山楂汁的微生物降酸.docx
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山楂汁的微生物降酸
分类号081401编号2011-21506111
烟台大学
毕业论文
酵母菌生物降解山楂汁中有机酸的研究
StudyonYeastsBiodegradetheOrganicAcids
inHawthornFruitJuice
申请学位：
工学学士学位
院系：
化学生物理工学院
专业：
食品科学与工程
姓名：
李怡
学号：
200721506111
指导老师：
赵玉平（副教授）
2011年06月10日
烟台大学
酵母菌生物降解山楂汁中有机酸的研究
姓名：
李怡
导师：
赵玉平（副教授）
2011年06月10日
烟台大学
烟台大学毕业论文任务书
院（系）：
化学生物理工学院
姓名
李怡
学号
200721506111
毕业届别
2011
专业
食品科学与工程
毕业论文题目
酵母菌生物降解山楂汁中有机酸的研究
指导教师
赵玉平
学历
博士
职称
副教授
所学专业
发酵工程
具体要求：
1）认真查阅相关资料，弄清实验目的、意义，搞好整体设计。
2）认真探索实验方法，找出实验关键。
3）熟练实验操作技术，保证实验数据的准确性。
4）实验数据真实可靠，文献引用要合理，论文撰写要规范。
主要内容：
从天然果皮中富集、分离、纯化筛选出不同酵母菌，并接种到相同pH，不同体积的山楂汁中，山楂汁主要含柠檬酸，通过摇瓶培养，测定总酸、柠檬酸、黄酮含量的变化，比较酵母菌降酸情况并分析讨论，分离出能够有效降解柠檬酸且保留黄酮的菌种。
主要参考资料：
[1]CletusP．KurtzmanW．TheYeast，ATaxonomicStudy[M]．ElseriverAmsterdam．Lausanne．NewYork．Oxford．Shannon．Singapore．Tokyo，1998
[2]沈萍．微生物学实验[M]．北京：
高等教育与出版社2007.11:
28-34，51-56
进度安排：
第1-2周：
确定论文题目，布置文献查阅相关事宜，写开题报告。
第3-9周：
进行实验并记录实验数据
第10-11周：
实验数据整理分析
第11-14周：
论文写作
指导教师（签字）：
年月日
院（系）意见：
教学院长（主任）（签字）：
年月日
备注：
[摘要]山楂汁中主要含有的是柠檬酸，文章主要从天然水果皮中通过微生物的富集、分离、纯化，筛选出不同种类的酵母菌，并将它们接种到山楂汁中，摇瓶培养，观察、检测它们柠檬酸的生物降解的情况。
并得到一种或几种既能很好的降解酸又能保持山楂汁中黄酮含量稳定的酵母菌菌种。
关键词：
山楂汁；酵母菌；柠檬酸；黄酮；生物降解
Abstract：
Hawthornjuicecontainsplentyofcitricacid,thearticlemainlyfromthestationbyyeaststhroughtherindenrichment,separation,purification,andchoosedifferentkindsofyeasts.Thenvaccinatethemtothehawthornjuiceandflaskculture,thentoobserveandexaminetheirbiodegradationofcitricacid.Finallywewanttogetoneorseveralyeastscanbothverygooddegradationacidandkeephawthornjuiceflavonoidcontentstableyeaststrain.
