生物技术毕业论文之红掌组培快繁过程中污染原因的分析及对策探讨.docx

生物技术毕业论文之红掌组培快繁过程中污染原因的分析及对策探讨.docx

《生物技术毕业论文之红掌组培快繁过程中污染原因的分析及对策探讨.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物技术毕业论文之红掌组培快繁过程中污染原因的分析及对策探讨.docx（18页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

生物技术毕业论文之红掌组培快繁过程中污染原因的分析及对策探讨

高等教育自学考试

毕业设计（论文）说明书

农学（本科）

市地洛阳

准考证号

姓名

河南科技大学高等教育自学考试办公室

高等教育自学考试

毕业设计（论文）任务书

一、题目：

红掌组培快繁过程中污染原因的分析及对策探讨

二、本环节自2009年6月30日起至20010年6月30日

三、进行地点：

河南科技大学四、内容要求：

综述简练完整，有见解；立论正确，论述充分，结论严谨合理，实验正确，分析处理科学；文字通顺，技术用语准确，符号统一，编号齐全，书写工整规范，图表完备、整洁、正确；论文结果有应用价值。

指导教师：

职称

批准日期：

年月日

红掌组培快繁过程中污染原因的分析及对策探讨

摘要

红掌（拉丁名：

Spathiphyllumfloribundum），亦叫安祖花，红鹤芋等，天南星科火烛属。

其花色艳丽，花茎挺拔，叶型翠绿美观，是当今世界著名的切花和盆栽花卉之一，市场潜力大，具有极高的观赏价值和经济价值。

红掌的繁殖方法通常采用分株繁殖、扦插繁殖和组织培养繁殖。

但分株繁殖、扦插繁殖很难满足当前市场的需求，组织培养是红掌快速繁殖的有效途径。

由于组织培养中经常出现不同程度的污染问题，造成很大的损失，因此控制污染是植物组织培养苗工厂化生产中重要的技术环节。

本文从灭菌方法、内源性污染、继代培养中污染防治等方面，进行了红掌组培快繁过程中污染原因的分析及对策的探讨。

关键词：

红掌，组织培养，灭菌，污染，防治

Andraeanumduringtissuecultureanalysisofthecausesofpollutionandrelatedcountermeasures

ABSTRACT

Anthurium,alsocalledAndrewFlower,linessuchasflamingo,aFireAraceae.Itsbrightcolors,tallandstraightstem,greenleaf-typeappearance,arewell-knownintoday'sworldofcutandpottedflowers,onelargemarketpotential,withhighornamentalvalueandeconomicvalue.Flowerandraeanumbreedingmethodscommonlyusedrametspropagation,cuttingpropagationandtissueculturepropagation.However,rametspropagation,cuttingpropagationisdifficulttomeetcurrentmarketdemand,tissuecultureandraeanumFlowerExpressareaneffectivewayofbreeding.Tissueculturebecauseofthefrequentoccurrenceofvariousdegreesofpollution,resultingingreatloss,socontrolofpollutionareindustrialplanttissueculturevaccineproductiontechnologyintheimportantaspect.Thisarticlefromthesterilizationmethod,endogenouspollutionsubcultureinsuchareasaspollutionprevention,todiscusshowtominimizetheemergenceoftissueinthepollutionproblems.

KEYWORDS:

Anthurium，tissueculture，sterilization，pollution，preventionandtreatment

目　录

前　言1

第1章培养基的灭菌2

1.1一般培养基的灭菌2

1.2不耐热物质的灭菌2

第2章外植体材料的消毒与灭菌4

2.1外植体的消毒与灭菌4

第3章接种前的准备工作5

3.1器皿、工具的灭菌5

3.1.1器皿与金属器械的灭菌5

3.1.2布质制品的灭菌5

3.2培养室的灭菌5

3.3无菌操作和无菌操作技术5

第4章红掌诱导与继代培养过程中的污染7

第5章污染的原因和预防措施8

5.1通常污染8

5.2内源性污染8

5.3污染原因判断及污染苗抢救8

5.4预防方法和措施9

5.4.1基本方法9

5.4.2经常检查消毒锅的灭菌质量9

5.4.3检查培养容器是否存在问题10

5.4.4继代培养中污染的控制10

5.4.5减少培养基中的有机成分10

结　论11

谢辞12

参考文献13

附　录15

外文资料翻译18

前　言

红掌（拉丁名：

Spathiphyllumfloribundum），天南星科火烛属，原产地哥伦比亚。

其花色艳丽，花茎挺拔，叶型翠绿美观，是当今世界著名的切花和盆栽花卉之一，市场潜力大，具有极高的观赏价值和经济价值。

其繁殖方法通常采用分株繁殖、扦插繁殖和组织培养繁殖。

但分株繁殖、扦插繁殖很难满足当前市场的需求，组织培养是安祖花快速繁殖的有效途径。

植物组织培养中经常会出现不同程度的污染问题，污染是在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。

它是影响植物组织培养的一个重要因素，它通常会导致培养失败造成很大的损失。

植物组培苗的工厂化生产在我国发展速度很快，组织培养技术日趋完善，但在组织培养中通常会出现不同程度的污染，因此预防和控制污染是植物组织培养苗工厂化生产中重要的技术环节。

在植物组织培养过程中，存在两种类型的污染：

一类是通常所说的污染，即外植体消毒不彻底，无菌操作和培养过程中，如：

培养基、接种工具、接种室消毒不严格或操作不规范而导致的污染；另一类是内源菌污染，内源菌包括真菌和细菌，内源污染一般是指内源细菌所致的污染。

本文从一般的污染的控制、内源性污染的控制、继代培养中污染防治、减少培养基中的有机成分等方面，讨论了怎样减少组培中出现的污染问题，如：

对于一般的污染来说，主要从操作环境、操作人员、仪器；对于内源性污染主要是从外植体预处理到外植体灭菌方法；对于继代培养污染的控制主要是从对无菌外植体进行检验和反复进行茎尖培养或分生组织培养；至于对培养基有机成分的减少措施主要是减去培养基中的VB1、VB6或除去培养基中的蔗糖这几方面加以论述。

第1章培养基的灭菌

1.1一般培养基的灭菌

培养基是在有菌的环境中配制的，在该过程中会使培养基带有各种杂菌，因此，每次培养基配制完毕和分装后应尽快灭菌，否则培养基中就会滋生各种杂菌，改变培养基的营养成分和pH值，影响培养效果。

常用灭菌方法是用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，将培养基置于高压灭菌锅中，从达到要求温度的时刻算起，在0.105Mpa的压力下（121。

C）灭菌15-40min。

灭菌的时间取决于温度，而不是直接取决于压力。

由于容器的体积不同，瓶壁的厚度不同，所需灭菌时间也不同[1]（表1-1），对经过高压灭菌后不会变质的物品，如无菌水、培养皿、器械等，可延长灭菌时间和增加压力。

培养基灭菌时间不能过长，否则容易引起培养基中营养成分的损失，并且琼脂也会随灭菌时间的延长，凝固能力下降，甚至不能凝固。

因此，所需的灭菌时间应随着要进行灭菌的物体体积而变化。

表1-1培养基高压蒸汽灭菌所必须的最少时间

容器的体积（ml）在121。

C下灭菌所必须的最少时间（min）

20-5015

75-15020

250-50025

100030

150035

200040

当灭菌锅里的热溶液冷却时，必须十分小心，如果压力下降过急，超过了温度下降的速率，就会使液体滚沸，从培养容器之中溢出。

另外，只有当高压锅的压力表指针回到零时，才能打开灭菌锅。

1.2不耐热物质的灭菌

某些生长调节物质（GA3、Zt、IAA、IBA）、尿素以及某些维生素等不耐热的物质遇热易分解，不能进行高压蒸汽灭菌处理，通常只能采用单独液体过滤灭菌方法。

热分解化合物溶液的灭菌是通过过滤膜进行过滤灭菌的，然后将其加入经过高压灭菌过的并未凝固的培养基中。

如果是制备固态培养基，方法是先将没有不耐热物质而包含其他化合物的培养基倒入培养瓶中进行高压蒸汽灭菌，灭菌后置于超净工作台上冷却。

当其冷却至45。

C左右（即琼脂凝固温度），琼脂将要凝固之前，加入经过滤灭菌的各项不耐热成分的溶液，然后混匀放置，待冷凉凝固后备用，但不能在琼脂培养基温度较高时加入，以防止不耐热物质的分解[2]。

