生物化学实验指导LSW.docx

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生物化学实验指导LSW

实验一植物DNA的提取与测定

一、目的

本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA的原理和方法，进一步了解DNA的性质。

二、原理

细胞中的DNA绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。

提取DNA时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA从抽提液中沉淀出来。

DNP与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。

以NaCl溶液为例：

RNP在0.14mol/LNaCl中溶解度很大，而DNP在其中的溶解度仅为纯水中的1％。

当NaCl浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP的溶解则随之不断增加。

当NaCl浓度大于1mol/L时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2倍，因此通常可用1.4mol/LNaCl提取DNA。

为了得到纯的DNA制品，可用适量的RNase处理提取液，以降解DNA中搀杂的RNA。

关于植物总DNA的提取主要有两种方法：

1．CTAB法：

CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammoniumbromide,简称CTAB）：

是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3mol/LNaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。

2．SDS法：

利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（sodiumdodecylsulfate，十二烷基硫酸钠）使DNA与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。

一般生物体的基因组DNA为107~109bp，在基因克隆工作中，通常要求制备的大分子DNA的分子量为克隆片段长度的4倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。

因此有效制备大分子DNA的方法必须考虑两个原则：

（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质（如多酚、类黄酮等）、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNase对DNA的降解。

（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。

几乎所有的DNase都需要Mg2+或Mn2+为辅因子，故实现

（1）尽量去除蛋白质的要求，需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在较低温度下进行（一般利用液氮或冰浴）。

为实现

（2）需要在DNA处于溶解状态时，尽量减弱溶液的涡旋，而且动作要轻柔，在进行DNA溶液转移时用大口（或剪口）吸管。

提取的DNA是否为纯净、双链、高分子的化合物，一般要通过紫外吸收、化学测定、“熔点”（meltingtemperature,Tm）测定、电镜观察及电泳分离等方法鉴定。

本实验采用CTAB法提取DNA并通过紫外吸收法鉴定。

三、实验材料、主要仪器和试剂

1．实验材料

新鲜菠菜幼嫩组织、花椰菜花冠或小麦黄化苗等

2．主要仪器

（1）高速冷冻离心机

（2）751型分光光度计

（3）恒温水浴

（3）液氮或冰浴设备

（4）磨口锥形瓶

3．试剂（CTAB法）

（1）CTAB提取缓冲液：

100mmol/LTris-HCl（pH8.0），20mmol/LEDTA-Na2，1.4mol/LNaCl（如表1），2%CTAB，使用前加入0.1%（V/V）的β-巯基乙醇。

表1CTAB提取缓冲液配制

试剂名称

M.W.

配制1000ml

配制500ml

Tris

121.14

12.114g

6.057g

EDTA-Na2

372.24

7.4448g

3.7224g

NaCl

58.44

81.816g

40.908g

用HCl调

pH值。

（2）TE缓冲液：

10mmol/LTris-HCl,1mMEDTA（pH8.0）。

（3）DNase-freeRNaseA:

溶解RNaseA于TE缓冲液中，浓度为10mg/ml，煮沸10～30min,除去DNase活性，－20℃贮存（DNase为DNA酶，RNase为RNA酶）。

（4）氯仿-异戊醇混合液（24:

1，V/V）：

240ml氯仿（A.R.）加10mL异戊醇（A.R.）混匀。

（5）3mol/L乙酸钠（NaAc，pH6.8）：

称取NaAc·3H2O81.62g，用蒸馏水溶解，配制成200ml，用HAc调pH至6.5。

（6）无水乙醇

TE缓冲液，Tris-HCl（pH8.0）液，NaAc溶液均需要高压灭菌。

四、操作步骤

（1）DNA抽提

1．称取2～5g新鲜菠菜幼嫩组织或小麦黄花苗等植物材料，用自来水、蒸馏水先后冲洗叶面，用滤纸吸干水分备用。

叶片称重后剪成1cm长，置研钵中，经液氮冷冻后研磨成粉末。

待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60～65℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，置于65℃水浴保温，0.5~1h，不时地轻轻摇动混匀。

