crisprcas9进行全基因组的筛选.docx

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crisprcas9进行全基因组的筛选

crispr-cas9进行全基因组的筛选

HumanCRISPRKnockoutPooledLibrary（Brunello）

一、lentiCas9-Blast质粒的基本信息：

http:

//www.addgene.org/pooled-library/broadgpp-human-knockout-brunello/

由于cas9自待的抗性基因是我们不需要，在抗性基因两边突变出酶切位点，酶切掉原本的抗性基因。

换成另一种。

1.lentiCas9-Blast质粒购买来时是以细菌的形式存在的,先需要扩大培养。

2.试剂盒提取质粒，并测定浓度。

二、慢病毒包装质粒

1转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK293T细胞，调整细胞为7*105在5ml的DMEM培养基中。

37℃、5%CO2培养箱内培养。

待细胞密度达70%～80%时即可用于转染。

2转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养

3

4

5每瓶细胞中加入含10%血清的细胞培养基25ml，于37℃、5%CO2培养箱内继续培养48小时。

6收集转染后48小时（转染即可为0小时计起）的293T细胞上清液。

7于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片。

8以0.45μm滤器过滤上清液于15ml离心管中。

三、慢病毒转染细胞

参考网址：

http:

//www.addgene.org/protocols/generating-stable-cell-lines/

1.取六孔板铺50000个细胞， 37°C,5%CO 2培养，待细胞长到70%，换含有8ug/ml polybrene的培养基培养。

2.慢病毒悬液用含有10ug/ml的DMEM培养基稀释。

3.六孔板中每个空加一种浓度的病毒稀释液，每空0.5ml。

4.孵育48~72小时。

5.换成含有适宜浓度的抗生素的培养基培养1.5ml，筛选出转染成功的细胞。

抗生素浓度的摸索:

用培养基稀释抗生素为1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml、6ug/ml、7ug/ml、8ug/ml、9ug/ml、10ug/ml，并用稀释后的浓度培养细胞，3~5天内使所有细胞死亡的最低浓度可用于筛选细胞。

6.持续加药筛选直到细胞不再大量，并能稳定表达Cas9。

一般筛选需要1~2个星期。

7.在转导sgRNA文库前2~7天改用正常培养基培养。

（或者先测定MOI值后，根据MOI加病毒的量，操作可参照sgRNA的转导）

四、检测病毒转染的结果

1.试剂盒提取质粒

2.PCR扩增（https:

//media.addgene.org/cms/filer_public/61/16/611619f4-0926-4a07-b5c7-e286a8ecf7f5/broadgpp-sequencing-protocol.pdf）。

引物：

ForwardPrimer:

dCas9-F2CCAAAGAGGTGCTGGACG

ReversePrimer:

Blast-RGCTCTTTCAATGAGGGTGGA

3.2%琼脂糖凝胶电泳检测，并用试剂盒纯化PCR产物

4.通过免疫印迹扩增，收集，裂解并测试Cas9表达的细胞群。

五、lentiGuide-Puro骨架基本信息

六、SgRNAlibrary的设计:

在基因芯片上合成核苷酸，分离出来后，进行PCR扩增。

七、把设计好的sgRNA整合到质粒上：

https:

//media.addgene.org/data/plasmids/52/52963/52963-attachment_IPB7ZL_hJcbm.pdf

a）SgRNA文库的构建

1，lentiGuide-Puro载体可以使用BsmBI和一对退火的寡核苷酸可以把sgRNA克隆到骨架中。

首先把5ug的lentiviralCRISPR质粒用BsmBI混合37度，酶切30min。

2，试剂盒（QIAquickGelExtractionKit）纯化酶切的质粒，并用EB或ddH2O溶解。

3，sgRNA1和sgRNA2用T4链接酶连接。

4，

反应程序：

5，把第三步的产物用无菌水或EB以1：

200的比例稀释。

6，质粒与sgRNA的连接整合，温室放置10min。

7.异丙醇沉淀核酸，75%乙醇洗涤后，晾干，用ddH2O溶解。

8.测质粒DNA的浓度。

八、sgRNA文库的扩增

https:

//media.addgene.org/cms/filer_public/56/71/5671c68a-1463-4ec8-9db5-761fae99265d/broadgpp-pdna-library-amplification.pdf

质粒转化电感细胞

试剂:

•100µLelectrocompetentcells（STBL4TM,ThermoFisherScientific,11635-018）

•400nglibraryplasmidDNA

•4electroporationcuvettes（0.1cmgap,Bio-Rad,165-2089）

•10mLSOC（1XSOC,NewEnglandBioLabs,B9020S）

•4bioassayplates（500cm2

LBagar+antibiotic）

•2Maxi-preps（QiagenHiSpeedMaxi,12663）

•Biospreader（BactiCellSpreader,VWRInternational,60828-684）

•Electroporator（MicroPulserTM,Bio-Rad,1652100

1．37度预热SOC培养基15min和含有100ug/mlAMP的LB培养基。

2．取电转化感受态细胞于冰上解冻，,标准质粒也置于冰上，同时准备干净的电击杯于冰上预冷。

3．取400ng的质粒加入100ul的电感细胞中，充分混匀。

4．取25ul混合液把电击杯放在电击仪上进行电击（1.8kv）。

5．迅速在电击杯中加入1mlSOC培养液（无抗生素），然后充分混匀，移到15ml的离心管中.

