如何进行完整的靶向代谢组方法开发.docx

如何进行完整的靶向代谢组方法开发.docx

《如何进行完整的靶向代谢组方法开发.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《如何进行完整的靶向代谢组方法开发.docx（7页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

如何进行完整的靶向代谢组方法开发

靶向代谢组学属于代谢组学的一个分支，代谢组学和基因组学、蛋白组学等共同组成系统生物学大家庭，如下图：

从代谢组学的角度，靶向代谢组开发是基于广靶分析的再次验证，也就是对生物机体中广泛筛查后的物质成分，给出准确的定量分析结果。

主要针对生物机体中分子量小于1000的特定物质或特定类型的成分，包含机体各种代谢途径下的中间产物、底物和或相关标志物，比较常见的类型如氨基酸、核苷酸、糖类、脂肪酸、胆汁酸、氧化脂质等等。

靶向代谢组方法开发常用的有绝对定量和相对定量，其区别在于绝对定量需配制不同梯度的已知浓度标准品，绘制标准曲线计算出准确的含量，而相对定量则无需提供标准曲线及计算准确含量，仅提供目标成分的响应即可。

如何建立科学的靶向代谢组学分析方法？

一般而言，完整的靶向方法开发包含文献调研，样品前处理开发，仪器方法开发，方法学验证等环节。

下面以基于质谱分析建立靶向代谢方法学开发进行说明。

一、文献调研

查阅国内外学术期刊，分析样品处理方法、检测方法、定量限等，核心的目标是确定方法开发的可行性并给出实验方案。

后续的开发过程，都基于文献调研的结果。

首先确定样本的类型和待分析物的类别。

每种类别都有各自的理化性质和特点。

其次，文献查询的关键词要准确规范，目的就是为了保证文献查询的精准、全面。

文献搜索的范围，包括中英文期刊论文、国家标准或行业标准、相关专利等。

如下图显示的是常用的几个搜索工具或数据库：

图1：

知网查询

图2：

SCI-HUB查询

图3：

PubMed查询

图4：

国家标准查询

除此之外，还有XX学术，谷歌学术，Webofscience，chemspider，pubchem等网上资源，相关的文献资料也很多。

文献筛选也需要考虑其权威性，同时关注相关领域最权威的实验室和最新的研究文章。

二、样品前处理开发

由于生物样品的基质复杂，待分析物的含量较低（一般为ng/L或μg/L）,因此对方法的灵敏度和精密度有着更高的要求，那么样品前处理就显得尤为重要。

通常，前处理优化包含取样量、提取溶剂、提取方式、样品净化或浓缩等。

取样量根据样本特性选择，也根据待分析目标确定，血浆、组织、细胞、尿液等都有常规的取样原则。

提取溶剂的选择主要依据物质的理化信息，可以综合各种文献的结果进行确认，同时需要明确并注意的是样品提取环节，是否需要避光？

是否需要低温环境？

是否需要增加稳定剂（如抗氧化、调节酸碱度）？

等等。

如果目标物在样品含量极低，或目标物受基质干扰较大，需要考虑样品的富集或纯化，常见的方法如溶剂萃取、过固相萃取小柱、大孔树脂纯化、脱脂处理等，具体方案依照文献查询的结果综合考虑。

有时为了提高待分析物的可检测性，可考虑衍生化处理。

如用GC-MS方法开发糖类成分、脂肪酸类成分时，就需要考虑采用衍生化试剂处理。

样品前处理方案，是要在保证提取完全的基础上，避免目标物的降解、转化，降低基质干扰，以提高方法的灵敏度。

但对于大批量样品的分析，前处理方法还需要考虑过程的简单，避免过多的试剂和提取过程引入的误差。

下图所示为常见的几种前处理方法。

三、检测方法开发

检测方法开发和样品前处理开发是紧密相关的环节，这里以LC-MS/MS为例进行说明（注：

LC-MS/MS是代谢组研究中最为常用的方法），主要分两个部分：

一是色谱方法，二是质谱方法。

1.色谱方法开发

首先需要决定的是色谱柱类型。

常用的是C18色谱柱，特定类型的成分，可以选择其他极性色谱柱如氨基柱、氰基柱、糖柱等，具体可以参照相关专业书籍进行选择。

其次需要确定流动相和梯度体系，流动相的选择和待分析物酸碱性相关。

一般而言，酸类成分，流动相中添加乙酸、甲酸等，可以改善拖尾；​碱性成分，主要添加氨水等；对酸碱敏感的目标物，一般在流动相中添加缓冲盐。

梯度的选择也根据目标物性质进行开发。

文献资料中的方法不能完全照搬，在实际开发的过程中需要进行优化，因为色谱柱品牌不同、仪器性能不同，流出曲线是有差异的，需要根据实验情况选择最为合理的方案，保证待测目标成分和干扰物相互分离，保证较好的响应，以及调整流动相比例优化最佳的出峰时间。

