熏肉制品中亚硝酸盐含量的测定报告.docx
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熏肉制品中亚硝酸盐含量的测定报告
实验题目 熏肉制品中亚硝酸盐含量的测定
20092401081
一、目的与要求：
1、明确亚硝酸盐的测定与控制成品质量的关系。
2、明确与掌握盐酸萘乙二胺法的基本原理与操作方法。
二、引言
（一）亚硝酸盐的介绍
亚硝酸盐是作为发色剂使用于腌制香肠、腊肉和火腿等肉制品中，因其可缓慢的分解释放出氧化氮（NO），使肉中的肌红蛋白亚硝基化形成稳定的亚硝基肌红蛋白色素，从而保持肉制品中的固有色泽；另一方面，亚硝酸盐还具有防腐作用，能够抑制肉毒梭状芽孢杆菌，防止肉类制品的腐败变质。
但是，亚硝酸盐不仅本身具有毒性，往往因使用过量或使用方法不当而导致食物中毒发生。
因为进入体内的亚硝酸盐常常与蛋白分解生成的胺类结合成强致癌物亚硝胺。
若熟肉制品中亚硝酸盐残留量过高，必然导致这种潜在危险的增大。
硝酸盐及亚硝酸盐被用于肉类食品中，硝酸盐本身具有一定杀菌作用，大部分的应用可能会转化少量的亚硝酸盐。
（二）亚硝酸盐的测定方法
（1）分光光度法
分光光度法目前广泛采用的是盐酸素二胺分光光度法和酚二磺酸分光光度法。
这2种方法均为水质分析方法标准，最低检出浓度亚硝酸盐为0.003mg/L（试份体积为50ml），硝酸盐最低检出浓度为0.02mg/L（试份体积50ml），水样中某些共存离子对测定产生干扰，需作适当前处理以消除对测定的影响。
此外，所用试剂如盐酸萘乙二胺等有毒性，且操作较繁琐。
近年来，许多分析工作者致力于高灵敏度亚硝酸盐和硝酸盐的分析方法研究。
（2）紫外分光光度法
紫外分光光度法测定硝酸盐和亚硝酸盐，人们关注的研究课题之一是探索不经任何分离而同时测定NO3-和NO2-。
该法具有较好的准确度和精密度，操作简便，计算准确，速度快，是一种很有应用前景的方法。
（3）荧光光度法
荧光光度法灵敏度高，近年来对荧光光度法测定NO2-和NO3-的研究增多。
（4）催化动力学法
高甲友等研究了亚硝酸根对溴酸钾氧化罗丹明B的催化效应，提出了一个新的测定痕量的NO2催化荧光和催化光度法。
郑肇生等利用高灵敏的动力学法与高灵敏的荧光检测相结合，报道了溴酸钾氧化荧光素动力学荧光法测定痕量NO2-，可直接测定水样中亚硝酸根，回收率为96％～106％。
催化光度法测定亚硝酸根，已报道了以溴酸钾作氧化剂，对氮蒽染料、偶氮染料、三苯甲烷染料和蒽醌染料做指示物质，其中郑肇生等提出的溴酸钾氧化蒽醌染料一茜素绿催化光度法测定水中亚硝酸盐，是目前动力学法测定亚硝酸最灵敏反应之一。
杨书润等基于在稀硫酸介质中NO2-对溴酸钾氧化键的催化效应，采用流动注射停流技术，建立了NO2-的快速分析方法，用该法测定自来水、雨水、湖水和生活污水中NO2-加标回收率为94％～100％，操作简便、快速。
门瑞芝等研究了甲基橙动力学法测定水、食品和蔬菜中NO3和NO2，在紫外光照射下甲基橙褪色程度与NO3和NO2含量成正比，该法首先测定二者的总量，然后在氨基磺酸存在下测定NO3-的量，再差减求得NO2-的量。
（5）极谱法
极谱法测定NO2-用于水样和蔬菜中NO2-的测定，选择性好，灵敏度高。
（6）色谱法
（7）离子色谱法
用该法测定蔬菜中NO2-和NO3-，添加不同浓度标准液的回收率在85％～110％之间。
（8）反相离子色谱法
辛梅华等报道了反相离子对色谱法一电化学检测测定NO2-等离子的方法。
以峰高一外标法定量，样品中高倍量常见离子不干扰NO2-的测定，用该法测定地面水和废水中NO2-，加标回收率为92.0％～94.5％，NO2-检出限为0.55ng/ml，线性范围0～3.0μg/ml，相对标准偏差为1.5％，方法快速、灵敏、选择性高。
（9）表面活性剂法
（10）传感器法
（11）发光分析法
（12）试纸法
在试纸上进行反应，就是把化学反应从试管里移到滤纸上进行，按反应本质说，都是利用迅速产生明显颜色的化学反应定性或定量检测待测物质。
试纸的制作方法比较简单，一般是将试剂配成溶液，浸渍到纸基上，以适当的方法干燥。
也有将试剂（要求有一定的稳定性，多为染料）分散和纸浆一道制成试纸。
亚硝酸盐的测定方法虽然较多，灵敏准确，但大都操作烦琐，时间较长，需要昂贵的仪器设备，不适用于快速测定，不利于推广和应用。
而试纸法比其他方法具有更多的敏感性。
为此试纸法作为一种简捷地测定亚硝酸盐的快速分析方法具有重要意义。
三、实验原理：
样品经沉淀蛋白质，除去脂肪后，在弱酸条件下硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，生成的重氮化合物，再与萘基盐酸二氨乙烯偶联成紫红色的重氮染料，产生的颜色深浅与亚硝酸根含量成正比，可以比色测定。
反应式如下：
采用邻苯二胺紫外分光光度法对市售肉制品中的亚硝酸盐含量进行了测定.研究结果表明,邻苯二胺与亚硝酸盐在酸性介质中化合形成产物苯并三氮唑,其在紫外区280nm处有一灵敏吸收峰,能去除其他离子的干扰,该法在工作范围内呈线性,检测极限范围为5～250μg/ml.该方法快速、实用、简便、准确,适用于大批量试样的分析检测.
