高中生物 第1章 微生物培养技术 第1节 微生物的分离和纯培养教案 中图版选修1.docx
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高中生物第1章微生物培养技术第1节微生物的分离和纯培养教案中图版选修1
第一节微生物的分离和纯培养
一、培养基
1．含义
由于微生物代谢方式的不同，因而对营养物质的需求也是有差异的。
根据微生物生长繁殖和代谢的需要，将各种营养物质混合在一起而配制的营养基质。
2．平板培养基
将溶化后的固体培养基基质倒入无菌培养皿中，冷却凝固后制成的培养基。
二、无菌技术
1．目的和要求
在微生物的分离和纯培养中，一定不能有外来的污染性杂菌，所以必须采用无菌技术进行操作。
因此，在实验过程中，要对所用的器材、培养基进行严格的灭菌，对工作场所要进行消毒。
2．灭菌和消毒
（1）灭菌：
用强烈的理化因素杀死环境或物体内外所有的微生物，常用的方法是高温灭菌法。
（2）消毒：
用相对温和的理化方法杀死环境或物体上的病原微生物和有害微生物的营养细胞，常用的方法是射线消毒法和化学药剂消毒法。
三、接种技术
1．含义
把相应的研究对象移入培养基中的过程。
2．分类
在平板培养基上接种的方法有平板划线法、稀释平板涂布法、稀释混合平板法等。
预习完成后，请把你认为难以解决的问题记录在下面的表格中
问题1
问题2
问题3
问题4
一、微生物的概念及特点
1．概念
微生物是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称。
2．特点
微生物
微生物
二、微生物的营养及功能
微生物的化学组成成分与其他生物大体相同，也是由C、H、O、N、P、S等元素组成，其中C、H、O、N占细胞干重的90%以上，这些元素最终来自外界环境中的各种无机化合物和有机化合物。
这些化合物可归纳成碳源、氮源、生长因子、无机盐和水这五大类营养要素。
营养物质
定义
作用
主要来源
碳源
凡能提供所需碳元素的物质
构成生物体的细胞物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质
无机化合物：
CO2、NaHCO3等；有机化合物：
糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等
氮源
凡能提供所需氮元素的物质
合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物
无机化合物：
N2、NH3、铵盐、硝酸盐；有机化合物：
尿素、牛肉膏、蛋白胨等
生长因子
生长必不可少的微量有机物
酶和核酸的组成成分
维生素、氨基酸、碱基等
水
在生物体内含量很高，在低等生物体内含量更高
不仅是优良的溶剂而且可维持生物大分子结构的稳定
外界摄入
无机盐
为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素
细胞内的组成成分，生理调节物质，某些化能自养菌的能源，酶的激活剂
无机化合物
①微生物最常利用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常利用的氮源是铵盐、硝酸盐。
②在微生物所需要的化合物中需要量最大的是碳源，新陈代谢同化作用类型的划分也是根据是否能合成含碳有机物为依据，能合成含碳有机物的是自养型，反之则为异养型。
③对异养微生物来说，含C、H、O、N的有机化合物既是碳源又是氮源、能源。
④微生物之所以需要补充生长因子，往往是由于缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限。
一些天然物质如酵母膏、蛋白胨、动植物组织提取液等可为微生物提供生长因子。
三、大肠杆菌的分离方法和实验过程
1．实验原理
微生物的分离与纯化就是将待检测微生物样品通过划线或涂布接种在固体培养基上，样品中的每一个细胞或孢子都可以生长繁殖形成单个菌落。
将单个菌落接种到斜面培养基上，经培养后，即可得到一个微生物的纯种。
2．材料用具
培养16～24h的大肠杆菌（E.coli）培养液，灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基斜面和平板，盛有9mL无菌水的试管，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环等。
3．方法步骤
微生物的分离包括样品稀释、划线或涂布及培养三个步骤。
微生物分离操作流程图
（1）稀释 用1mL无菌吸管吸取1mL大肠杆菌培养液，加入到盛有9mL无菌水的大试管中，充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1mL加入另一支盛有9mL无菌水的试管中，混合均匀，依次制成10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6系列稀释度的大肠杆菌稀释液。
（2）划线或涂布
平板划线分离法：
在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，沾取大肠杆菌培养液在平板上划线，常用的划线方法有交叉划线和连续划线两种（如下图）。
交叉划线时，每转一个角度烧一次接种环。