Keywords：
hawthornjuice;yeast;citricacid;flavonoids;biodegrade
目录
1前言1
2实验材料2
2.1菌种的筛选与鉴定2
2.1.2菌种的选择2
2.1.2菌种的来源2
2.1.3筛选方法2
2.2山楂汁的制作3
3实验方法4
3.1山楂汁的降酸发酵4
3.2柠檬酸的测定4
3.3黄酮的测定4
4实验结果分析与记录6
4.1菌种的筛选分析6
4.2酵母菌的富集培养分析6
4.3山楂汁的降酸发酵分析8
4.3.1柠檬酸分析8
4.3.2黄酮分析10
4.3.3高效液相色谱图分析12
5实验结果17
6结论18
致谢19
参考文献20
1前言
山楂（Crataeguspinnatifida）蔷薇科，苹果亚科，山楂属植物，别名：
山里果、红果。
多指其果实。
可食用，质硬，肉薄，味酸涩。
山楂的产地很广，遍及大江南北，主要有山东、河南、浙江、湖北等地，多为秋季采摘食用。
自古以来，山楂具有非常重要的药用价值，中医常视之为治病良药，主治：
开胃健脾、活血化痰、消食化滞、收敛止痢、伤风感冒、胸膈脾满、食欲不振、儿童缺铁性贫血症、儿童软骨缺钙症等。
山楂中含有多种对人体有益的营养成分，如淀粉、糖类、蛋白质、脂肪、胡萝卜素、维生素C、苹果酸、枸杞酸、铁和钙的物质[1]。
山楂的所含物质还能够通过增强心肌收缩力、扩张冠状动脉血管、增加心脏血液输出量、降低心肌耗氧量、增加冠状动脉血流量等有效地降血脂、血压和强心、抗心律不齐、心绞痛等功效。
但是，起关键作用的是山楂中的黄酮类物质[2]。
目前，已经从山楂中分离出30余种黄酮成分，有含碳键的黄酮苷类、双氧黄酮苷类、黄酮醇及其苷类、聚合黄酮类。
黄酮类化合物具有抗氧化、抗肿瘤、抗突变和保护心血管的多种特殊的生物功能作用，是植物化学物近些年的研究热点[3]。
正因为它维护心脑血管的如此功效，在应用中就要尽可能地保留黄酮类物质等重要成分，在改善色、香、味等口感的基础上，使山楂类产品更能为广大消费者所接受。
在山楂汁的制作过程中最显著的特点就是山楂汁所含有的大量有机酸，如柠檬酸、酒石酸、L-苹果酸、山楂酸、咖啡酸、绿原酸、齐墩果酸等[4]。
它们的含量限制了对山楂的有效利用[5]。
因此，文章就是要利用生物化学或者物理化学的方法降解其中的有机酸，提高其pH值，并保留其黄酮含量的稳定。
山楂汁的降酸方法有很多，如稀释降酸法、酒石酸沉淀法、碳酸钙沉淀法、吸附树脂降酸法、碱中和法、电渗析法等物化方法和微生物在有氧条件、厌氧条件[6]下的发酵降酸。
其中，物化方法虽简单易行，降酸作用显著，但是对山楂汁的其它成分的影响较大，很难平衡其组成，在生产试验当中达不到理想效果。
而这篇文章主要介绍微生物在有氧条件下对山楂汁降酸情况的研究且以柠檬酸含量为检测标准，通过有效的手段分析比较然后筛选出保留黄酮的酵母菌，并测定它的降酸情况，观察其形态及生长规律。
2实验材料
2.1菌种的筛选与鉴定
2.1.1菌种的选择
自然界中能够利用柠檬酸的微生物分布广泛，种类繁多，有细菌、酵母菌、霉菌等。
相比于细菌、霉菌，酵母菌的优势在于其低pH的高生长活力；各个阶段生长非常有规律、新陈代谢各个环节条理明晰，且产物、菌体易于分离，符合现代提倡的安全卫生的操作管理理念；此外，酵母菌菌体及其菌体蛋白[7,8]还能充分回收利用，广泛用于其它工业化生产工艺，如细胞工程、发酵工程、酶工程等等，是资源配置优化的一种手段。
天然存在的酵母菌通常具有以下5个特点：
单细胞状，多营出芽生殖，发酵糖产能，壁多含甘露聚糖，于含糖高、酸度大的水生环境中生存[9]。
其中，以柠檬酸作碳源彻底氧化分解或经糖异生途径利用柠檬酸转化为另一种物质能同化柠檬酸的酵母菌据文献记载有400多种[10]。
