白芨组织培养实施方法.docx

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白芨组织培养实施方法

白及组织培养实施方案

一、白及简介

白及为兰科白及属多年生草本植物，又名甘根、连及草、地螺丝、羊角七、皲口药、利知子、刀口药、鱼眼兰等。

分布在中国、日本以及缅甸北部，主产于贵州、四川、湖南、湖北、安徽、河南、浙江、陕西等地。

其味苦、甘、涩，性凉，归肺、胃、肝经。

以块茎供药用，能收敛止血，消肿生肌；治肺结核咳血，支气管扩张咯血、胃溃疡吐血、尿血、便血等症。

外用治外伤出血、烧烫伤、手足皲裂等症。

块茎含黏液质和淀粉等，可作糊料，在生物医药、保健食品、纺织印染、特种涂料和日用化工等方面有巨大的商业利用价值。

又因白及为地生兰的一种，花开艳丽，被作为庭院、居

室及园林景观绿化苗木大量应用。

白及一般生于海拔110――3200m的山野、山谷较潮湿处或林下半遮阴地带，喜温暖、稍阴湿的环境，耐阴性强，忌强光直射，需排水良好、富含腐殖质的砂质土壤，稍耐寒，冬季可在地下越冬。

白及能产生大量的种子（每个蒴果10〜30万粒），但这些种子没有胚乳，自然萌发率极低，繁殖困难，但白及胚的薄壁细胞贮存大量的蛋白质、油脂和碳水化合物，可作为种子萌发的营养成分，因此白及种子在保湿的情况下可以萌发，是兰科植物中种子易萌发的类型。

传统的白及繁殖方法大多以分株为主，即将块茎分成小块种植，但繁殖系数低，大面积发展对种源消耗大，不宜推广且难以满足市场需求。

采用白及组织培养可在短时间内大量获取种苗，且成本相对较低，是提高白及产量的强有力措施。

目前，国内研究资料报道的白及组织培养方法各异，所采用的外植体各不相同，且培养基及其中所加的植物生长调节剂种类和规格也千差万别。

二、白及组织培养技术路线

参照植物组织组织培养获得再生植株的方式，可通过4种途径获得白及再生植株：

一是由愈伤组织形成不定芽再生植株；二是愈伤组织产生胚状体而再生植株；三是由侧芽或顶芽再生植株；四是由茎尖产生原球茎而再生植株。

4种方式各有利弊，传统认为采用侧芽或顶芽发育途径获得的后代性状较稳定，但因为白及原球茎带有大量共生菌，组培过程中容易出现污染。

结合卢氏当地实际，探索采用白及无菌播种的技术路线，通过不同浓度和培方的培养基实现白及组织培养的最佳技术路线，建立白及快繁体系。

白及组织培养完整的技术路线如下：

经过试验优化后的技术路线为：

白及一种子（采集优质种源蒴果）—表面消毒一无菌播种（MS培养基等）—原球茎（分化诱导）一白及小苗（分株、扩繁）-壮苗生根（炼苗）-完整小植株一炼苗20-25天一移栽一白及

精心整理

三、实验准备:

种子：

白及的蒴果中有大量的种子，并且蒴果的消毒较方便，污染率低。

另一方面用种子作为外植体操作较容易，并且组培过程中萌发率高，培养的幼苗生长较为迅速，因此，种子作为外植

体应用比较广泛，大部分的组培研究都选用种子。

本实验选取卢氏本地优质白及

（Bletillastriata（Thunb.）Reichb.f.）蒴果，采收时间为8月下旬至9月中旬，此时间段胚龄大约为第8周至第22周。

器材：

高压灭菌锅、超净工作台、电子分析天平（精度为千分之一）、电磁炉、接种消毒器、高效能培养架、医用小推车、日光灯、加湿器、紫外灯、晾瓶架、酸度计（或PH试纸）、试管、

容量瓶、胶头滴管、试剂瓶、烧杯、试管架、量筒、玻璃漏斗、移液管、三角瓶、广口培养瓶、称量纸、毛刷、洗耳球、塑料筐、无菌脱脂棉、无菌滤纸、酒精灯、喷壶、橡胶手套、医用白大褂、紫外灯、镊子、接种针、剪刀、解剖刀、器械架、接种托盘等。