划线完毕后，盖上培养皿盖，做好标记。
划线法示意图
涂布分离法：
取3个平板，底面分别用记号笔写上10－4、10－5和10－6三种稀释度，然后用无菌吸管分别吸取相应稀释度的稀释液各0.1mL，放入已标记好的平板上，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5～10min，使菌悬液吸附进培养基（如下图）。
涂布法示意图
（3）培养 将划线或涂布接种的平板倒置于培养箱或温室中37℃培养16～24h，即可长出单个的菌落。
四、平板划线操作应注意的问题
第一次划线及每次划线之前都需灼烧接种环灭菌，划线操作结束仍需灼烧接种环，每次灼烧目的如下表：
第一次灼烧
每次划线之前灼烧
划线结束灼烧
目的
避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使每次划线的菌种来自上次划线末端
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
①灼烧接种环之后，要等其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
②划线时最后一区域不要与第一区域相连。
③画线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破。
培养基的营养成分
下表是某微生物实验室的培养基配方。
据表回答：
编号
成分
含量
①
（NH4）2SO4
0.4g
②
KH2PO4
4.0g
③
FeSO4
0.5g
④
CaCl2
0.5g
⑤
H2O
100mL
（1）上表中培养基可培养的微生物类型是________。
（2）此培养液能否用于植物的无土栽培？
________，理由是__________，若用于无土栽培，还应注意培养液中________的含量。
（3）若除去①，加入（CH2O），该培养基可用于培养__________。
【解析】 培养基中未提供碳源，据此可判定该生物应为自养型，但对植物来说，无土栽培时所用培养液必须是全素培养液（即含所有必需元素），因此，该培养液不可直接用于植物的无土栽培。
从培养基中除去（NH4）2SO4（氮源），加入（CH2O）（有机碳源），该培养基可用于培养固氮微生物。
【答案】
（1）自养型微生物
（2）不能 缺乏Mg等矿质元素 氧气
（3）固氮微生物
自养微生物和异养微生物的营养比较
微生物
自养型微生物
异养型微生物
碳源
CO2、NaHCO3
糖类、脂肪酸等
氮源
NH3、铵盐、硝酸盐等
铵盐、硝酸盐、蛋白质等
生长因子
一般不需要
有些种类需要
举例
硝化细菌
乳酸菌
1．关于培养基配制的说法不正确的是（ ）
A．配制的培养基需要进行灭菌
B．微生物的适应性强，配制培养基时可以不考虑pH
C．虽然各种培养基的具体配方不同，但一般都含有碳源、氮源、水和无机盐
D．配制培养基时要注意各种养分的浓度和比例
【解析】 pH影响微生物的生长、代谢和繁殖，因此配制培养基时pH一定要适宜。
【答案】 B
微生物的纯化
氯苯化合物是重要的有机化工原料，不易降解，会污染环境。
某研究小组依照下列实验方案（如图）筛选出能高效降解氯苯的微生物SP1菌，培养基配方如表。
图a
表b 培养基的组成
液体
培养基
蛋白胨
牛肉膏
氯苯
氯化钠
硝酸铵
无机盐
（无碳）
蒸馏
水
Ⅰ号
10g
5g
5mg
5g
—
—
1L
Ⅱ号
—
—
50mg
5g
3g
适量
1L
Ⅲ号
—
—
20～
80mg
5g
3g
适量
1L
下列有关说法正确的是（ ）
A．图中有筛选作用的只有Ⅱ号培养基
B．Ⅱ号、Ⅲ号培养基中无碳源只能培养自养微生物
C．Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号培养基中氯苯含量逐渐增加，是为了逐步选择降解氯苯能力强的微生物
D．微生物中原来就存在能降解氯苯的SP1菌，因此可以直接用Ⅲ号培养基进行一次性选择
【审题导析】
【精讲精析】 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号培养基都对SP1菌有筛选作用；从培养基配方可以看出，Ⅱ、Ⅲ号培养基的碳源为氯苯；Ⅲ号培养基中氯苯的含量太高，直接使用，可能无法得到SP1菌（自然状态下具高效降解能力的变异很少）。
【答案】 C
2．上题将SP1菌接种在含不同浓度氯苯的Ⅲ号培养基中培养，得到生长曲线（如下图），下列叙述不正确的是（ ）
A．随着氯苯含量升高，SP1菌体数增多
B．在20mg/L氯苯的培养基中菌体数最先达到最高
C．氯苯为SP1菌提供碳源
D．SP1菌在只含氯苯的培养基中就可以生长
【解析】 培养基中除了含有氯苯外，还应含有氮源、无机盐等营养物质。
【答案】 D
1．据食品产业网报道，近些年出现的一种膨化食品，合格率仅为76.2%，这两年不断有名牌企业出现食品质量问题，其主要原因大部分为铝含量超标，以及微生物超标。
下列关于微生物的叙述中，正确的是（ ）
A．所有的微生物都是形体微小、结构简单、对人类有害的
B．微生物包含了除动物界、植物界的其他生物
C．微生物的结构简单到没有细胞核
D．微生物的结构简单到没有细胞结构
【答案】 B
2．有关平板划线法操作的叙述不正确的是（ ）