2．加等体积的氯仿/异戊醇（24:

1），盖上瓶塞，温和摇动，使成乳状液。

3．将锥形瓶中的液体转移到离心管中，在室温下4000r/min离心5min，静置，离心管中出现3层，小心地吸取含有核酸的上清到另一干净的离心管中（注意吸取上清时不能吸入界面物质），弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。

4．根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。

5．在抽提后的上清液中加入1/10倍体积的3mol/LNaAc（pH6.8）和2倍体积的95％乙醇，混匀，室温放置5min，以10000r/min离心5min，倾去乙醇液，将离心管倒置于吸水纸上，吸干液体。

6．加入1ml70％乙醇洗涤DNA沉淀，按步骤5所述方法弃上清，于空气中或用电吹冷风使DNA沉淀干燥。

7．用适量含RNaseA酶（20μg/ml）的TE溶解DNA。

（2）DNA含量及纯度测定

1．吸取5μlDNA样品，加水至1ml，混匀后转入石英比色杯中。

2．分光光度计先用1ml蒸馏水校正零点。

3．在260nm紫外光波长下读出光密度值，代入下式计算DNA的含量。

4．测OD260/OD280值，DNA纯品的OD260/OD280值为1.8。

如果OD260/OD280值大于1.8，说明存在RNA，可以考虑用RNA酶处理样品；小于1.6，说明样品中存在蛋白质，应再用酚/氯仿抽提以及氯仿单独抽提，之后用乙醇沉淀纯化DNA。

五、结果计算

DNA浓度（μg/ml）＝

OD260

×稀释倍数

0.020×L

式中OD260为260nm处的光密度；L为比色杯光径（cm）；0.020为1μg/mlDNA钠盐的光密度。

六、附注

如果植物样品不经液氮处理，提取液中的CTAB浓度需要提高到4%（W/V）。

在许多情况下，使用0.1%（V/V）巯基乙醇，并不能完全抑制叶片中的氧化作用，但是，这种氧化作用不会影响限制性内切酶的活性。

如果使用的巯基乙醇浓度高于0.1%（V/V），则会大大降低DNA的得率。

七、思考题

1．制备的DNA在什么溶液中较稳定?

2．为了保证植物DNA的完整性，在吸取样品、抽提过程中应注意什么？

实验二蛋白质的两性性质及等电点测定

一、目的

（1）通过实验了解蛋白质的两性性质及等电点与蛋白质分子聚沉的关系。

（2）掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。

二、原理

蛋白质是两性电解质。

蛋白质分子中可以解离的基团除N端α―氨基与C端α―羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如酚基、巯基、胍基、咪唑基等基团，它们都能解离为带电基团。

因此，在蛋白质溶液中存在着下列平衡：

调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。

在等电点时，蛋白质溶解度最小，溶液的混浊度最大，配制不同pH的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可确定蛋白质的等电点。

