谷氨酸菌体蛋白的酶解条件优化图文精.docx
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谷氨酸菌体蛋白的酶解条件优化图文精
2011No.2SerialNo.227
ChinaBrewing
味精产业是我国食品行业中的重要支柱产业之一,目前我国共有味精厂200家左右,
年产味精约110×104t,每生产1t味精可从发酵液中提取干菌体200kg~250kg,其菌体蛋白质含量为70%左右,因此每年可以产生废弃的菌体蛋白22×104t[1]。
谷氨酸菌体是一种单细胞蛋白,目前我国味精厂的发酵废液中含有大量的谷氨酸菌体,许多工厂将其直接排放,既造成严重的环境污染又浪费了大量的蛋白质。
许多国外的味精厂则是将谷氨酸菌体回收作为饲料蛋白。
据报道,近年来日本及其美国消费的调味品中,蛋白质水解物因其丰富的氨基酸含量和较高的营养价值,实测消费量已相当于甚至超过味精的消费量。
在我国,
这方面的消费目前不是很多,但随着人们生活水平的提高,蛋白质水解物将会有广阔的市场[2]。
目前对谷氨酸菌体蛋白进行水解的方法主要有化学和酶法。
化学方法虽然简单,
但反应要求条件高,污染严重,因而很受限制[3];酶法水解是利用蛋白酶水解蛋白质,反应条件温和,能耗低,副反应少,应用较为广泛。
试验利用复合蛋白酶法水解谷氨酸菌体蛋白,获得复合氨基酸水解液。
1材料与方法1.1材料与试剂
谷氨酸菌体浓缩液:
莲花味精厂提供。
酸性蛋白酶、β-葡聚糖酶均购自天津市诺奥科技发展有限公司。
1.2仪器与设备
XMTB型恒温水浴锅:
天津市中环实验电炉有限公司;
FA2004型分析天平:
上海精密科学仪器有限公司;pHSJ-4A型实验室pH计:
上海精密科学仪器有限公司;DH-101型电热恒温鼓风干燥箱:
天津市中环实验电炉有限公司。
1.3方法
1.3.1菌体预处理
将谷氨酸菌体经水洗离心3次后,调配成20%左右的菌体悬浮液,经高压匀浆机70MPa匀浆6次,再将破碎后的菌体调配成不同浓度的悬浮液进行酶解试验。
1.3.2蛋白水解度
蛋白水解度=NN2
×100%式中:
N1为水解后生成的氨基酸态氮;N2为投入的样品总氮。
1.3.3氨基酸态氮的测定采用甲醛滴定法[4]。
1.3.4总氮的测定
采用凯氏定氮法[5]。
2结果与讨论
2.1酶解单因素试验
2.1.1酶解时间对蛋白水解度的影响
时间对菌体蛋白水解率的影响见图1。
时间与水解进行程度密切相关,反应时间短,水解不充分;反应时间长,
水解液易腐败。
水解开始后,
蛋白质的水解度随时间的延长而增加,随着水解的进行酶促反应速度逐渐减慢,从而使水解率变得平缓甚至会下降。
一般认为酶反应时间越长,水解越充分,但考虑到工艺可行性,节省能耗,试验控
谷氨酸菌体蛋白的酶解条件优化
周大伟,肖冬光*,郭学武,吕鸿雁,杜丽平
（工业微生物教育部重点实验室,天津市工业微生物重点实验室,天津科技大学生物工程学院,天津300457
摘要:
采用响应面法对谷氨酸菌体蛋白的酶解条件进行优化,以蛋白水解度为参考指标,确定最佳酶解工艺为酸性蛋白酶与β-葡
聚糖酶的添加比例为3∶1,总加酶量为2%（相对于底物,pH值为4.0,水解温度50℃,底物浓度15%,水解时间10h,在上述条件下,蛋白水解度达到18.01%。
关键词:
谷氨酸菌体;酶解;响应面中图分类号:
TQ920.9
文献标识码:
A
文章编号:
0254-5071（201102-0128-03
OptimizationoftheenzymatichydrolysisofcellproteinofCorynebacteriaglutamicacid
ZHOUDawei,XIAODongguang*,GUOXuewu,LVHongyan,DULiping
（KeyLabofIndustrialMicrobiologyofMinistryofEducation,TianjinIndustrialMicrobiologyKeyLab,CollegeofBiotechnology,
TianjinUniversityofScienceandTechnology,Tianjin300457,China
Abstract:
Usinghydrolysisofproteinasreference,enzymatichydrolysisofcellproteinofCorynebacteriaglutamicacidwasoptimizedwithPlackett-Burmandesign.Theresultsshowedthatoptimumconditionswereasfollows:
ratiosofacidicproteaseandβ-glucanase3:
1,totaladditionofenzymes2%,temperature50℃,pHvalue4.0,concentrationofsubstrate15%andhydrolysis10h.Undertheseconditions,thehydrolysisdegreeofproteinreached18.01%.