第2章外植体材料的消毒与灭菌

2.1外植体的消毒与灭菌

1、用红掌茎尖作外植体时，要尽量选取带菌少的材料，如果室外栽培的材料污染太严重，可先将植物样本挖出，改为室内盆栽，喷布杀虫剂和杀菌剂，不便移栽的，可套塑料袋，待长出新枝条后，再行采样接种。

2、对污染严重的外植体，可以在培养基中加入杀菌剂。

也可在菌类长入组织内部时，除去韧皮组织，只接种内部的分生组织可防止材料带菌。

3、外植体消毒常用药剂有：

70%～75%的酒精，0.3%～0.6%的次氯酸钠溶液和0.1%的升汞溶液等。

选用何种灭菌剂和灭菌时间根据不同情况及操作者的经验来掌握，既要求将外植体表面的微生物彻底杀死，又要求尽可能少伤害外植体组织和表层细胞。

先用75%的酒精棉花擦拭外植体材料再使用消毒药剂常能取得较好的消毒效果[3]。

常用消毒剂的消毒效果比较见表2-1:

表2-1常用消毒剂的消毒效果比较

消毒剂

使用浓度（%）去除难易消毒时间（min）效果

次氯酸钙9～10易5～30很好

次氯酸钠2易5～30很好

漂白粉饱和溶液易5～30很好

过氧化氢10～12最易5～15好

升汞0.1～1较难20～30好

酒精70～75易几秒至几分钟好

抗菌素4～5（mg/L）中30～60较好

第3章接种前的准备工作

3.1器皿、工具的灭菌

3.1.1器皿与金属器械的灭菌

1、玻璃器皿的灭菌

可采用湿热灭菌法，即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌器中进行高温高压灭菌，灭菌时间可长到25～30min。

也可采用干热灭菌法，即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌；还可以把玻璃器皿放入水中煮沸灭菌[4]。

2、金属器械的灭菌

一般用火焰灭菌法，即把金属器械放在95%的酒精中浸一下，然后放在火焰上灼烧灭菌。

这一步在无菌操作中有要反复进行。

3.1.2布质制品的灭菌

工作人员使用的工作服、帽子、口罩等，要经常保持干净，并定期进行消毒。

采用湿热灭菌法，即将洗净晾干的布质品放人高压灭菌器中在压力0.11～0.12Mpa，温度121℃下灭菌20～30min[5]。

3.2培养室的灭菌

每次接种前应对接种室的地面进行清洁卫生工作，并用75%的酒精喷雾使空气中的灰尘沉降，并用紫外灯照射20～30min。

接种前工作台面要用新洁尔灭或75%酒精擦洗,使用超净工作台对接种环境污染的控制更有成效。

但它应置放在洁净的房间，窗户密封，并定期清洗过滤膜，以延长使用寿命。

培养室的相对湿度应控制在70%左右，相对湿度太高可以用抽湿机除湿。

接种结束后，应进行地面清洁卫生工作，即先打扫一遍，再用湿布擦过，并定期用甲醛熏蒸接种室。

3.3无菌操作和无菌操作技术

植物组织培养是一种无菌技术，因此不仅要求整个操作过程，一切用具、材料、培养基、培养室、工作人员的衣物都要无菌，而且要求工作人员在操作过程中要遵守无菌操作的规程，如少有疏忽，都会造成无法挽回的后果，使工作前功尽弃。

污染中特别注意一种呈乳白色的细菌污染，这种细菌为芽孢杆菌。

法国林木育种协会鉴定为迟缓芽孢杆菌，它外被荚膜，耐高温，一般消毒剂难以杀死。

它可随培养材料、用具等传播；也可出现在培养基表面，或呈滴形云雾状存在培养基内，若出现时应严格灭菌，清洗和消毒用具，并更换消毒酒精[6]。

操作人员操作动作要熟练、动作快、规范，这样可以缩短操作时间，减少污染。

因为有很多组织培养的失败，从材料、培养基条件等方面检查均无问题，只是由于操作技术不熟练，如脱毒培养抽取茎尖很小，操作时间长了就会使茎尖失水变干，或不慎感染杂菌，再同时接种的环境又不是绝对无菌的。

