时反应时间特别长，因此，任何能够进一步提高反应速率，减少反应时间的技术就成为目前固相多肽合成的又～个新的关注点，特别是微波技术是目前的研究热点。
微波是频率约在３００ＭＨｚ一３００ＧＨｚ，即波长在１００ｃｍ至０．１ｃｍ范围内的电磁波。
它位于电磁波谱的红外辐射（光波）和无线电波之间。
１９８６年Ｇｅｄｙｅ及其同事研究了微波酯化反应，使微波技术作为一种新技术在有机合成中应用，是微波有机合成化学开始的标志口＿７】。
在以后的十几年内微波有机合成化学发展成为一门新兴交叉学科～ＭＯＲＥ化学（Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ—ｉｎｄｕｃｅｄＯｒｇａｎｉｃＲｅａｃｔｉｏｎｓＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）即微波促进有机化学，也叫微波诱导催化有机反应化学。
与传统加热相比，微波加热可使反应速率大大加快，甚至可以提高上千倍，同时由于产生的微波等离子体中常
可存在热力学方法得不到的高能态原子、分子和离子，因而可使一些热力学上不可能发生的反应得以发生。
９２０世纪８０年代出现密闭式的专门微波有机合成装置以来，微波合成装置的功能得到了很大的改进，促进了微波在有机合成中的应用。
微波反应除了具有一般的加热作用，还可以通过分子活性基团吸收微波能量，提高反应活性。
此外，微波还有一种称为“分子搅拌”的作用。
有文献报道［２８】采用普通微波炉提高固相多肽合成中的肽键缩合效率。
中国台湾大学的于辉明【２川等人也采用普通微波炉改造的微波反应装置，以ＤＭＦ为反应溶剂，采用Ｔ，Ｇｔｙ—ＨＭＰ树脂作为固相合成载体，Ｆｍｏｃ一氨基酸的ＨＯＢｔ活泼酯为原料合成了ＡＣＰ６５—７４，并将合成结果与ＡＢｌ４３３Ａ多肽合成仪的合成结果进行比较，结果表明采用微波固相合成得率为７９．Ｏ％，而ＡＢｌ４３３Ａ多肽合成仪的合成得率为６９．４％，而且微波合成中未发现有消旋产物，反应中体系的温度可以通过调整微波功率来控制。
１．２多肽的分离纯化与鉴定
１．２．１多肽的分离纯化方法
液相色谱法是生物技术中分离纯化的一种重要方法，在多肽分离纯化中显示出优异的性能。
近年来，液相色谱法已成为分离纯化蛋白质多肽最有效的方法之一【３０】。
在多肽的纯化领域中，常用的色谱分离技术主要有排阻色谱、离子交换色谱和反相色谱【３”。
１）排阻色谱（ＳｉｚｅＥｘｃｌｕｓｉｏｎＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＳＥＣ）
是一种纯粹按照溶质分子在流动相溶剂中的体积大小分离的色谱法。
填料有一定范围的孔尺寸，大分子进不去而先流出色谱柱，小分子后流出。
在用水系统作为流动相的情况下，又称为凝胶过滤色谱（ＧＦＣ）。
在使用有机物为流动相时为凝胶渗透色谱（ＧＰＣ）。
２）离子交换色谱（ＩｏｎＥｘｃｈａｎｇｅＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＩＥｅ）
是基于多肽和离子交换剂之间的静电作用，导致介质表面的可交换离子与带相同电荷的多肽分子发生交换。
其保留次序取决于配体和蛋白质多肷问的静电作用
力，ＩＥＣ含盐的缓冲流动相系统有利于增加其活性回收率。
其固定相基体主要是亲水共聚物。
３）反相色谱（ＲｅｖｅｒｓｅｄＰｈａｓｅＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＲＰＬＣ）
是基于溶质、极性流动相和非极性固定相表面问的非选择性作用力特征所建立的一种色谱模式。
在生物大分子的ＲＰＬＣ条件下，流动相多采用酸性的、低离子强度的有机溶剂一水溶液。
常用固定相为硅胶烷基键合相，除此而外，还有多孔固定相口２１，苯乙烯型共聚微球‘？
１填料，氧化铝、氧化锆等作为基质的涂层填料［３４４０１。
以上三种方法的独自使用或者其中两种、三种的联合使用，已经成为分离多肽的必备手段。
李默漪㈤等经一步ＴｓＫ纯化，得到了纯度为９７．７％的入胰岛素原ｃ肽，收率为５８．２％；俞超Ｈ２ｌ等在纯化胸腺素Ⅱｌ时，使用了一步离子交换色谱，所收集样脱盐纯化后即得纯度为９６％的产品；Ｌｊｅｖａｋｏｖｉｃ［４３１等采用凝胶过滤色谱
ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一２５和离予交换色谱ＳＰ—ＳｅｐｈａｄｅｘＣ一２５，对合成的肽聚糖单体衍生物进行了分离纯化；李ｊＩ顼子ｔ４４１等应用反相高效制备液相色谱法，对５种合成的蜂毒肽类似物进行了分离制备。
张鹏飞【４５】等使用离子交换和反相色谱联用的方法分离纯化了大疣蛛毒素－－＇４Ｉ。