三、仪器和试剂

1．仪器

试管架；试管：

15ml×6；刻度吸管：

1ml×4，2ml×4，10ml×2；胶头吸管×2。

2．试剂

（1）1mol/L乙酸：

吸取99.5%乙酸（比重1.05）2.875ml，加水至50ml。

（2）0.1mol/L乙酸：

吸取1mol/L乙酸5ml，加水至50ml。

（3）0.01mol/L乙酸：

吸取0.1mol/L乙酸5ml，加水至50ml。

（4）0.2mol/LNaOH：

称取NaOH2.000g，加水至50ml，配成1mol/LNaOH。

然后量取1mol/LNaOH10ml，加水至50ml,配成0.2mol/LNaOH。

（5）0.2mol/L盐酸：

吸取37.2%（比重1.19）盐酸4.17ml，加水至50ml，配成1mol/L盐酸。

然后吸取1mol/L盐酸10ml，加水至50ml，配成0.2mol/L盐酸。

（6）0.01%溴甲酚绿指示剂：

称取溴甲酚绿0.005g，加0.29ml1mol/LNaOH，然后加水至50ml。

（7）0.5%酪蛋白溶液：

称取酪蛋白（干酪素）0.25g放入50ml容量瓶中，加入约20ml水，再准确加入1mol/LNaOH5ml，当酪蛋白溶解后，准确加入1mol/L乙酸5ml，最后加水稀释定容至50ml，充分摇匀。

四、操作方法

1．蛋白质的两性反应

（1）取一支试管，加0.5%酪蛋白1ml，再加溴甲酚绿指示剂4滴，摇匀。

此时溶液呈蓝色，无沉淀生成。

（2）用胶头吸管慢慢加入0.2mol/L盐酸，边加边摇至有大量沉淀生成。

此时溶液的pH值接近酪蛋白的等电点。

观察溶液颜色的变化。

（3）继续滴加0.2mol/L盐酸，沉淀会逐渐减少以至消失。

观察此时溶液颜色的变化。

（4）滴加0.2mol/LNaOH进行中和，沉淀又出现，继续滴加0.2mol/LNaOH，沉淀又逐渐消失。

观察溶液颜色的变化。

解释以上

（1）—（4）的颜色及沉淀变化的原因。

注：

溴甲酚绿的变化范围pH3.8（黄色）—5.4（蓝色），pH4.5时开始有颜色变化。

2.酪蛋白等电点的测定

（1）取同样规格的试管7支，按下表精确地加入下列试剂：

试剂（ml）

管号

1.0mol/L乙酸

1.6

0.8

0.1mol/L乙酸

0.01mol/L乙酸

2.5

1.25

0.62

蒸馏水

2.4

3.2

1.5

2.75

3.38

溶液的pH

3.5

3.8

4.1

4.7

5.3

5.6

5.9

（2）充分摇匀，然后向以上各试管依次加入0.5%酪蛋白1ml，边加边摇，摇匀后静置5min，观察各管的混浊度。

（3）用-、±、+、++、+++等符号表示各管的混浊度。

根据混浊度判断酪蛋白的等电点，最混浊一管的pH值即为酪蛋白的等电点。

五、注意事项

缓冲液的pH值必须准确。

六、思考题

1．解释蛋白质两性反应中颜色及沉淀变化的原因。

2．该方法测定蛋白质等电点的原理是什么？

实验三双缩脲法测定蛋白质含量

一、目的

掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。

掌握分光光度计的使用方法。

二、原理

碱性溶液中双缩脲（NH2-CO-NH-CO-NH2）能与Cu2+产生紫红色的络合物，这一反应称为“双缩脲反应”。

蛋白质分子中的肽键也能与铜离子发生双缩脲反应，溶液紫红色的深浅与蛋白质含量在一定范围内符合朗伯-比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子质量无关。

其可测定范围为1-l0mg蛋白质，适用于精度要求不高的蛋白质含量测定。

Tris，一些氨基酸，EDTA等会干扰该测定。

三、器材、试剂和材料

1．器材

（1）分光光度计

（2）分析天平

（3）振荡器

（4）刻度吸管：

1m1×2，5m1×2，10m1×1

（5）具塞三角瓶：

100ml

（6）漏斗：

13个

2．试剂

（1）双缩脲试剂：

取硫酸铜（CuSO4·5H2O）1.5g和酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）6.0g，溶于500m1蒸馏水中，在搅拌的同时加入300m110%NaOH溶液，定容至1000ml，保存于塑料试剂瓶中或内壁涂一层纯净石蜡的普通试剂瓶中。