所以工作人员在进行无菌操作是要严守以下几点：

1、入无菌室前，要洗手，去掉指甲中的污物。

2、入室时要穿上经过消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。

3、操作前要用70%的酒精擦洗工作人员的手，操作中要经常用酒精擦洗手。

不准讲话，亦不准对着操作区呼吸，以免微生物污染材料、培养基和用具。

每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。

4、必须在酒精灯火焰处进行操作，如打开瓶口，转接材料。

盖瓶盖前应将瓶口在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上烧一下，然后盖上。

第4章红掌诱导与继代培养过程中的污染

初代培养获得的无菌材料在后期或继代培养也可能出现污染，这一方面是由于操作不慎的原因，另外即是由于初代培养中使用了营养相对简单的培养基有可能使污染不易表现出来，有时继代材料在培养室则可能被螨传播的真菌污染。

对已污染的红掌组培苗，有时因植物材料难得或重新发生要花费很多时间，也可切取较大的植株重新消毒接种。

李春燕等用400或600万单位/L的青霉素无菌水溶液分别浸泡红掌组培细菌污染苗60min或40min，可有效防治组培中的细菌污染。

经处理过的苗继代培养时，不再重复出现细菌污染现象，且苗分化能力强，生根培养时，根系发达，移栽成活率高[7]。

李颖等的实验研究证明，如果继代培养中只有真菌污染，采用3%的多菌灵无菌液浸泡0.5h以上即可，用无菌水冲洗后接种或不用无菌水冲洗直接接种都可消除真菌污染。

如果在细菌污染和细菌、真菌同时污染的情况下，可采用HgCl2消毒法，把污染的红掌培养苗切割成较长的茎段作外植体，用自来水冲洗0.5h，再在超净工作台上用乙醇和HgCl2进行短时间的处理即可再度建立无菌苗培养体系[8]。

第5章污染的原因和预防措施

5.1通常污染

在培养过程中，培养材料附近经常出现黏液或混浊的水迹，并有发酵状泡沫。

这大多是细菌性污染，主要是由于使用了未消毒好的工具及操作者呼吸时排出的细菌所引起的，或是操作人员的手接触了材料或器皿边缘所致；有时培养基上还会出现黄、白、黑等不同颜色的霉菌，这是真菌性污染，主要是由于接种室空气污染造成的[9]

5.2内源性污染

在红掌组织培养中，由于材料内部的内生菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料进入培养过程，引起的污染称为内生性污染或内源性污染。

主要有以下几类：

黄单胞菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、土壤杆菌属、棒状杆菌属、欧文氏菌属等。

真菌主要有霉菌。

在红掌初代培养中，表面细菌引起的污染通常在2～3天就能在外植体周围或培养基表面形成明显的如水污状、油污状、气泡或干缩的红、黄、乳白等颜色的菌落。

而在外植体培养后3～5天内并未发现细菌污染，以后则不段出现明显的或不明显的细菌菌落，就可能是由内生细菌引起的污染[10]。

在红掌初代培养或前几代的继代培养中存在的污染，并不形成明显的菌落而只在培养基内部形成“丝状物”，“晕状物”，不易被肉眼发现的，对红掌中的内生细菌，由于它潜伏得较深，表面消毒方法无法将其消灭。

有时在外植体的初级培养中，包括前几代的继代培养，往往在培养基上不易被发现，随着继代培养次数的增加，菌量不断的积累，就会在培养基上表现出来。

对于这种情况，我们可以利用背光检查法去观察发现它[11]。

5.3污染原因判断及污染苗抢救

1、若污染菌类是零星分散在培养基中，则可确定是人为引起的污染，比如培养基灭菌不彻底；超净工作台长时间不换滤网，致使净化能力降低；接种用具灭菌不彻底；操作不正确，动作生硬缓慢，开瓶时间太久，接种台摆放物品杂乱，操作中心在人体范围之内；接种室长期不灭菌，菌类太多；若污染菌类是从材料周围长起，则可证明是植物材料带菌引起。

