课时训练1 基因工程与克隆技术.docx

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课时训练1基因工程与克隆技术

课时训练1　基因工程与克隆技术

1.高温胁迫是影响植物生长发育的重要因素之一,高温逆境会使番茄的生长发育受到限制,转入codA基因的番茄对高温的耐受性大于野生型番茄。

（1）如图为质粒限制性核酸内切酶酶切图谱。

codA基因不含图中限制性核酸内切酶识别序列。

为使PCR技术扩增的codA基因能重组进该质粒,扩增的codA基因两端需分别引入　　　　和　　　　不同限制性核酸内切酶的识别序列。

（2）制备番茄的原生质体时,在 环境下用酶解法处理番茄的根尖、叶片等细胞。

（3）导入目的基因的番茄细胞经　　　　形成愈伤组织,通过调节　,可以从这种愈伤组织诱导出芽和根的顶端分生组织,由此再生出新的植株。

（4）番茄的培养细胞在长期培养中,其胚胎发生和器官形成能力下降,可能原因有 

　（写出2点即可）。

解析:

（1）图中看出,两者之间存在三种限制酶切点,但是由于XbaⅠ在质粒上不止一个酶切位点,因此为使PCR扩增的codA基因重组进该质粒,扩增的codA基因两端需分别引入NdeⅠ和BamHⅠ限制酶的识别序列。

（2）根据渗透原理,制备番茄的原生质体时,在0.5～0.6mol/L甘露醇溶液环境下用酶解法处理番茄的根尖、叶片等细胞。

（3）导入目的基因的番茄细胞经脱分化形成愈伤组织,通过调节营养物质和生长调节剂的适当配比可以从这种愈伤组织诱导出芽和根的顶端分生组织,由此再生出新的植株。

（4）番茄的培养细胞在长期培养中,其胚胎发生和器官形成能力下降,可能原因有染色体畸变、细胞核变异、非整倍体产生;细胞或组织中激素平衡被打破、细胞对外源生长物质的敏感性改变;缺乏成胚性的细胞系等。

答案:

（1）NdeⅠ　BamHⅠ

（2）0.5～0.6mol/L甘露醇溶液

（3）脱分化　营养物质和生长调节剂的适当配比

（4）染色体畸变、细胞核变异、非整倍体产生;细胞或组织中激素平衡被打破、细胞对外源生长物质的敏感性改变;缺乏成胚性的细胞系

2.人血清蛋白（HSA）具有重要的医用价值。

如图是以基因工程技术获取重组HSA（rHSA）的两条途径。

（1）如果HSA基因序列未知,可以采用　　　　　　　的方法获取该目的基因,为了使目的基因能够在宿主细胞中复制和稳定保存,通常要先构建　　　　　　　后才能导入宿主细胞。

（2）方框中的“?

”一般选用的生物是　　　　,为了提高Ⅱ过程的导入成功率,通常用　　　　　处理大肠杆菌。

（3）人体合成的初始HSA多肽,需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性,所以,选择　　　　（填“Ⅰ”或“Ⅱ”）途径获取rHSA更有优势。

（4）为了鉴定宿主细胞中是否产生rHSA,可以用　　　方法来进行检验。

A.检验HSA基因是否导入

B.检验细胞中是否产生相应的mRNA

C.抗原—抗体杂交

D.检测是否有标记基因

解析:

（1）获取目的基因的方法有:

从基因文库中获取、采用PCR技术扩增（适用于目的基因的核苷酸序列已知的情况下）、人工化学合成（适用于目的基因较小且序列已知的情况下）。

因此如果HSA基因序列未知,可以采用从基因文库中提取的方法获取该目的基因;为了使目的基因能够在宿主细胞中复制和稳定保存,通常要先构建重组DNA分子（基因表达载体）后才能导入宿主细胞。

（2）将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法,因此方框中的“?