如无红色或黑色沉淀出现，此试剂可长期使用。

（2）0.05mol/L的NaOH。

（3）标准酪蛋白溶液：

准确称取酪蛋白0.5g溶于0.05mol/L的NaOH溶液中，并定容至100m1,即为5mg/m1的标准溶液。

3．材料

小麦、玉米或其它谷物样品，风干、磨碎并通过100目铜筛。

四、操作步骤

1．标准曲线的绘制

取6支试管，编号，按下表加入试剂：

试剂

管　号

标准酪蛋白溶液（ml）

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

H2O（ml）

0.8

0.6

0.4

0.2

双缩脲试剂（ml）

蛋白质含量（mg）

A540nm

振荡15min，室温静置30min，540nm比色，以蛋白质含量（mg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2．样品测定

（1）将磨碎过筛的谷物样品在80℃下烘至恒重（连续两次称重差值不超过0.5mg），取出置于燥器中冷却待用。

（2）称取烘干样品约0.2g两份，分别放入两个干燥的三角瓶中。

然后在各瓶中分别加入5ml0.05

mol/L的NaOH溶液湿润，之后再加入20ml的双缩脲试剂，振荡15min，室温静置反应30min，分别过滤，取滤液在540nm波长下比色，读取吸光度。

在标准曲线上查出相应的蛋白质含量（mg）。

五、结果计算

六、注意事项

1．三角瓶一定要干燥，勿使样品粘在瓶壁上。

2．所用酪蛋白需经凯氏定氮法确定蛋白质的含量。

七、思考题

1.干扰本实验的因素有哪些？

2.双缩脲法测定蛋白质含量的原理是什么?