１．２．２多肽的鉴定
在进行多肽合成研究的同时，发展出来了各种多肽分析鉴定办法用来检验合成多肽的正确与否，几种主要方法如下：
１）质谱分析（ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．ＭＳ）
多年来质谱分析被认为是测定小分子分子量最准确、最灵敏的方法。
近年来离子化的技术及仪器方面取得了突破性的进展，使质谱所能测定的分子量大大超出了ｌＯｋ道尔顿。
为此，“软”离子化技术、基质辅助的激光解吸／离子化（ＭＡＬＤＩ）和电喷雾离子化（ＥＳＩ）显得尤其有前途。
这些技术的准确性、灵敏度及分辨力使得测定多肽、蛋白质和其它生物多聚体成为可能。
通过液相色谱一离子阱质谱联用（如ＬＣＱ）、串联质谱技术（ＭＳ／ＭＳ）和源后衰减基质辅助的激光解哪离子化（ｐｏｓｔ．ｓｏｕｒｃｅｄｅｃａｙｍａｔｒｉｘ—ａｓｓｉｓｔｅｄｌａｓｅｒｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ，ＰＳＤ—ＭＡＬＤＩ—ＭＳ），人们便可以从质
谱分析中获得肽及蛋白质的结构信息㈣。
２）ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳
ＳＤＳ电泳技术首先由Ｓｈａｐ拍建立，由ｗｅｂｅｒ和０ｓｂｏｍ进一步完善［４”。
它是蛋白质和多肽分析中常用的手段，可用来估算样品的分子量和纯度。
目前常用的ＳＤＳ电泳对分子量小于１０ＫＤ的多肽分子来说都没有足够的分离效果。
在电泳过程中，由于小分子多肽与ＳＤＳ所形成的“团块”（ｂｕｌｋ）难以分开，导致此复合物难以进入分离胶，染色后形成‘‘条纹’’（ｓｔｒｅａｋ）。
ＧｅｇｇｅＨ８１通过在凝胶中加入尿素、增加浓，缩胶的浓度来改善分离效果，但这又给后续的染色带来困难。
ＨｅＩＴｎ蛐Ｓｃｈａｇｇｅｒ等Ｍ提出用ｔｒｉｃｉｎｅ代替甘氨酸作为电泳缓冲液中的尾随离子，同时降低凝胶中双丙烯酰胺的比例，对小分子多肽的电泳取得了很好的效果。
３）其他分析方法
除上述方法之外，氨基酸组成分析、氨基酸序列分析、取、ｕＶ光谱、圆二色谱、生物活性鉴定、放射性同位素标记和免疫学等方法都已应用于多肽类物质分析、鉴定。
１．３生物活性肽类药物
１．３．１生物活性肽概述
生物活性肽（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｅｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＢＡＰｓ）是指能够调节生物机体的生命活动或具有某些生理活性作用的一类肽的总称。
这些生物活性肽多以非活性状态存在于蛋白质长链中，当被酶解成适当的长度时，它们的活性就会表现出来。
从生物学角度讲，肽链长度少于１０个氨基酸的称为寡肽，超过ｌＯ个氨基酸的称为多肽，氨基酸和多肽统称为生物活性肽，氨基酸为５０个以上的称为蛋白质。
近年来，生物活性肽渐渐被人们所认识，随着分子生物学、生物化学技术的飞速发展，人们发现存在于生物体内的多肽已有数万种，它们时刻发挥着不同的生理功效。
肽是涉及生物体内多种细胞功能的生物活性物质。
生物体内已经发现、定性了几百种多肽，它们是机体完成各种复杂的生理活动所必不可少的参与者。
在自然界
所有细胞都能合成多肽物质，其细胞功能活动也受多肽的调节控带ｌＪ［４９１。
例如，物质代谢、激素分泌、神经、细胞生长及繁殖等所有生命活动的领域，其主要作用机制是调节体内各个系统器官及细胞的各类生命活动，调节激活体内的有关酶类，保障代谢途径的畅通，或通过控帝ｉ］ＤＮＡ的转录或通过控制蛋白质的翻译而影响特殊功能的蛋白质合成，最终产生特定的生理效应或发挥其药理作用。
１．３．２生物活性肽类药物的功能特性
生物活性肽作为药物具有其独特的优点：
首先，分子量小，无免疫原性，比较安全：
其次，结构相对简单，功能较明确，特异、副作用小；第三，分子小，易于合成，结构易于改造，生产成本低；第四，多肽药物易于从多途径吸收，因此给药途径可多样化（如：
口服、喷雾、透皮吸收等）；第五，合成的多肽纯度较高，不存在热源问题【５０】。
正因为如此，国内外对多肽药物的研究特别重视。
目前已有数十种多肽药物上市（如：
降钙素、奥曲肽、催产素等），有３０余种多肽药物已在进行临床研究。
这些多肽药物被用于抗肿瘤、抗病毒、疫苗及增强造血功能等众多领域。
１．３．３生物活性肽类药物的分类
生物活性肽类药物习惯上常指多肽类激素，依据生物活性肽类药物的作用和分泌部位分为：
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