需要特别注意的是，HPLC方法中的流动相并不是都能直接转移到质谱端，难挥发或不能挥发的缓冲盐进入质谱后，容易在离子源处形成结晶体，甚至损坏质谱硬件。

如果采用UPLC方法代替HPLC方法，色谱柱、流动相、流速、进样量都应该相应调整。

2.质谱方法开发

质谱开发多针对的是三重四级杆质谱，这里涉及到母离子Q1的确认和碎片离子Q3等信息，所以一般而言，质谱方法开发的第一步是建立标准品的质谱方法，通常可通过针泵进样的方式确定离子对信息和检测参数。

例如分析样品中维拉帕米，在文献查阅环节，已明确目标物的分子式、结构式、溶解性。

见下图

（图片来自ABSCIEX）

通过针泵直接进样（大致1ppm浓度），在Q1环节，确定找到标准品的母离子。

这里要特别注意的是，母离子有很多加合形式，如M+H、M-Cl、M-Na等，所以在判断母离子时，不能仅依照物质的摩尔分子量，还需要考虑目标物的电离特性。

在对母离子响应不确定的时候，可以增加梯度浓度的标准品，观察峰面积是否等比例增加。

找到母离子后，需通过调节碰撞能CE，确定碎片离子，即子离子。

为了提高子离子的响应，需进一步对碰撞能CE和去簇电压DP等参数进行优化。

碰撞能CE不同，碎片的相对丰度不同，根据最大响应值，选择最佳的碰撞能。

去簇电压DP是为了消除溶剂离子簇，DP越大，去簇效果越好，DP太大会造成离子源内裂解。

（图片来自ABSCIEX）

质谱参数的选择还有很多，可以根据实际情况调整，不同的仪器有不同的最佳参数，主要目的是保证待分析物有最佳的响应值。

离子对的选择一般至少2组，一组作为定量离子，一组作为定性离子。

标准品开发环节，还涉及内标物质的确定，一般而言，最好的内标物是同位素内标，与标准品有相同的色谱行为，相同的基质效应，可以更为准确的实现目标物的绝对定量。

标准品开发完成后，可以进行实际样品的预实验，确定样品中目标物的大致范围，优化色谱梯度比例，根据响应值调整进样量、进样浓度等信息，同时观察是否有基质干扰，是否需要进一步纯化等等。

四、方法学验证（仅针对绝对定量方法）

任何方法的开发和应用，都需要一个评价标准，或是一个指导原则，来确定方法的可行性和准确性。

质谱分析多涉及生物样品，药典附录中《生物样品定量分析方法验证指导原则》便是一个重要方法学验证参照。

这里面定义了方法学考察的要求，也规定了质控指标。

要提交完整的开发方案，方法学验证中至少应该涉及：

标准曲线（线性关系）、检出限和定量限、回收率、日内日间精密度等。

标准曲线需要尽量涵盖待测样品的含量区间，一般覆盖三个数量级，并满足相关系数在合理的范围，如下图。

建立标准曲线的同时，也需要给出定量限和检出限指标，定量限（LOQ）以10倍噪音为基准。

回收率主要是考察方法的可靠性，一般达到80%-120%之间为宜，由于生物样品的复杂性，存在复杂基质干扰的情况下，待分析物质含量极低的情况下，回收率范围可以适当放宽。

日内日间精密度，为均匀样品多次重复测定所得结果的一致性，在一天之内进行的精密度考察称为日内精密度；在三天之内进行的精密度考察称为日间精密度。

以上是靶向代谢组方法开发的一个基本流程。

实际的开发中往往更复杂，可能还涉及质控指标的建立，数学建模分析，报告输出等等。

可为各医院、科研院所、医药企业等提供代谢组鉴定与分析、跨组学分析服务，帮助其对肿瘤早期标记物进行筛选，为新药研发和疾病机制的研究提供新思路。

通过广泛靶向代谢组检测技术的研究方法，对肿瘤患者和正常人群样本测定代谢谱，描述代谢物质在不同样本中的分布情况，找到与肿瘤相关的差异代谢物，并开展mGWAS（代谢组全基因组关联分析）研究，准确定位相关的候选基因，解析代谢途径，对肿瘤发生机制有更全面认识，找到预防或者干预的方法，为药物研发提供靶点。

在多组学层面识别患者个体差异，做到个体化治疗，施以适当的药物干预，进行药效评估，实现准确医疗。

目前，除总部武汉，迈维代谢在深圳、嘉兴、南京、北京均设有分公司，并在全国各大城市建立了直销体系，创新的服务得到广大客户的好评。