6．重复3次，增加SOC培养基到10ml。

7．取两空离心管，分别加入5ml上述混合液。

8．37度放置1h。

9．取10ul的混合物做4个浓度梯度，每个稀释10倍。

10．每个浓度（稀释103、104、105、106）取10ul涂布于含有100ug/mlAmp的LB培养基。

11．倒置培养皿，37℃培养16－18小时。

12．计算电转的效率，菌落数*稀释倍数*电感细胞数。

13．第二天刮取菌落接种含有50mlLB和100ug/mlAmp培养基的锥形瓶培养，摇床37度培养过夜。

九、检测扩增的质粒

1.用试剂盒提取质粒，按说明书操作。

并测浓度。

2.双酶切质粒

3.用1%琼脂糖凝胶电泳检测，分析电泳后的条带的大小。

十、慢病毒包装质粒

1转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度为1.2x107细胞/20ml，重新接种于15cm细胞培养皿，37℃、5%CO2培养箱内培养。

24h待细胞密度达70%～80%时即可用于转染

2转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基。

3向离心管中加入质粒DNA和等体积的Opti-MEM，混匀，调整总体积为2.5ml，在室温下温育5分钟。

4将Lipofectamine2000试剂轻柔摇匀，取100μlLipofectamine2000试剂在另一管中与2.4mlOpti-MEM混合，在室温下温育5分钟。

5把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。

必须在5分钟之内混合。

6混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine2000稀释液的转染复合物。

7DNA与Lipofectamine2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养。

8培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20ml的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。

9每瓶细胞中加入含10%血清的细胞培养基25ml，于37℃、5%CO2培养箱内继续培养48小时。

10收集转染后48小时（转染即可为0小时计起）的293T细胞上清液。

11于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片。

12以0.45μm滤器过滤上清液于离心管中。

或者：

1用ddH2O溶解50mg的PEI，调PH为7.1，定容到50ml。

2转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK293T细胞，调整细胞为1.8*107在45ml的DMEM培养基中。

37℃、5%CO2培养箱内培养。

3取一个50ml离心管混合以下物质：

4

5加入195ul的PEI试剂，常温放置10min。

6再加入25mlDMEM。

7跟换新的培养基

848h后收集上清，0.45μm滤器过滤上清液于离心管中。

十一、慢病毒文库转染模式细胞并进行基因筛选

1.测定最适的MOI

（1）.测定前一天，取6孔板，每个孔加4×106个细胞，和2ml含有8ug/mldpolybrene的培养基。

（2）．测定病毒的浓度，准备7~10个无菌的Ep管。

在每个管中加入90μl的无血清培养基。

（3）．取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入到第二个管中。

继续相同的操作直到最后一管。

（4）．六孔板的每孔吸取90μl培养基丢弃。

加入90μl稀释好的病毒溶液。

放入培养箱培养。

（5）．24小时后，换成完全培养基2ml。

小心操作，不要吹起细胞。

（6）．观察荧光感染后72小时后，于荧光显微镜下观察细胞状态和荧光情况，确定细胞状态较好且荧光数较多的孔，对应为较适宜的MOI值。

MOI=病毒量/细胞量。

（确定MOI范围

a．带荧光标签的慢病毒：

观察荧光感染后72小时后，于荧光显微镜下观察细胞状态和荧光情况，确定细胞状态较好且荧光数较多的孔，对应为较适宜的MOI值。

b．不带荧光标签的慢病毒：

通过抗性筛确定最适MOI值。

慢病毒感染后72小时加入100ug/ml的AMP，培养3-5天，镜下观察，选取细胞存活率较高且细胞状态较好的孔，对应为较适宜的MOI值。

）

2.取病毒（最适的MOI值）感染已经稳定表达cas9的细胞系，于37℃、5%CO2培养箱内继续培养48小时,并同时转导未导入Cas9的细胞做对照。

3.48h以后向细胞添加合适的选择剂量的嘌呤霉素。

嘌呤霉素浓度的摸索:

用培养基稀释嘌呤毒素为1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml、6ug/ml、7ug/ml、8ug/ml、9ug/ml、10ug/ml，并用稀释后的浓度培养细胞，3~5天内使所有细胞死亡的最低浓度可用于筛选细胞。

4.选择成功转导的细胞后，改成正常的完全培养基培养2~7天。

（如果是crispr和cas9分开额双质粒系统，前面导入的就是携带cas9的质粒，带cas9稳定表达后，在这里后就能把构建好的sgRNA文库转染细胞，重复以后的步骤，MOI与加cas9时的相似，然后用相应的抗生素在筛选细胞。

）

5.提取筛选出来的细胞的基因组DNA和未转导sgRNA的细