因此，从酵母菌中筛选出能够降解柠檬酸的菌种是可能的，而理想的目的菌种应具有以下9种特征：
（1）通过自身代谢分解总酸中的柠檬酸，使pH上升。
（2）保留黄酮等生物活性物质。
（3）不影响山楂汁风味或优于山楂汁风味。
（4）能提供山楂汁生产过程所需的一些诱导物或酶等。
（5）菌体易分离获取。
（6）菌种遗传物质稳定，抗逆性强，不易变异。
（7）菌体能回收用于其它生产[8]。
（8）初级、次级代谢产物不产生抗生素、毒素、过敏原等对人体健康有害的物质。
（9）发酵后废液经处理不造成环境污染。
2.1.2菌种的来源
酵母菌分布在自然界偏酸含糖的环境中，如水果、花、树皮和果园土壤中[11]。
实验小组4人分别搜集了烟台山楂、莱阳梨、海南芒果、南方菠萝这4种水果的若干表皮组织且编号为1、2、3、4，用以分离天然降酸的菌种。
培养基[10]的选择与配制：
富集培养基：
柠檬酸20g，硫酸铵5g，硫酸镁0.24g，磷酸二氢钾1g，酵母膏0.2g，氯化钠0.1g，无水氯化钙0.1g，溶于1L去离子水中。
固体分离培养基：
琼脂25g，硫酸铵5g，硫酸镁0.24g，酵母膏0.2g，磷酸二氢钾1g，氯化钠0.1g，无水氯化钙0.1g，将其溶于800mL去离子水中；同时，将20g柠檬酸溶于200mL水中；湿热灭菌115℃约15min，冷却至45℃-50℃，混合，取洁净灭菌培养皿，倒平板。
保存培养基：
葡萄糖、琼脂各取2%（w/v），蛋白胨1%（w/v），酵母膏0.5%（w/v）。
2.1.3筛选方法
预处理：
分别取面积为25cm2未经清洗的新鲜水果皮样品于250mL的锥形瓶中，每个瓶中各加入100mL经湿热灭菌冷却后的富集培养基，并放入摇床，室温下70r/min摇瓶培养1d，观察培养液的浑浊程度。
浑浊程度是菌体数量的客观反映。
因为，刚接入培养基时，微生物需要进入一个调整期，产生相应的酶系，才能进一步生长、繁殖；所以，若与前一天相比浊度变化不太明显，一方面是微生物处于适应阶段，未出现繁殖现象，另一方面是果皮上的微生物种类不能利用该培养基，不适应该环境，不能生长。
当出现以上情况时，则需要再培养1d，观察并记录现象。
相反，若培养液变浑浊了，且散发出淡淡的酒香，则应取出静置至澄清，视情况取一定体积的上清液，弃去废液。
菌种富集：
分别取上述4种预处理上清液各1mL于250mL锥形瓶中，每个瓶中各加入100mL经湿热灭菌冷却后的富集培养基，室温下70r/min摇瓶培养1d，同预处理方式一样，观察记录培养液的浑浊程度。
依次富集、转接、富集，相同条件下连续转接培养5-6次后，酵母菌即成为优势菌种。
此后，需根据菌体的数量级确定菌种分离的稀释倍数。
菌体的计数方法采用血球板计数法[12]，该法属于显微镜直接计数法，操作步骤大致为：
用无菌吸管吸取少许适当稀释后的酵母菌液，从计数板盖玻片一端注入，菌液渗入其中后静置几分钟，用吸水纸吸去多余菌液，最后显微镜观察计数。
通常取血细胞计数板5个中方格的总菌数再求得每个中方格的平均值，该值乘上25或16就得出整个大方格中的总菌数，然后再换算成1mL菌液中的总菌数，即1mL菌液中总菌数=A／5×25×104×B（以25个中方格计数板为例，A为总菌数，B为稀释倍数）。
菌种分离[12]：
稀释涂布平板法：
吸出0.1mL稀释后的菌液于培养皿中，使用玻璃涂棒均匀涂抹在固体培养基上。
平板划线分离法：
使用接种环挑取悬液一环在培养基上划线分离，完毕后，盖上培养皿盖。
上述操作均在无菌环境下进行，20℃温室培养4d-5d，获得单个菌落。
观察比较菌落的不同特点并编号。
保存4：