Keywords:
Corynebacteriaglutamicacid;enzymatichydrolysis;responsesurface
收稿日期:
2010-10-28
作者简介:
周大伟（1985-,男,辽宁朝阳人,在读硕士研究生,研究方向为发酵工程;肖冬光*,教授,通讯作者。
ResearchReport
128··
中国酿造2011年第2期总第227期
制酶解反应时间为10h。
2.1.2pH值对蛋白水解度的影响
pH值对蛋白水解度的影响见图2。
酶促反应结果随溶液pH值的改变而发生变化,每一酶促反应均存在一个最适宜作用pH值,在低于最适pH值时,蛋白质水解度随pH值的增大而提高,当达到最适pH值后,随pH值的增大,水解度反而下降,由图2可看出,当pH值为4时,酶解效果最好。
2.1.3酶的添加比例对蛋白水解度的影响
酶的添加比例对蛋白水解度的影响见图3。
从图3可得出,蛋白质水解度随着酸性蛋白酶与β-葡聚糖酶的添加比例的增加而增加,当加酶比为3∶1时蛋白的水解度最高。
2.1.4总加酶量对蛋白水解度的影响
总加酶量对蛋白水解的影响见图4。
由图4得出,蛋白质水解度随着加量酶的增大而提高,这是因为酶加量的增大提高了酶对底物的作用能力,由此可引起水解度的提高,当酶加量增大到一定数值时,蛋白质分子对酶的需求量达到饱和,酶不再是提高蛋白质水解率的限制性因素,所以水解率随着酶加量的增大变得平缓。
考虑生产成本等因素,选择加酶量2%比较合适。
2.1.5底物浓度对蛋白水解度的影响
底物浓度对蛋白水解度的影响见图5。
底物浓度是影响蛋白质水解的重要因素,加水量的多少直接影响酶与蛋白质互相作用的机率,也影响互相作用的传质速度。
加水量少,溶液的黏度大,将影响传质过程的进行,水解不彻底,适当增大加水量,虽然蛋白质-酶之间的互相作用机会减少,但加快了传质过程,降低了体系的黏度,有助于酶解,蛋白质水解度也提高了。
产物浓度过低难以浓缩,不利于生产。
试验控制最大底物浓度为15%。
2.1.6温度对蛋白水解度的影响
温度对蛋白水解度的影响见图6。
在保持酶活力情况
研究报告
图1时间对蛋白水解度的影响
Figure1.Effectoftimeonhydrolysisdegreeofcellprotein
图2pH值对蛋白水解度的影响
Figure2.EffectofpHvalueonhydrolysisdegreeofcellprotein
图3酶添加比例对蛋白水解度的影响
Figure3.Effectofadditionratioofenzymesonhydrolysisdegreeofcellprotein
图4酶的添加总量对蛋白水解度的影响
Figure4.Effectoftotaladditionofenzymesonhydrolysisdegreeofcellprotein
图5底物浓度对蛋白水解度的影响
Figure5.Effectofconcentrationofsubstrateonhydrolysisdegreeofcellprotein
图6温度对蛋白水解度的影响
Figure6.Effectoftemperatureonhydrolysisdegreeofcellprotein129··
2011No.2SerialNo.227
ChinaBrewing
下,蛋白质水解率随温度升高而升高,达最高峰后,继续升高温度,酶活力开始减小,酶解速度迅速下降,蛋白质水解率随之下降。
图6表明,温度为50℃时,水解度最高。
2.2响应面优化试验
根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理,进行4因素3水平的响应面分析试验,以pH值、底物浓度、酸性蛋白酶与葡聚糖酶的添加比例和水解温度4个重要因素为自变量,各因素编码水平见表1;试验结果见表2;方差分析见表3。
27个试验点可以分为2类,其一是析因点,自变量取值在X1、X2、X3、X4所构成的三维顶点,共有24个析因点;其二是零点,为区域的中心点,零点试验重复3次,用以估计试验误差。
从方差分析（表3可以看出,模型在α=0.01水平上回归
显著;失拟项反映的是试验数据与模型不相符的情况,p=
0.1121>0.1,
失拟不显著,因此模型选择正确。
同时,在模型各参数中,除X3、X1X2、X1X3、X1X4、X2X3、X2X4、X3X4对蛋白水解度无显著影响外,其他各项对响应值均有较显著的影响（可信度大于90。
模型可信度分析表4中复相关系数的平方R2=94.92%,说明模型可以解释94.92%试验所得蛋白水解度的变化,表明方程拟合较好。
CV（YI的变异系数表示试验的精确度,CV值越高,试验的可靠性越低,试验中CV=6.615353%,较低,说明试验操作可信。
综上说明回归方程程给蛋白水解提供了一个合适的模型。
以蛋白水解度为响应值,利用statistica软件,对Box-hehnken试验结果进行二次多项回归拟合,获得多元二次回归方程:
Y1=16.52333+0.438333X1+3.400833X2+0.330833X3-0.508333X4-2.305417X1X1-0.225X1X2+0.0475X1X3+0.1525X1X4-1.974167X2X2-0.115X2X3+0.4525X2X4-0.819167X3X3-0.065X3X4-1.235417X4X4