A．第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
B．每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种
C．在每一区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液
D．划线结束后，灼烧接种环，能及时杀死接种环上的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
【解析】 在用平板划线法分离大肠杆菌的实验中，接种环取菌种前灼烧的目的是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物。
以后每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线后残留的菌种；划线结束后仍需灼烧接种环，是为了避免细菌污染环境和感染操作者。
从第二次划线开始，每次划线时接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端。
【答案】 C
3．（2016·全国乙卷改编）空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。
某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。
实验步骤如下：
①配制培养基（成分：
牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O）；
②制作无菌平板；
③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；
④将各组平板置于37℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。
回答下列问题：
（1）该培养基中微生物所需的氮来源于__________。
若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是________。
（2）步骤③中，实验组的操作是______________________。
（3）若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了________现象。
【解析】
（1）牛肉膏和蛋白胨中均含有氮元素，因此微生物所需的氮来源于牛肉膏和蛋白胨。
若要完成步骤②，需要进行倒平板操作，用到的是固体培养基，所以培养基中要有琼脂。
（2）该实验的空白对照组为不进行处理的无菌平板，实验组的操作为将各无菌平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露相同时间。
（3）若空白对照组的平板上出现了菌落，说明实验过程中出现了污染现象。
【答案】
（1）牛肉膏、蛋白胨 琼脂
（2）将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间 （3）污染
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（一）
一、选择题
1．在光亮处用一种培养液分别培养绿藻和酵母菌，其结果如图所示，造成这种结果的原因是培养液中（ ）
A．缺少无机盐
B．含氧量太高
C．缺少有机养分
D．不含二氧化碳
【解析】 绿藻（自养）增多，酵母菌（异养）数量减少，说明培养基中缺少有机碳源。
【答案】 C
2．下表是某同学培养微生物时配制的培养基，关于此培养基的说法中，错误的是（ ）
编号
①
②
③
④
⑤
成分
（NH4）2SO4
KH2PO4
FeSO4
CaCl2
H2O
含量
0.4g
4.0g
0.5g
0.5g
100mL
A.此培养基可用来培养自养型微生物
B．此表中的营养成分共有三类，即水、无机盐、氮源
C．表中各成分的重量按照所培养的微生物的营养需要来确定
D．若除去①，此培养基可用于培养大肠杆菌
【解析】 由表格可知，该培养基不含有机物，且无碳源，因此可培养自养型微生物，大肠杆菌为异养型，除去①之后，培养基中缺少碳源和氮源，大肠杆菌无法生长。
【答案】 D
3．如何判断制作的培养基是否灭菌彻底（ ）
A．看培养基是否透明
B．有没有消灭细菌菌体
C．未接种的培养基在恒温箱中保温1～2天后有无菌落生长
D．是否消灭了微生物的芽孢、孢子
【解析】 配制好的培养基，是否灭菌彻底，通常在使用前在恒温箱中保温1～2天后检验有无菌落生长，若无则说明灭菌彻底。
【答案】 C
4．无菌技术包括以下几个方面的叙述，其中错误的是（ ）
A．对实验操作的空间、操作者的衣物和手进行灭菌
B．将用于微生物的培养器皿、接种用具和培养基等进行灭菌
C．为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行
D．实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触
【解析】 对实验操作的空间、操作者的衣物和手进行清洁是消毒而不是灭菌。
【答案】 A