采用冰箱保藏法或石蜡油封藏法保存菌种。
菌种鉴定：
翻阅文献，对照菌种的相关特征然后归类。
2.2山楂汁的制作
市售山楂鲜果，产地为山东烟台。
选取其它实验材料和仪器为山楂果、果胶酶、打酱机、恒温水浴锅、加热锅、离心机、烧杯。
取鲜山楂果若干，经清洗后选择完好无损、成熟饱满、色泽鲜亮的果子加1:
1（w/v）水，并加热100℃保温1min-5min或煮沸5min-8min，其中经过预煮程序能使山楂充分吸水，破坏山楂中的酶成分，防止固有营养成分的分解。
然后打浆、冷却至45℃左右，加入6U/mL-10U/mL果胶酶，混匀保温酶解6h，最后离心得山楂汁。
经消毒灭菌后，常温或低温密闭保存。
3实验方法
3.1山楂汁的降酸发酵
在第6次富集转接培养时，每天测定总酸，培养5d-6d，记录富集培养基中各培养基中总酸的变化情况。
取50mL和100mL的山楂汁各一份分别倒入250mL相同规格的锥形瓶作为一个实验小组，然后将分离纯化培养后的其中一种酵母菌接种到这两瓶山楂汁中，室温下，80r/min摇瓶培养14d左右，测定山楂汁中柠檬酸的变化情况。
取4种等量不同种类的菌液，分别接种在250mL相同规格的锥形瓶100mL的山楂汁中，室温下，80r/min摇瓶培养5d-6d，测定山楂汁中黄酮的变化情况。
3.2柠檬酸的测定
采用酸碱滴定法测定[13,14]：
0.1mol/LNaOH标准液的配制：
用小烧杯在电子天平上称取固体氢氧化钠4g，加100ml蒸馏水，待氢氧化钠完全溶解，冷至室温后倒入1000mL容量瓶，加水至刻度，摇匀，备用。
然后用配好的氢氧化钠标准溶液滴定邻苯二甲酸氢钾水溶液至微红色，且半分钟内不褪色为止。
记录消耗氢氧化钠的毫升数和使用邻苯二甲酸氢钾的克数并计算氢氧化钠溶液的当量浓度，保存标液。
用移液管取1mL山楂汁样品于250mL锥形瓶中，加入10mL去离子水稀释，加2滴至3滴酚酞指示剂。
用已标定的氢氧化钠标准溶液滴定样品至微红色且半分钟内不褪色为止。
记录氢氧化钠标准溶液消耗量。
以中和样品中柠檬酸为标准，计算柠檬酸的含量。
采用高效液相色谱法测定[15-17]：
流动相：
使用超纯水（电阻率≥18MΩ/cm2）配制成2.50%磷酸二氢铵溶液，并用浓H3PO4调pH至2.50，然后用0.45μm的纤维素膜进行超滤，超声波脱气。
标准有机酸溶液的配制和标准有机酸图谱的制作：
标准有机酸采用柠檬酸、酒石酸、草酸、乳酸、苹果酸、乙酸，分别用流动相配制成浓度为50mg/L，1000mg/L，1500mg/L，2000mg/L，2500mg/L的标准样品溶液并配制浓度分别为15000mg/L，20000mg/L，25000mg/L，30000mg/L，35000mg/L的柠檬酸标准样品溶液。
然后制作单一酸的标准峰图和混合酸的标准峰图。
样品处理：
精确吸取2mL样品后，用7.5mL95%乙醇沉淀大约2h，超声30min后，以3000r/min离心10min，取上清液5mL置于干燥箱里在60℃下直至乙醇完全蒸发，取出干燥后表面皿，加入1mL流动相，将固形物全部洗下之后，经微孔滤膜（0.45μm）超滤利用高效液相色谱仪进行测定。
色谱条件：
色谱柱选用Phenomenexprodigy5μODS3100A（250mm×4.60mmi.d.，5μm）；流动相的流速为1mL/min；柱温为18℃-20℃；紫外检测波长为210nm；进样量为5μL。
3.3黄酮的测定
黄酮标准曲线的制作方法[18]：