”一般选用的生物是农杆菌;将目的基因导入微生物细胞时常用感受态细胞法,即用氯化钙处理微生物细胞,使之成为易于吸收周围环境中DNA分子的感受态。

（3）由于大肠杆菌是原核生物,其细胞中不含内质网和高尔基体,而人体合成的初始HSA多肽,需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性,所以,选择Ⅰ途径获取rHSA更有优势。

（4）检测目的基因是否表达形成蛋白质可以采用抗原—抗体杂交法。

答案:

（1）从基因文库中提取　重组DNA分子

（2）农杆菌　氯化钙　（3）Ⅰ　（4）C

3.通过农杆菌介导转入法培养转基因植物的过程如图（图中①～④表示相应操作过程）。

请回答:

（1）将外源遗传物质与受体植物细胞（包括原生质体受体）遗传物质重新组合,除了转基因技术外,还有　　　　　　　　　等方法,这些方法解决了传统育种方法存在的　　　　　　　　　　　　　　　的缺陷。

植物原生质体的获取可以在较高渗透压环境下,用　　　　　　　　　酶处理根尖、叶片、愈伤组织或悬浮培养细胞的细胞壁。

（2）如果构建重组细胞的目的是为了获取重要的次生代谢产物（如某些中药）,可以通过大量培养特定　　　　来达成目的。

（3）如果农杆菌侵染对象为某植物叶片,将被侵染的叶片除菌后进行培养,最终得到转基因植物。

下列叙述中正确的是　　　　。

A.愈伤组织在合适条件下经脱分化形成再生植株

B.再生的芽在细胞分裂素含量较高的培养基上生根

C.叶片在含合适浓度生长素的培养基上经再分化形成愈伤组织

D.愈伤组织在细胞分裂素和生长素配比较高的培养基上形成芽

解析:

（1）将外源遗传物质与受体植物细胞（包括原生质体受体）遗传物质重新组合,除了转基因技术外,还有细胞融合或显微注射等方法,这些方法解决了传统育种方法存在的远缘亲本难以杂交（或生殖隔离）的缺陷。

植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶,根据酶的专一性原理去除植物细胞壁应该用纤维素酶和果胶酶。

（2）如果构建重组细胞的目的是为了获取重要的次生代谢产物（如某些中药）,可以通过大量培养特定细胞系来达成目的。

（3）愈伤组织在合适条件下经再分化形成再生植株;再生的芽在细胞分裂素含量较高的培养基上发芽,在生长素含量较高的培养基上生根;叶片在含合适浓度生长素的培养基上经脱分化形成愈伤组织;愈伤组织在细胞分裂素和生长素配比较高的培养基上形成芽。

答案:

（1）细胞融合或显微注射　远缘亲本难以杂交（或生殖隔离）　纤维素酶和果胶

（2）细胞系　（3）D

4.回答克隆技术和胚胎工程有关的问题:

（1）将高度分化的离体植物组织进行培养,脱分化形成　　　　　　　,再诱导出　　　　　　　的顶端分生组织,并由此可再生出新的植株。

（2）利用高度分化的动物细胞进行克隆动物,必须利用　　　　　　　技术形成重组细胞,这种技术需要借助精密的　　　　　　　和高效率的细胞融合法。

（3）胚胎移植的途径主要有两条:

一是体外受精产生受精卵,形成受精卵需经　　　　　　　　,才能进行胚胎移植;二是体内受精,一定时间后从生殖器官中取出早期胚胎移植到受体相应部位。

这两种途径对受体动物的要求是　。

（4）与植物克隆相比动物难以克隆,这是由于在动物发育过程中,细胞出现了　　　　。

A.染色体畸变造成遗传物质的丢失

B.基因突变产生了等位基因

C.基因选择性表达合成了专一蛋白质

D.减数分裂过程中同源染色体配对紊乱

解析:

（1）组织培养技术是在人为创造的无菌条件下将离体的植物器官（如根、茎、叶、茎段、原生质体）、组织或细胞置于培养基内,并放在适宜的环境中,进行连续培养以获得细胞、组织或个体的技术。

其流程是将高度分化的离体植物组织进行培养,脱分化形成愈伤组织,再诱导出芽和根的顶端分生组织,并由此可再生出新的植株。

（2）动物克隆是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术。

不经过有性生殖过程,而是通过核移植生产遗传结构与细胞核供体相同的动物个体的技术。

利用高度分化的动物细胞进行克隆动物,必须利用核移植技术形成重组细胞,这种技术需要借助精密的显微操作仪和高效率的细胞融合法。

（3）胚胎移植的途径主要有两条:

一是体外受精产生受精卵,形成受精卵需经胚胎体外培养,才能进行胚胎移植;二是体内受精,一定时间后从生殖器官中取出早期胚胎移植到受体相应部位。

这两种途径对受体动物的要求是同期发情且未配种。

（4）动物难以克隆的原因是由于基因的选择性表达导致动物的体细胞均已发生了分化,并合成了专一蛋白质,基因组中基因的活动很不完全,不能像受精卵那样发挥细胞的全能性。

答案:

（1）愈伤组织　芽和根　

（2）核移植　显微操作仪

（3）胚胎体外培养　同期发情且未配种　（4）C

5.回答下列与家蚕养殖有关的生态工程与基因工程的问题:

（1）南方养蚕,常建立桑基鱼塘。

桑基鱼塘的核心技术是　　　　。

A.物质的良性循环技术

B.立体养殖技术

C.种植业和畜牧业合理优化技术

D.生物防治技术

（2）通过桑基鱼塘等朴素的生态工程实践,可归纳出的生态工程原理是　　　　　　　　　　　。

（3）丝素蛋白是家蚕的一种分泌性复合蛋白,由丝素蛋白重链（FibH）、丝素蛋白轻链（Fibl）和P25糖蛋白组成。

将Fibl基因导入大肠杆菌（不含质粒A）并实现表达的过程如图所示。

①构建重组质粒时要用到的工具酶是 

　　　　　　　　　　　　　　　　。

②导入时,为了增加大肠杆菌的通透性,常用　　　　　处理大肠杆菌。

③接种在含氨苄青霉素培养基上的大肠杆菌,有的不能形成菌落,原因是　　　　　　　。

④影印接种就是用丝绒做成与平板大小相近的印章,然后把长有菌落的母平板倒置在丝绒印章上,轻轻印一下,再把此印章在新的培养基平板上轻轻印一下。

经培养后,比较新平板上长出的菌落与母平板上的菌落位置,推测可能导入了重组质粒的菌落是　　　　　　（用字母表示）。

⑤目的基因成功表达的标志是　。

解析:

（1）桑基鱼塘主要实现物质的循环利用,因此利用的核心技术是物质的良性循环技术。

（2）生态工程的原理是整体、协调、循环、再生。

（3）①构建重组质粒时,要用到的工具酶是限制性核酸内切酶和DNA连接酶。

②增加大肠杆菌细胞壁的通透性,一般采用CaCl2处理。

③将大肠杆菌接种在含有抗生素的培养基中,若不能形成菌落,则说明未导入相应质粒（或未含有相应抗性基因）。

④分析基因工程所利用质粒可知,普通质粒具有抗四环素和抗氨苄青霉素的抗性基因,因此若具有普通质粒,则具有相应抗性,可在四环素和氨苄青霉素的培养基上存活,而重组质粒的目的基因插入在抗四环素的基因位置,因此重组质粒不能抗四环素,即在四环素培养基中无法形成菌落,因此图示中b、c为导入重组质粒的大肠杆菌。

⑤基因成功表达的标志是产生相应的表达产物,即大肠杆菌能够合成丝素蛋白轻链（Fibl）。

答案:

（1）A

（2）整体、协调、循环、再生

（3）①限制性核酸内切酶和DNA连接酶　②氯化钙　③没有导入质粒　④b、c　⑤大肠杆菌合成丝素蛋白轻链（Fibl）

6.青蒿素是从黄花蒿茎叶中提取的抗疟疾药物。

通过组织培养获得青蒿素的途径如图所示。

请回答下列问题:

（1）图中①和②分别表示黄花蒿组织培养过程中细胞的　　　　和　　　　过程。

（2）配制生芽培养基时生长素与细胞分裂素的比值应较　　　　（填“高”或“低”）。

配制培养基时通常加入凝固剂　　　　。

配制后还须用　　　　　　　法对培养基进行灭菌。

外植体在接种前通常可用体积分数为　　　　的酒精进行消毒。

（3）为了得到高产细胞系,通常要用酶解法获得原生质体,用　　　　酶和　　　　酶在0.5～0.6mol/L的　　　　溶液环境（较高渗透压）下去壁。

（4）科研人员利用转基因技术用细菌作为工程菌获得青蒿素的前体青蒿酸。

先将目的基因与含有抗青霉素基因的载体DNA形成　　　　　　　　,再与细菌菌液混合,导入目的基因。

用玻璃刮刀将稀释后的菌液用　　　　法接种到含　　　　的固体培养基上,经培养形成　　　　　　　,再进一步筛选和培养。

若最终能从细菌中提取到　　　　　　　　,则说明转基因成功。

解析:

（1）植物组织培养的过程包括脱分化和再分化。

（2）培养基中的生长素与细胞分裂素用量的比值低时,有利于芽的分化。

配制固体培养基时,通常用琼脂作为凝固剂。

对培养基彻底灭菌时,采用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌法。

外植体在接种前通常可用体积分数为70%的酒精进行消毒。

（3）在获得植物原生质体时,需在0.5～0.6mol/L的甘露醇溶液环境（较高渗透压）下用纤维素酶和果胶酶混合液处理实验材料,将细胞壁消化除去,获得球形的原生质体。

（4）基因工程过程中,先将目的基因与含有抗青霉素基因的载体DNA形成重组载体DNA分子,再与细菌菌液混合,导入目的基因。

用玻璃刮刀将稀释后的菌液用涂布法接种到含青霉素的固体培养基上,经培养形成单菌落,再进一步筛选和培养。

若最终能从细菌中提取到青蒿素,则说明转基因成功。

答案:

（1）脱分化　再分化

（2）低　琼脂　高压蒸汽灭菌　70%

（3）果胶　纤维素　甘露醇

（4）重组载体DNA分子　涂布　青霉素　单菌落　青蒿素

7.人胰岛素基因的克隆操作过程如图所示,其中mRNA逆转录形成的DNA称为cDNA。

回答下列问题:

（1）提取分离组织细胞中的人胰岛素mRNA时,最应选择　　　　细胞,过程①②需要原料是　。

（2）通过将所有的cDNA构建基因表达载体,去感染细菌,可以建立包括目的基因在内的　　　　　　,若使用质粒载体,其上存在　　　　　　　　　基因,有助于质粒进入受体细胞中。

此过程还可以使用　　　　作为载体（A.动物病毒　B.植物病毒　C.噬菌体）。

（3）除了上述方法外,还可以使用　　　方法扩增目的基因。

不同的是,后者的目的基因若为人胰岛素原基因,需要导入　　　　（填“真核”或“原核”）受体细胞中。

解析:

（1）人体细胞中只有胰岛β细胞可表达胰岛素基因,提取人胰岛素mRNA时,最应选择胰岛β细胞,过程①②为合成DNA的过程,需要（四种）脱氧核糖核苷酸为原料。

（2）通过将所有的cDNA构建基因表达载体,去感染细菌,可以建立包括目的基因在内的基因（cDNA）文库;若使用质粒载体,其上应存在控制质粒DNA转移的基因,有助于质粒进入受体细胞中。

噬菌体可侵染细菌,动物病毒、植物病毒不能侵染细菌,此过程还可以使用噬菌体作为载体。

（3）用PCR技术可扩增目的基因。

PCR扩增的人胰岛素原基因含有内含子序列,原核细胞中缺少转录后切除内含子对应序列的机制,因此应将人胰岛素原基因,导入真核受体细胞中。

答案:

（1）胰岛β　（四种）脱氧核糖核苷酸

（2）基因文库　控制质粒DNA转移的　C

（3）PCR　真核

8.基于哺乳动物细胞表达的基因工程制药行业发展迅速,其中构建稳定表达细胞株是最重要的环节,常见过程为获得目的基因—将目的基因导入宿主细胞—初步筛选—扩增—单克隆化—筛选—驯化—工业生产。

回答下列问题:

（1）如果该目的基因的序列是未知的,我们可以建立一个　　　　　　　,然后在这里面寻找到要研究的目的基因。

（2）为了实现工厂化生产蛋白质类药物,常用CHO细胞（中国仓鼠卵巢的建株纤维母细胞）作为哺乳动物表达系统的宿主细胞,这种细胞应该具有　　　　　能力,从而可以反复传代使用。