（1）通用器械

1烧杯：

用来盛放、溶解化学药剂等。

常用的规格有50mL100mL250mL500mL1000mL

2烘箱：

用来烘干器械。

3恒温水浴：

用来溶解琼脂等物质。

4玻璃搅拌棒：

用来配制培养基。

5洗耳球：

用来辅助吸取、转移少量液体。

6冰箱：

用来贮存化学药剂、植物材料等。

7牛角勺：

用来转移化学药剂。

8玻璃漏斗：

用来过滤溶液。

9剪刀：

用来修剪外植体或剪切嫩茎。

10器械架：

在无菌操作期间用来放置灭菌的器械。

（2）各种盛具

1搪瓷浅盘：

用来承载各种器械容器。

2塑料盆：

用于清洗培养容器。

3铁丝筐：

用来盛放灭菌容器等物品。

4纯水水桶：

用来存放去离子水或蒸馏水。

常用的规格有10L、20L。

5塑料桶：

用来存放洗涤溶液、废弃溶液。

6各种规格的磨砂玻璃瓶：

用来盛放培养母液，以及各种植物生长物质。

（3）计量器械

1量筒：

用来量取一定体积的液体。

常用的规格有25mL50mL100mL500mL1000mL

2容量瓶：

用来配制标准溶液。

常用的规格有50mL100mL500mL1000mL

3大肚移液管：

用来吸取定量溶液。

常用的规格有1mL5mL10mL

4刻度移液管：

用来吸取定量植物生长物质溶液。

常用的规格有1mL5mL10mL或可用移液

器替换）o

5移液管架：

用来放置、固定移液管。

6酸度计：

用来检测培养基的pH

7药物天平：

用来称取配制培养基的药品。

8分析天平：

用来称取少量有化学试剂，进行化学分析。

（4）灭菌器械

1磨砂口玻璃瓶：

用来对植物材料进行表面灭菌。

2酒精灯：

用来进行接种器材的表面灭菌。

3细菌过滤器：

用来过滤不能进行高温灭菌的试剂溶液。

4无菌滤纸：

用来汲取器材、植物材料表面的水分。

5无菌脱脂棉：

用来进行器械、植物材料表面的灭菌处理。

6高压灭菌锅：

对培养基、接种器材进行灭菌处理。

7紫外线灭菌灯：

用来对接种室、培养室、操作室等工作环境进行灭菌处理。

（5）接种器械

1超净工作台：

用来过滤通过接种工作台面的空气，以便进行无菌操作。

2小型喷雾器：

装载灭菌药液，来给超净工作台等处喷雾灭菌。

3钝头镊子：

在接种操作、继代培养时移取植物材料。

4尖头镊子：

用来分离植物材料。

5解剖刀：

用来切割植物材料。

6接种针：

用来转移细胞团、愈伤组织。

（6）培养器械

1试管：

用来作为外植体的培养容器。

常用的规格有2cmX15cm3cmX15cm

2培养皿：

用来作为外植体的培养容器。

常用的规格有直径9cm12cm

3锥形瓶：

即三角烧瓶，主要作为培养器材，常用的规格有50mL100mL

4铝箔：

用于培养容器封口。

5橡皮筋：

用来束紧培养容器的封口材料。

6空调：

用来调节操作间、培养室的温度。

药剂：

硝酸铵（NH4NO3、硝酸钾（KNO3、氯化钙（CaCI2）、硫酸镁（MgS04?

7H2O磷酸二氢钾（KH2PO）、碘化钾（KI）、硼酸（H3BO3、硫酸锰（MnSO4?

5H2O硫酸锌（ZnSO4?

7H2）、钼酸钠（Na2MoO）硫酸铜（CuSO4?

5H2O氯化钻（CoCI2?

6H2O、乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA?

2H2O硫酸亚铁（FeSO4?

7H2）、甘氨酸（C2H5NO2、肌醇（C6H12O）、烟酸（VB5、盐酸吡哆醇（VB6、盐酸硫胺素（VB1）、6-苄基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA、腺嘌呤（AD、赤霉酸（CA3、蔗糖、琼脂

环境：

采用组培快繁技术进行白及的工厂化生产，包括外植体的筛选及获取、外植体灭菌诱导

培养、无菌材料繁殖、继代扩繁、单株生根、出瓶炼苗、移栽等工艺程序。

由于组培苗生产从进瓶到出瓶都是在无菌条件下完成，所以离不开一个无菌环境，但实验室的规模大小需依据生产规模来确定。

组培实验室具体设计包括：

1、准备室：

（1）进行药品、器具和实验材料的保存、消毒以及培养基的配制、灭菌、分装等。

（2）器具的洗涤、干燥、消毒、储藏。

（3）生理生化指标的测定等。

2、接种室：

进行材料的接种，内置超净工作台，加装紫外线灯灭菌。

外设缓冲间放置拖鞋、工作服、工作帽等。

3、培养室：

开展白及幼苗的无菌生长提供场所，室内需要有培养架及控制温度、湿度、光照的各种设备。

四、实验流程

1.准备阶段

查阅相关文献，结合实际制订白及组织培养实施方案，根据实验方案配制实验所需的消毒剂和各类母液，确定不同培养阶段培养基配方。

MS培养基与其它培养基的基本成分相比，硝酸盐、钾和铵的含量高，有较高的无机盐浓度，无机养分的数量和比例比较合适，足以满足植物细胞在营养上和生理上的需要，对保证组织生长所