准确称取50.1mg干燥好的芦丁标准样品，定容于50mL容量瓶中，分别吸取0.0mL，0.5mL，1.0mL，1.5mL，2.0mL，2.5mL，3.0mL，3.5mL，4.0mL，4.5mL，5.0mL，5.5mL，6.0mL，6.5mL定容后的芦丁标准品于50mL容量瓶中，首先加5%的亚硝酸钠溶液2.0mL，均匀混合后放置6min；然后加10%的硝酸铝溶液2.0mL，均匀混合后放置6min；再加入1mol/L的氢氧化钠溶液10mL，最后加水定容至刻度，摇匀，放置15min，3000r/min离心10min，取上清液于510nm处测定吸光度值。
对黄酮含量与吸光度的对应数值进行回归，回归方程为W=3.9508x-0.0667。
其范围是0.0mg/mL-12.0mg/mL，线性关系R=0.9972。
山楂汁中黄酮含量计算：
吸附山楂汁1mL，加入5mL95%的乙醇，置于超声波清洗器中30min，3000r/min离心10min，取上清液1mL，置于50mL容量瓶中，以下操作同标准曲线，测得山楂汁吸光度A，根据标准曲线回归方程计算黄酮的含量。
4实验结果分析与记录
4.1菌种的筛选分析
在实验中，鉴于实验要求筛选出的酵母菌的天然生存环境和生活方式，我们选取了天然新鲜水果的部分表皮组织用来筛选可降酸的酵母菌菌种，获得了几种目的菌种，果皮用保鲜膜覆盖保存。
总结成功获得酵母菌菌种的原因有以下4点：
（1）天然水果皮上含有丰富的有机物，如糖类、蛋白质、无机盐、有机酸等，是微生物生长繁殖的理想环境。
（2）水果外表皮与空气接触，便于筛选在有氧环境下能充分降解柠檬酸的菌种。
虽然多数酵母菌是兼性厌氧型微生物，但是与无氧环境相比有氧环境生命活动更旺盛，有机物利用更完全。
（3）每种果树生长的自然环境和分布情况不同，因此，不同种类水果皮上附着的微生物有很大的区别，所以选取的水果种类越多，菌种资源越丰富。
（4）实验材料来源广泛，简单易采集，便于重复筛选，获得更多的菌种。
4.2酵母菌的富集培养分析
富集培养基是根据待分离微生物的特点设计的培养基，用于从环境中富集、分离某种微生物的培养基。
其筛选菌种的方法区别于选择培养基，是使目的菌种在培养液中相对于其它菌种生长快，因此菌体数量明显增多，因富集而占优势并逐步引向纯培养的一种培养技术。
使用富集培养基的主要优势在于免去了选择培养基的选择再富集的复杂实验操作步骤，节省时间、器材、药品和简化操作程序，在将菌种培养到一定的时间之后就可直接进入菌种的分离培养阶段。
在培养基成分的选择可参阅文献得到山楂汁中总酸的含量为19.6g/L，其中柠檬酸的含量为16.37g/L，占总酸含量的83.5%。
为了获得能够在山楂汁中同化高浓度柠檬酸的酵母菌菌种，富集培养基中柠檬酸的含量应控制在20g/L，且以柠檬酸作为酵母菌生长代谢途径中的唯一碳源，培养基主要成分为葡萄糖-蛋白胨-酵母膏等。
在pH值的确定时应选择等于或者低于山楂汁pH值2.95的培养基，目的是筛选耐酸的酵母菌菌种，而本实验配制中有柠檬酸，pH值为2.5因此不用调整。
培养基中总酸的变化见表1
表1富集培养总酸的变化（g/L）
Tab1Changeoftotalaciditybyenrichedculture（g/L）
天数
样品1
样品2
样品3
样品4
1d
20.00
20.00
20.00
20.00
2d
16.52
17.64
20.00
20.00
3d
9.80
14.14
11.62
19.74
4d
4.20
7.63
3.50
2.80
5d
3.85
6.65
2.87
2.73
由表1中可以看出，在培养的过程中，总酸含量是随着时间的增加而减少的。
在5d之内，培养基中总酸由原来的20.00g/L下降到7g/L以下，甚至某些样品到3.00g/L左右。
说明培养基中含有能够利用柠檬酸作为碳源的酵母菌。
而实验的目的就是筛选出这几种能够降酸的酵母菌。