变量名称水平
-101X1pH值
3.54.04.5X2浓度/（g·100mL-151015X3酶的添加比例2:
13:
14:
1X4水解温度/℃
45
50
55
表1
Box-Behnken试验因素水平
Table1.FactorsandlevelsofBox-Behnkentest表2
Box-Behnken试验结果Table2.ResultsofBox-Behnkentest
试验号X1X2X3X4水解度/%1-1-1008.432-110014.2631-1009.884110014.81500-1-114.21600-1113.877001-114.408001113.809-100-112.8310-100112.0611100-113.3112100113.15130-1-108.96140-11010.221501-1017.1816011017.9817-10-1013.1218-101013.921910-1013.8720101014.86210-10-111.85220-1018.8323010-117.9824010116.7725000016.4826000016.2427
16.85
表3
响应面优化试验结果方差分析Table3.VarianceanalysisofRSMresultX1
12.3056332.3056332.8036680.119892X21138.788138.788168.76730.0001X311.3134081.3134081.5971150.230312X413.1008333.1008333.7706370.076004X1X1128.3463828.3463834.469420.0001X1X210.20250.20250.2462420.628698X1X310.0090250.0090250.0109740.918298X1X410.0930250.0930250.1131190.742429X2X2120.7857820.7857825.275670.000295X2X310.05290.05290.0643270.804077X2X410.8190250.8190250.9959410.337994X3X313.5788483.5788484.3519070.058979X3X410.01690.01690.0205510.888389X4X418.1400238.1400239.8983310.008435Model14184.482213.177316.02370.0001（Linear4145.507936.3769744.234680.0001（Quadratic437.780999.44524811.485490.000454（CrossProduct
61.1933750.1988960.2418590.953643Error129.8683580.822363（Lackoffit109.6794920.96794910.25008
0.1121
（PureError
20.1888670.094433
Total
26
194.3506
方差来源自由度总偏差平方和平均偏差平方和FPr>F表4
模型的可信度分析Table4.Reliabilityanalysisofmodels
MasterModel
平均值0.906842复相关系数R294.92%校正后的R289.00%变异系数CV
6.615353
ResearchReport
130··
中国酿造
2011年第2期总第227期对回归模型求一阶偏导,并令其等于零,通过曲面的岭嵴分析可知,X1,X2,X3,X4的编码值分别为（0.053495,0.848196,0.145967,-0.05094,即pH值,底物浓度,酶的添加比例和酶解温度的最佳条件为pH值为4.0,底物浓度15%,酸性蛋白酶与β-葡聚糖酶的添加比例为3∶1,加酶量为2%,水解温度50℃。
此时,响应值Y达到最大值,即蛋白的水解度最大,为18.01%。
在优化条件下重复试验3次,蛋白水解度分别为17.88、18.15、17.98,与理论值相近,从而验证了模型的正确性。
3结论
试验以酶解时间、加酶量、酶的添加比例、酶解温度以及酶解的pH值为因子,以蛋白水解度为响应值,采用响应
面分析法得到回归方程,通过响应面中心组合试验,得到酶解谷氨酸菌体蛋白的最佳工艺:
酸性蛋白酶与β-葡聚糖酶的添加比例为3∶1,总加酶量为2%,pH值为4.0,水解温度50℃,底物浓度15%,水解时间10h,在上述条件下,蛋白水解度为18.01%。
参考文献:
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中国轻工业出版社,2008.[3]赵胜年.酶法水解鲜牛骨骼的研究[J].食品科学,
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华南理工大学硕士论文,1999.[5]王宪泽.生物化学实验技术原理和方法[M].北京:
中国农业出版社,2002.