为了得到CHO细胞,可以直接将组织从机体中取出后立即进行细胞、组织培养,当细胞从组织块中迁移出来,形成　　　　　并增大后,再传代培养。

（3）利用“裹有重组质粒的脂质体与动物细胞融合”“病毒侵染细胞”是将目的基因导入动物细胞的两种常用方法,前者所用的脂质体结构上由　　　　　分子构成,后者不能用噬菌体的原因是　。

（4）对细胞进行单克隆化培养时,培养基中往往需要添加血清、激素、滋养细胞等,这些措施的目的是 

　　　　　　。

确定生产用的细胞株后,需要对细胞驯化使其适应生产规模下的培养条件,工业生产使用的培养基大多是无血清培养基,这对生物制品的好处有　 

　　　　　　　　　　　　　　　　　　。

解析:

（1）如果该目的基因的序列是未知的,我们可以建立一个基因文库,然后在这里面寻找到要研究的目的基因。

（2）常用CHO细胞可以反复传代使用,故应无限增殖,为了得到CHO细胞,可以直接将组织从机体中取出后立即进行细胞、组织培养,当细胞从组织块中迁移出来,形成生长晕并增大后,再传代培养。

（3）脂质体是由双层磷脂分子构成,噬菌体是专一侵染大肠杆菌的病毒,不能侵染动物细胞。

（4）对细胞进行单克隆化培养时,培养基中往往需要添加血清、激素、滋养细胞等,这些措施的目的是提高细胞克隆形成率,确定生产用的细胞株后,需要对细胞驯化使其适应生产规模下的培养条件,工业生产使用的培养基大多是无血清培养基,这样有利于生物制品的纯化。

答案:

（1）基因文库

（2）无限增殖　生长晕

（3）双层磷脂　噬菌体不能侵染动物细胞

（4）提高细胞克隆形成率　有利于生物制品的纯化

9.科学家用转基因方法培育“巨型小鼠”。

图1为含大鼠生长激素基因的DNA及限制性核酸内切酶切割位点示意图;图2为含有相应标记基因和限制性核酸内切酶切割位点的质粒示意图,其中nptⅡ为卡那霉素抗性基因,Tc为四环素抗性基因,lacZ为蓝色显色基因,复制原点是质粒上必需的一段复制起始的序列,与重组质粒的自主复制有关。

图3是转基因过程中的一个步骤。

（1）根据图1,在获得目的基因时,应使用限制性核酸内切酶　　　　（填“PvuⅠ”或“EcoRⅠ”）进行切割。

可以选择图2中的质粒　　　　（填“A”或“B”）作为目的基因的载体,理由是　 

　。

（2）图3表示基因工程中将重组DNA分子导入受体细胞的过程,该步骤采用的技术方法是　　　　　　　,通常选择　　　　　作为受体细胞。

（3）获得含目的基因的细胞后,该细胞需要进行　　　　　　　　。

然后再进行移植,通常移植最适宜的时期是发育到　　　（A.2细胞胚胎　B.4细胞胚胎 C.早期囊胚　D.原肠胚）。

再经分娩产仔就可以获得“巨型小鼠”。

解析:

（1）分析题图1可以发现,限制性核酸内切酶EcoRⅠ的切割位点处于目的基因中,而限制性核酸内切酶PvuⅠ的切割位点正好位于目的基因两端,所以在获得目的基因时,应使用限制性核酸内切酶PvuⅠ进行切割;分析图2可知,质粒A中的复制原点不会被限制性核酸内切酶切割,复制原点序列保持完整,而在用切割目的基因的限制性核酸内切酶PvuⅠ切割质粒B时,其复制原点会被限制性核酸内切酶切割,从而影响重组质粒的自主复制,因此,可以选择图2中的质粒A作为目的基因的载体。

（2）图3表示基因工程中将重组DNA分子导入受体细胞的过程,该步骤采用的技术方法是显微注射法,通常选择动物的受精卵作为受体

细胞。

（3）获得含目的基因的细胞后,该细胞需要进行胚胎体外培养,然后再进行移植;通常移植最适宜的时期是发育到C早期囊胚,再经分娩产仔就可以获得“巨型小鼠”。

答案:

（1）PvuⅠ　A　选择质粒A,其复制原点就不会被限制性核酸内切酶切割,复制原点序列保持完整

（2）显微注射法　受精卵

（3）胚胎体外培养　C