可能是接种用具灭菌不彻底，接种时材料被污染；或者是未及时发现污染苗，接种过程交叉感染；若是外植体，菌类从材料培养基以上部分长起，而不是从培养基先长起，且发生在5天以后，则说明是材料带的内生菌。

若从培养基以下开始长菌，发生时间较早，且有从里向外的趋势，则说明是切口引起的污染，原因有是灭完菌后，未剪去两个切口或虽剪但器具带菌[12]。

2、真菌污染后，如果已形成孢子，则必须经高压灭菌后扔掉，即使仅形成菌丝，菌丝能够达到材料内部，因此，真菌污染是灭绝性的。

但若使细菌污染，由于细菌繁殖是靠芽孢，细菌不会弥散整个空间，因此只要及时发现，将材料上部未感菌的部分剪下转接，材料仍可以用。

3、用抗生素等杀菌药剂的处理，虽有不少报道，但至今还未发现那种抗生素能够对各种菌都有效，并且常常也会影响红掌材料的正常生长分化。

另一些药剂，虽有的杀菌效果好，但往往容易引起盐害，也无法利用[13]。

5.4预防方法和措施

5.4.1基本方法

1、通风：

经常开窗，保持室内空气流通．可以使室内真菌数量减少。

通风方法简便易行，应多使用。

2、去湿：

保持室内空气干燥，如使用空调“除湿”功能，也可减少真菌生长繁殖。

3、光照：

紫外线能杀灭或抑制真菌生长，有调查发现下午一时是大气细菌粒子沉降的一个低谷，说明太阳辐射对空气微生物有明显的杀灭作用。

因此，保持室内较好采光，在梅雨季节后将衣物等晾晒，对减少室内真菌污染大有好处[14]。

4、防霉：

污染物品和污染培养基不要在培养室近距离开瓶洗刷。

5.4.2经常检查消毒锅的灭菌质量

消毒锅的压力表降到零后不能马上出锅。

因冷热空气作用的负压效应，使外界环境的冷空气倒吸入已灭菌好的培养瓶内引起真菌污染，为避免该现象的发生，消毒后培养瓶应留在锅里，等冷却后才出锅。

如果出现培养基造成的污染，就要及时地检查灭菌锅的性能或其他的问题。

5.4.3检查培养容器是否存在问题

培养容器封口多用塑料盖、胶塞、棉塞、薄膜等，塑料盖用久了易老化，密封性差，也会造成污染。

同时，培养瓶在使用之前要洗净（包括瓶内瓶外），灭好菌的培养瓶不要放在空气中太久，一般出锅后1～2天内接完种最好，以减少培养瓶表面的微生物引起的污染。

5.4.4继代培养中污染的控制

这类污染可以从以下2个方面进行防止。

（1）扩大繁殖时应有合理程序。

在获得的无菌培养物之后，应将其中一部分作为“原种”保存起来，分批繁殖和复检后再大规模生产。

（2）可通过在培养基中加入抗菌剂来防止。

多菌灵用于红掌组织培养的抑菌促生长，培养物不受微生物污染，灭菌率为98%以上，无白化苗，生长健壮，不过这种方法不能广泛使用，因为有些植物在抑菌素会受到毒害，如叶片变小、变黄和不能分化等。