我国在明朝就开始利用红曲霉培制红曲。
红曲可用于酿酒、
制醋,也可作为豆腐乳的着色剂。
红曲霉的代谢产物凝乳酶是干酪生产中所需要的一种重要酶,主要作用是能凝结牛乳,同时凝乳酶对干酪的构形成及干酪特有风味的形成有非常重要的作用。
凝乳酶来源广泛,目前国际市场上凝乳酶中动物来源的约占70%,微生物来源的占30%,植物来源的不到1%。
传统的凝乳酶来源于吃乳的小牛皱胃（第4胃
中提取的皱胃酶,随着干酪工业的发展,小牛皱胃酶已出现世界性短缺。
为缓和小牛皱胃酶供应的紧张状况,科学家们寻找其代用品,利用微生物生产凝乳酶是目前最有前途的发展方向。
本研究利用红曲霉生产凝乳酶,并对其进行脱色试验。
1材料与方法1.1试验材料
红曲霉发酵液、粉末活性炭、颗粒活性炭、硅胶、硅藻
土、
D941、DM825、DM1180、LK1120、脱脂奶粉（完达山、0.01mol/L的氯化钙溶液、3%的盐酸溶液、5%的氢氧化钠溶液。
1.2试验仪器
722型紫外分光光度计:
上海天普分析仪器有限公司;离心机:
长沙英泰仪器有限公司;pH计:
上海诚宁环保科
技有限公司;恒温水浴锅、
电子天平、分析天平、量筒、移液管、
烧杯、玻璃棒、滴管等。
1.3试验方法1.3.1色度的测定
以蒸馏水为空白,在特定波长处,测定样品脱色前后的吸光度值。
脱色率公式:
脱色率=（A0-A1/A0×100%
式中:
A0和A1分别为脱色前后滤液的吸光度值。
1.3.2酶活的测定方法[1]
红曲霉发酵产物的脱色
任慧贤,王成忠*,张代国
（山东轻工业学院食品与生物工程学院,山东济南250353
摘要:
以脱色率和酶活损失率为指标,研究了8种脱色剂对红曲霉发酵液脱色的影响,最终选择了硅胶。
通过单因素和正交试验对
其脱色条件进行优化。
关键词:
红曲霉;凝乳酶;脱色剂;硅胶中图分类号:
TS201.3
文献标识码:
A
文章编号:
0254-5071（201102-0131-03
DecolorizationofMonascusfermentionproducts
RENHuixian,WANGChengzhong*,ZHANGDaiguo
（CollegeofFoodandBioengineering,ShandongInstituteofLightIndustry,Jinan250353,China
Abstract:
Usingdecolorizationrateandenzymeactivitylossrateasindicators,theeffectsofeightdecoloringagentsonthedecolorizationofMonascusfermernationbrothwerestudied,basedonwhichthesilicagelwaschoseforfurtherstudies.Thedecolorizationconditionsofsilicagelwereoptimizedbysinglefactorandorthogonaltests.
Keywords:
Monascus;rennet;decoloringagent;silicagel
收稿日期:
2010-11-01
作者简介:
任慧贤,（1985-,女,山东济宁人,硕士研究生;王成忠*,教授,通讯作者,主要从事食品资源开发教学与科研工作。
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研究报告
131
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