因此，通过分离、纯化能够达到我们的要求。
图1富集培养总酸的变化（g/L）
Fig1Changeoftotalaciditybyenrichedculture（g/L）
图1是根据表1的总酸变化而作的图形，形象的反映了酵母菌富集培养5d的降酸过程。
在1d-2d内，总酸下降较缓慢，首先由于菌种处于停滞期，需诱导产生能够利用柠檬酸发酵有关的酶系，其次菌种数量较少，柠檬酸的消耗量很小，因此利用率较低，图中曲线较平缓。
在3d-4d内，总酸下降幅度较大，原因是菌种开始大量繁殖，菌体数量大幅度增加，而加快了柠檬酸循环整个过程，并且随循环次数递增，底物柠檬酸含量与菌体数量达到平衡状态，柠檬酸有规律的减少。
在4d-5d时，总酸含量趋于稳定，主要原因是菌种数量已达饱和或者开始有下降的趋势，其中有很多因素开始制约降酸的进行，如营养物质、pH值、代谢产物、菌种自身的生长状态等。
所以应以5d为观察期限记录酵母菌富集培养降酸的全过程，超过这一范围，柠檬酸的含量基本保持不变，利用率几乎很小。
4.3山楂汁的降酸发酵分析
4.3.1柠檬酸分析
实验小组选取了50mL和100mL的山楂汁接种相同品种的酵母菌作对比分析，数据记录如下表2所示。
表250mL和100mL样品山楂汁降酸（g/L）
Tab2Degradetheacidof50mLand100mLhawthornjuice（g/L）
天数
50mL
100mL
0
31.00
37.00
1
31.00
37.00
2
30.38
36.40
3
29.40
37.10
4
28.70
37.10
5
29.00
37.10
6
28.00
36.40
7
27.49
36.30
8
15.54
33.81
9
9.66
30.80
10
8.33
29.47
11
5.60
25.90
12
4.90
23.80
不同体积摇瓶培养的山楂汁的降酸能力有很大区别，影响降酸的因素有很多，以下是每个因素的具体分析：
（1）溶氧量：
本实验筛选的是在有氧条件下发酵柠檬酸的酵母菌，而摇瓶培养的目的就是增加酵母菌微生态环境的溶氧量。
在相同形状等体积的锥形瓶中，50mL山楂汁与空气的接触面必然大于100mL山楂汁与空气的接触面，因而50mL溶氧量多，100mL溶氧量少。
酵母菌在培养液中的分布也有所不同，需氧型的菌种分布在培养液的上层，兼性厌氧型主要分布在培养液的中层，但在上、下层均有分布，厌氧型则分不在下层。
当菌种数量相同时，上层培养液的液面越小，需氧型酵母菌的分布越密集，对于氧的消耗量更加明显。
因此，在自身溶氧量不足的情况下，如果耗氧量增加，它的降酸能力显然应下降。
（2）生长时期：
酵母菌的生长同其它微生物一样都要经历4个阶段，调整期、对数期、稳定期、衰亡期。
其中，调整期使其适应酸性环境；对数期的菌体生长活跃，代谢水平处于很高的标准，这一时期柠檬酸等有机碳源的利用率很高，为菌体提供大量的能量和细胞生长物质；稳定期也能高效利用有机酸进行各种代谢产物的生产；衰亡期，菌体数量开始呈现负增长，生理结构也发生相应的变化，营养物质利用率相对较低，因此此阶段总酸变化保持在相对稳定的状态。
（3）菌龄：
菌种传代次数越多，母体衰老程度越大，代谢能力越弱，物质利用越不完全。
（4）营养物含量：
理想的环境条件下，随菌体数量的增加，降酸效果应越显著，但是在实验条件等有限的资源下，降酸程度应受到底物的制约。
因此，营养物质消耗量越多，菌体的生长环境越恶劣，菌体就越早进入衰亡期，由
（2）可知衰亡期的降酸效果差。
其次，营养
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