四、试剂与仪器
1、亚铁氰化钾溶液：
称取10.619克亚铁氰化钾[K4Fe9（CN）5.3H2O]，溶于水后，稀释至100毫升。
2、乙酸锌溶液：
称取22克乙酸锌[Zn（CH2C00）2·2H20]，加3毫升冰乙酸溶于水，并稀释至100毫升。
3、饱和硼砂溶液：
称取5克硼酸钠（Na2B07·10H20），溶于100毫升热水中，冷却后备用。
4、0.4％对氨基苯磺酸溶液：
称取0.2克对氨基苯磺酸，加22.7毫升37%盐酸，用水定容至50毫升。
5、0.2％盐酸萘乙二胺溶液：
称取0.1克盐酸萘乙二胺，溶于50毫升水中，避光保存。
6、亚硝酸钠标准溶液：
精密称取0.1000克于硅胶干燥器中干燥24小时的亚硝酸钠，加水溶解移入500毫升容量瓶中，并稀释至刻度。
此溶液每毫升相当于200微克亚硝酸钠。
7、亚硝酸钠标准使用液：
临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液2.50毫升，置于100毫升容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于5微克亚硝酸钠。
8、分光光度计。
五、实验操作步骤：
1、样品处理：
称取5.0克经绞碎混匀的样品，置于50毫升烧杯中，加工12.5毫升硼砂饱和溶液，搅拌均匀，以70℃左右的水约300毫升将样品全部洗入500毫升容量瓶中，置沸水浴中加热15分钟，取出后冷至室温，然后一面转动一面加入5毫升亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5毫升乙酸锌溶液以沉淀蛋白质，加水至刻度，混匀，放置0.5小时，除去上层脂肪，清液用滤纸过滤弃去初滤液30毫升，滤液备用。
2、实验条件探索
（1）最大波长的选择：
以蒸馏水为空白溶液调基线后装入浓度为0.0800微克／毫升的标准溶液，在波长为450~610nm的范围内，每隔10nm扫描一次，记录其吸光度，并在最大吸光度处，前后5nm再扫描一次，记录习惯度，选择最大吸光度的波长做为后面实验的固定波长。
波长nm
450
460
470
480
490
500
510
520
525
530
吸光度A
0.015
0.020
0.028
0.036
0.045
0.054
0.063
0.067
0.068
0.068
波长nm
535
540
550
560
570
580
590
600
610
吸光度A
0.066
0.064
0.054
0.042
0.027
0.014
0.009
0.004
0.003
通过以上不同波长吸光度的测定，最终决定选择530nm作为最大吸收波长。
（2）显色剂用量
在浓度为0.0800微克／毫升的标准溶液中加入不同体积的显色剂，固定在最大波长530nm，测定其吸光度，选择合适的体积进行绘制标准曲线的测定。
显色剂
用量mL
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
吸光度A
0.001
0.069
0.072
0.070
0.071
通过对以上测得数据的分析，在显色剂用量达到1ml后，随着显色剂用量的增加，吸光度的变化不是很大，固决定选择使用1mL的显色剂来进行下面的测定。
（3）显色时间
在浓度为0.0800微克／毫升的标准溶液中加入1mL的显色剂，固定最大波长530nm，测定放置不同时间后该溶液的吸光度。
显色时间
0
5
10
15
20
吸光度A
0.069
0.072
0.072
0.072
0.073
通过对以上数据的分析，随着放置时间的增长，吸光度有增大的趋势，但在10分钟后吸光度增大程度不是很明显，所以决定选取放置10min，既能节省时间又能获得较大的吸光度。
（4）空白溶液
固定标准溶液的浓度为0.0800微克／毫升，波长为320nm，加入1mL显色剂，放置10min，改变参比溶液，测定吸光度。
空白溶液
1
蒸馏水
2蒸馏水+对氨基苯磺酸
3蒸馏水+盐酸萘乙二胺
4蒸馏水+对氨基苯磺酸+盐酸萘乙二胺
吸光度A
0.070
0.068
0.068
0.067
通过以上的测定，从吸光度的数值分析，决定选取蒸馏水作为空白溶液。