5．培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌、消毒方法依次是（ ）
①化学消毒 ②灼烧灭菌 ③干热灭菌 ④紫外线灭菌 ⑤高压蒸汽灭菌 ⑥巴氏消毒法
A．⑤③②①④⑥ B．①②③④⑤⑥
C．⑥②③④①⑤D．③④②①⑥⑤
【解析】 培养基用高压蒸汽灭菌；培养皿能耐高温，用干热灭菌法；接种环可用灼烧灭菌达到迅速彻底灭菌的效果；实验操作者的双手可用化学药剂进行消毒，如用酒精擦拭双手；空气可用紫外线消毒；为不破坏其营养成分，牛奶可采用巴氏消毒法。
【答案】 A
6．下列所述环境条件下的微生物，能正常生长繁殖的是（ ）
A．在缺乏生长素的无氮培养基中的圆褐固氮菌
B．在人体表皮擦伤部位的破伤风杆菌
C．在新配制的植物矿质营养液中的酵母菌
D．在灭菌后的动物细胞培养液中的禽流感病毒
【解析】 圆褐固氮菌能够产生生长素，因此可以在缺乏生长素的无氮培养基中正常生长繁殖。
破伤风杆菌是一种厌氧型细菌，人体表皮擦伤部位是有氧的环境，因此，破伤风杆菌不能正常生长繁殖；酵母菌是一种异养型微生物，新配制的植物矿质营养液中缺少有机碳，因此酵母菌不能正常生长繁殖；禽流感病毒不能独立生活，只能寄生在活的细胞中，因此禽流感病毒不能在灭菌后的动物培养液中正常生长繁殖。
【答案】 A
7．某生物兴趣小组到野外采集能分解纤维素的细菌，他们在一段枯木上采集到部分细菌，如何将分解纤维素的细菌分离出来（ ）
A．用牛肉膏蛋白胨培养基
B．用不含氮的培养基
C．用以纤维素为唯一碳源的培养基
D．不含氮的培养基上用平板划线法也可以选出
【解析】 牛肉膏蛋白胨培养基为全营养培养基，细菌都可以生长；不含氮的培养基上，分解纤维素的细菌也不能生长。
【答案】 C
8．根据生物与环境的相互依存关系判断，下列寻找目标菌株的思路不正确的是（ ）
A．从热泉中寻找耐热细菌
B．从成熟的葡萄皮上寻找酵母菌
C．从贫瘠的土壤中寻找分解尿素的细菌
D．从树林的腐殖土壤中寻找分解纤维素的细菌
【解析】 贫瘠的土壤中没有分解尿素的细菌，较肥沃的土壤中才有。
【答案】 C
二、非选择题
9．某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了如下实验。
实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察计数。
请回答与此实验相关的问题。
（1）培养基中含有的蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了________和________。
除此之外，培养基还必须含有的基本成分是________和________。
（2）对培养基进行灭菌，应该采用的方法是________。
（3）为了使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种________作为对照进行实验。
（4）培养20小时后，观察到平板上有形态和颜色不同的菌落，这说明湖水样品中有________种细菌。
一般说来，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越________。
【解析】
（1）蛋白胨可提供碳源、氮源、维生素，而淀粉可提供碳源，除此之外，微生物的生长还需无机盐和水。
（2）对培养基的灭菌，在实验室内常用高压蒸汽灭菌法。
（3）在实验的过程中，除实验变量以外其他各变量均应适宜且相同，以利于更好地实现实验目的。
（4）不同的菌落具有各自的菌落特征（如硬度、颜色、透明度、光滑度等）。
【答案】
（1）氮源、生长因子（碳源不作要求） 碳源 无机盐 水（后两空顺序可颠倒）
（2）高压蒸汽灭菌法 （3）无菌水
（4）多 高（或严重）
10．检验饮用水中大肠杆菌的含量是有效监控疾病发生的必要措施。
下图表示相关的检验过程。
（横线上填文字，[ ]内填编号）
（1）图中需要无菌操作的过程有[ ]。
（2）经过过程①～③，样品被稀释了________倍，其目的是
______________________________________________________________
______________________________________________________________。
（3）在进行过程③之前，需要随机取若干灭菌后的空平板先行培养一段时间，这样做的目的是____________________。
接种微生物的方法有很多，图中过程③的方法为____________。
下列示意图与过程③方法对应的结果是[ ]。
a b
【解析】
（1）在稀释和涂布操作中，为避免杂菌污染，都需进行无菌操作。
（2）①过程样品被稀释了10倍，②过程进行了4次共稀释了104倍，因此样品被稀释了105倍。
经稀释后的样液涂布到平板上才能形成单个菌落。
（3）随机取若干灭菌后的空平板先行培养一段时间，如果无菌落出现，说明平板灭菌彻底，否则不彻底。
图中过程③方法为稀释涂布法，a、b两个培养结果示意图分别是用平板划线法和稀释涂布法接种所得。
【答案】
（1）①②③
（2）105 培养后形成单个菌落
（3）检测培养基平板灭菌是否合格 稀释涂布法 b
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