需的矿质营养和加速愈伤组织的生长十分有利。

MS固体培养基可用来诱导愈伤组织，或用于胚、

茎段、茎尖及花药培养，是目前普遍使用的培养基。

白及组培选取的培养基即为MS培养基。

配制

培养基可分为以下几步：

（1）制备母液

为了避免每次配制培养基都要对几十种化学药品进行称量，应该将培养基中的各种成分，按原量10倍、100倍或1000倍称量，配成母液。

这样，每次配制培养基时，取其总量的1/10、1/100、1/1000,加以稀释，即成培养液。

MS培养基主要包含5种主要成分：

大量元素：

大量元素包括硝酸铵等用量较大的几种化合物。

制备时，按表中排列的顺序，以其10倍的用量，分别称出并进行溶解，以后按顺序混在一起，最后加蒸馏水，使其总量达到1L,此

即大量元素母液。

微量元素：

因用量少，为称量方便和精确起见，应配成100倍或1000倍的母液。

配制时，每

种化合物的量加大100倍或1000倍，逐次溶解并混在一起，制成微量元素母液。

铁盐：

铁盐要单独配制。

由硫酸亚铁（FeSO4・7H2O）5.57g和乙二胺四乙酸二钠

（Na—EDTA）7.45g溶于1L水中配成。

每配1L培养基，加铁盐5mL

有机物质：

主要指氨基酸和维生素类物质。

它们都是分别称量，分别配成所需的浓度（0.1〜

1.0mg/mL），用时按培养基配方中要求的量分别加入。

植物激素：

最常用的有生长素和细胞分裂素。

这类物质使用浓度很低，一般为0.01〜10mg/L。

可按用量的100倍或1000倍配制母液，配制时要单个称量，分别贮藏。

配制植物生长素时，应先按要求浓度称好药品，置于小烧杯或容量瓶中，用1mol/L氢氧化钠溶解，再加蒸馏水稀释至所需

浓度。

配制细胞分裂素时，应先用少量1mol/L的盐酸溶解，然后加蒸馏水至所需量。

以上各种混合液（母液）或单独配制药品，均应放入冰箱中保存，以免变质、长霉。

至于蔗糖、琼脂等，可按配方中要求，随称随用。

（2）配制培养基的具体操作

1根据配方要求，用量筒或移液管从每种母液中分别取出所需的用量，放入同一烧杯中，并用粗天平称取蔗糖、琼脂放在一边备用。

2将①中称好的琼脂加蒸馏水300〜400mL加热并不断搅拌，直至煮沸溶解呈透明状，再停止加热。

3将①中所取的各种物质（包括蔗糖），加入煮好的琼脂中，再加水至L，搅拌均匀，配成培养基。

4用1mol/L的氢氧化钠或盐酸，滴入③中的培养基里，每次只滴几滴，滴后搅拌均匀，并用

PH试纸（或酸度计）测其PH值，直到将培养基的PH值调到5.8-6.0。

5将配好的培养基，分装到组培瓶中，盖好瓶盖并做好标记，瓶中培养基的量约为20-25mL。

培养基的成分比较复杂，为避免配制时忙乱而将一些成分漏掉，可以准备一份配制培养基的成分单，将培养基的全部成分和用量填写清楚。

配制时，按表列内容顺序，按项按量称取，就不会出现差错。

（3）培养基的灭菌与保存

培养基配制完毕后，应立即灭菌。

培养基通常应在高压蒸汽灭菌锅内，在压力0.1-0.15Mpa、

温度122C条件下，灭菌15—20min。

期间需排出灭菌锅内的冷空气，具体操作方法为：

通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出冷空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。

灭菌后的组培瓶取出后整齐摆放在室内，2h后即可冷却凝固成白色半透明状固体，经过灭菌的培养基要在配制后的一周内使用完，在多数情况下，应在火菌后两周内用完。

2.外植体选择与消毒

选择合适的部位作为外植体，采回后