综上所述，在标准曲线绘制的测定实验中，选取的波长为530nm，显色剂用量为1mL，显色时间为10min，空白溶液为蒸馏水。
3、亚硝酸钠标准曲线的绘制
用移液管移取亚硝酸钠的标准使用液0.00,0.20,0.40,0.60,0.80,1.00,1.50,2.00mL于50mL容量瓶，加水至约25mL，加入2mL0.4%的对氨基苯磺酸，静置3~5min后，加入1mL0.2%盐酸萘乙二胺，用水定容至刻度线，摇匀，静置10min，按照以确定的条件测定其吸光度，绘制标准曲线。
4、样品溶液的配制
吸取20毫升上述样品处理的滤液于25毫升容量瓶中，加入1毫升0.4％对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3-5分钟后各加入0.5毫升0.2％盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置10分钟，用1厘米比色杯，以蒸馏水为空白溶液调节零点，于波长530nm处测吸光度，通过测得的吸光度和已绘制的标准曲线，求出样品中亚硝酸盐的含量。
A×1000×500
计算：
X=--------------------------------
20
m×--------×1000×1000
25
X：
样品中亚硝酸盐的含量，g／kg；
m：
样品质量，g；
A：
测定用样液中亚硝酸盐的含量，ug．
六、实验的数据处理分析
（一）标准曲线的绘制
最大波长530nm，放置10min，显色剂用量1mL，空白溶液：
蒸馏水
亚硝酸钠标准溶液（ug／mL）
0．0000
0.0020
0.0040
0.0060
0.0080
0.0100
0.0150
0.0200
吸光度A
0.005
0.021
0.037
0.052
0.067
0.080
0.115
0.152
（二）样品的数据处理
实验测得样品的吸光度A为0.024，代入曲线方程中计算得到测量样品的浓度为C=0.0023ug/ml,代入下列公式计算。
A×1000×500
计算：
X=--------------------------------
20
m×--------×1000×1000
25
m：
样品质量5g；
X：
样品中亚硝酸盐的含量:
2.875×10-4g/kg
七、结果讨论分析和实验心得
1、实验测得样品中亚硝酸盐的含量是：
2.875×10-4g/kg，相关线性系数r=0.9994，结果比较可靠，因此认为该样品的亚硝酸盐含量较低，可以放心食用。
2、本实验探究了四个实验条件，包括：
显示时间、显色剂用量、最大吸收波长和参比溶液，分析处理了实验探究数据并得出了比较佳的实验条件。
其实影响实验的条件还有试剂的酸度，我们组本来决定要做这个酸度的探究，但因为对氨基苯磺酸溶液不同酸度的溶液配制起来比较麻烦，也很浪费试剂，而我们的时间也比较紧迫，所以我们没有系统的做这个探究。
然后我们也思考除了这种方法，是否有更简便的方法来探究。
我们想过直接在配好的一瓶溶液中，先加1-2滴37%的盐酸，测量出吸光度后，再滴加1-2滴37%的盐酸，再测量，再滴加。
初看似乎觉得这个方法挺不错，然后我们就想酸度增加的探讨了，但是酸度降低的那些怎们办呢？
难道加水？
想到这里我们就发现前面的直接加盐酸的方法不行——因为这样相当于把溶液中亚硝酸盐的浓度改变了！
存在多个变量，不能用来做实验条件探究！
后来也没有想出其他的方法，所以我们没有做酸度的探究。
但这个思考过程启发了我们的思维，使我们思考问题的时候能更加关注其合理性、科学性与可行性。
3、这个设计实验用的是分光光度计，仪器的使用一开始我们不大清楚，而且在刚开始实验的时候我们都有点混乱，小组间的工作分配也不够合理。
我想这些主要因为我们课前没有充分预习好这个实验，这是一个教训。
不过在这个探究实验中，我们通过自己的摸索和探究，对这个实验印象很深刻，更加了解了实验原理、实验内容、过程、如何合理安排实验步骤以节省时间以及实验仪器的具体操作等。
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