还有使用时要调到适合的浓度[16]。

5.4.5减少培养基中的有机成分

培养基中有机成分的存在是污染产生的重要原因,去除有机物是减少污染的一条途径。

在红掌的组织培养中，除去培养基中的VB1、VB6、烟酸等（保留肌醇）有机成分，经2～3代培养后，能抑制细菌生长，对丛生芽生长增殖没有影响。

原因是这些都是某些细菌生长的必须物质，去除这些有机成分后，细菌无法生长发育而慢慢死亡或减少。

由日本的古在丰树教授首创的无糖组织快繁技术则全部除去培养基中的有机成分，输入可控制量的CO

气体作为碳源，并通过控制环境因子，促进植株光合作用速率，使之由异养型转变成自养型，因而植物长势良好，污染率明显降低[17]。

结　论

污染问题，是红掌组织培养过程中难以杜绝的现象。

污染造成的后果是严重的，它会增加接种源及污染的几率，对花卉造成伤害，耗工耗时，提高生产成本。

对于如何控制污染，以建立一个洁净、良好的工作与培养环境和无菌的植株系统为组培业所要努力的方向。

目前组培苗污染实验所遇到的问题为不易建立植株的干净度，因此无法确定真正的污染源来自何处，无法对症下药。

而且对于菌种的鉴定有很大的困难，因为一般有关植物或是植物病原菌，其背景资料较少，对于鉴定而言，便较棘手。

在红掌组织培养中，一般的污染较容易控制，要达到接种的无菌环境条件，无菌操作要求和无菌操作水平。

而内源菌则较难控制，要求全部杀死植物表面和组织中的微生物，一般的消毒方法是不能完成的。

通过先对外植体植物进行预栽管理、外植体的预处理，并在这基础上，改进消毒方法，（如真空减压法、酸化培养基、灼烧法等），也可除去培养基中的有机成分，这些措施都能降低由内源菌引起的污染。

当然，在植物组织培养中，控制污染的方法是可灵活多变的，只要能减少污染，不会发生培养物的遗传变异，实现工厂化快繁，降低成本，能在市场竞争中占有一席之地即可。

谢辞

本课题在选题及研究过程中得到赵老师的悉心指导。

并为我指点迷津，帮助我开拓研究思路，精心点拨、热忱鼓励。

本文从材料的收集到撰都是在赵老师和同学们的关心和鼓舞下顺利进行的。

在这期间尽管赵老师很忙但它却仍然抽出时间为我修改论文，使我能够顺利的将本文完成。

同学们也不亦乐乎的为我提供帮助，他们积极的为我查资料并相互检查错误共同提高。

在我的写作过程中，赵老师多次指导我论文的写作方法和技巧，教我研究的思路和方向。

在我写作论文的期间，每当我遇到困难和疑惑时，赵老师总是一针见血的指出我的不足，帮助我拨开迷雾、跨越困难的鸿沟。

赵老师始终为人师表，不厌其烦，令我感到无比钦佩。

本文是在赵老师的精心指导下完成的，在此我谨向赵老师致以崇高的敬意。

最后，不能忘记我的兄弟姐妹们——我的同学和朋友们，在论文写作的过程中乃至三年的学习生活里，他们与我朝夕相处，互相讨论，共同进步。

在此我忠心的向所有帮助过我的老师和同学表示感谢！

参考文献

[1]李云.林果花菜组织培养快速育苗技术，中国林业出版社，2003，1

（2）:

23-25

[2]王青连.植物组织培养[M]，中国农业出版社，2002：

23-24.

[3]周俊辉.植物组织快繁技术中存在的问题和对策《仲恺农业技术学院学报》，1999，12（4）：

64-70

[4]朱广廉.植物组织培养中的外植体灭菌《植物生理学通讯》,1996,32（6）:

444-446

[5]黄小荣,杨开太.香水白掌的组织培养，广西林业科学，2001，30

（1）：

39-40

[6]韦三立.花卉组织培养，中国林业出版社，2002，8

（2）:

44-46

[7]柴向华,李军,张秀珊.植物组织培养中污染的控制，《热带农业科学》2003.23（6）:

40-43

[8]熊丽，吴丽芳.观赏花卉的组织培养与大规模生产，化学工业出版社，2003，80-81

[9]李春燕，李颖.组织培养中青霉素对细菌污染的抑制作用，东北林业大学学报，2000,28（5）:

97-98

[10]李颖，李春燕.多菌灵和青霉素在组培污染中的应用，林业科技，2002，27

（1）：

6-8

[11]由翠荣,曲复宁,龚雪琴等.迷你玫瑰组织培养中细菌污染的防止[J]，植物生理学通讯,2004,40

（1）:

46-47

[12]周俊辉，周厚高，刘花全.植物组织培养中内生细菌污染问题《广西植物》，2003，23

（1）:

41-47

[13]biotec.植物组织培养苗之污染与检测[EB/OL].2006，15

（1）:

16-17

[14]林盛，马崇烈，胡东琼