实验四温度、pH及酶的激活剂、

抑制剂对酶活性的影响

一、目的

1.巩固温度、pH值、激活剂、抑制剂对酶活性影响的认识。

2.学习测定酶的最适温度、最适pH值的简单方法，学习检测激活剂和抑制剂的方法。

二、原理

酶是指化学本质为蛋白质的生物催化剂。

在一定条件下，酶促化学反应进行的能力即称为酶活性（酶活力）。

影响酶活性的因素是多方面的，如温度、pH及某些化学物质等都会影响酶的催化活性。

在一定条件下，能使酶活性达到最高时的温度即酶的最适温度，而能使酶活性达到最高时的pH即酶的最适pH。

例如，唾液淀粉酶的最适温度是37℃，而其最适pH是6.8。

能增高酶活性的物质称为酶的激活剂，能降低酶活性却又不使酶变性的物质叫酶的抑制剂。

凡能使蛋白质变性的因素都可以使酶变性而丧失活性。

酶活性通常是通过测定酶促化学反应的底物或产物量的变化来进行观察的。

本实验用唾液淀粉酶为材料来观察酶活性受理化因素影响的情况。

唾液中含有唾液淀粉酶，淀粉在该酶的催化作用下会随着时间的延长而出现不同程度的水解，从而得到各种糊精乃至麦芽糖、少量葡萄糖等水解产物。

而碘液能指示淀粉的水解程度——淀粉遇碘可呈紫色、暗褐色与红色，而麦芽糖与葡萄糖遇碘则不呈现颜色反应，如图所示：

淀粉糊精麦芽糖+少量葡萄糖

三、器材和试剂

1．器材

试管（10mm×100mm）；试管架；电热恒温水浴箱；沸水浴；冰浴；多孔白瓷板（或比色盘）；滴管

2．试剂

（1）0.5%淀粉溶液：

称取可溶性淀粉0.5g加蒸馏水少许搅拌成糊状，然后用煮沸的1%氯化钠溶液稀释到100ml。

（2）碘化钾－碘溶液：

取碘化钾2g及碘1.27g溶解于200ml蒸馏水中，使用前用蒸馏水稀释5倍。

（3）1%淀粉溶液：

称取可溶性淀粉1.0g加蒸馏水100ml，煮沸溶解。

（4）1%CuSO4溶液：

称取1gCuSO4•5H2O，用蒸馏水溶解至100ml。

（5）磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液pH5.0-8.0

A．0.2mol/L磷酸氢二钠溶液：

称25.62gNa2HPO4•2H2O，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml；

B．0.1mol/L柠檬酸溶液：

称19.21g无水柠檬酸，用蒸馏水溶解后定容至1000ml。

用A、B两种溶液，按附录方法，配制pH5.0、pH6.8、pH8.0各10ml。

（6）0.5%NaCl溶液。

（7）唾液淀粉酶制备：

每人用自来水漱口3次，然后取20ml蒸馏水含于口中，半分钟后吐入烧杯中，稀释至40ml为稀释唾液，供实验用。

四、操作方法

（一）温度对酶活性的影响

1．取3支大试管，编号后按下表操作

试管号

0.5%淀粉溶液

稀释唾液[1]

温度

5ml

1ml

0℃水浴

5ml

1ml

37℃水浴

5ml

1ml

沸水浴

2．在白色比色盘上，置碘液2滴于各孔中，自试管放入水浴后，每隔1min，从第二管中取反应液1滴与碘液混合，观察颜色变化。

3．待第二管中反应液遇碘不发生颜色变化（即只呈碘的颜色）时，向各管中加入碘液1滴，摇匀，观察并记录各管颜色，说明温度对酶活性的影响。

（二）pH对酶活性的影响[2]

1．取试管3支，按下表操作

试管号

0.5%淀粉溶液

pH5.0缓冲液

pH6.8缓冲液

pH8.0缓冲液

稀释唾液

2ml

3ml

1ml

2ml

3ml

1ml

2ml

3ml

1ml

2．将3支试管放入37℃水浴中，并在白色比色盘上用碘液检查第二管，待碘液不变色时，向各管加碘液几滴，观察并记录各管颜色。

（三）酶的激活剂及抑制剂对酶活性的影响

1．取小试管3支，按下表操作

试管号

1%淀粉溶液

1%CuSO4

溶液[3]

0.5%NaCl

溶液[4]

蒸馏水

稀释唾液

2ml

1ml

2ml

1ml

2ml

1ml

2．将3支试管放入37℃水浴中，并在白色比色盘上用碘液检查第二管，待碘液不变色时，向各管加碘液1滴，观察水解情况，记录并解释结果。

注：

[1]稀释唾液加入时应迅速，其中加入沸水浴的一管，当唾液加入后应立即放入沸水浴。

[2]酶的最适pH受缓冲液性质的影响。

如唾液淀粉酶的最适pH为6.8，但在磷酸缓冲液中，其最适pH为6.4~6.6，在醋酸缓冲液中则为5.6。

[3]CuSO4溶液为唾液淀粉酶的抑制剂。

[4]NaCl溶液为唾液淀粉酶的激活剂。

激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。

例如，氯化钠到1/3饱和度时就抑制唾液淀粉酶的活性。

实验五还原糖和总糖的测定—3,5-二硝基水杨酸比色法

一、目的

掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。

二、原理

还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。

还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。

利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。

还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。

由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

三、实验材料、主要仪器和试剂

1．实验材料

小麦面粉；精密pH试纸。

2．主要仪器

（1）具塞玻璃刻度试管：

20ml×11

（2）大离心管：

50ml×2

（3）烧杯：

100ml×1

（4）三角瓶：

100ml×1

（5）容量瓶：

100ml×3

（6）刻度吸管：

1ml×1；2ml×2；10ml×1

（7）恒温水浴锅

（8）沸水浴

（9）离心机

（10）扭力天平

（11）分光光度计

3．试剂

（1）1mg/ml葡萄糖标准液

准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，混匀，4℃冰箱中保存备用。

（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂

将6.3gDNS和262ml2MNaOH溶液，加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。

（3）碘-碘化钾溶液：

称取5g碘和10g碘化钾，溶于100ml蒸馏水中。

（4）酚酞指示剂：

称取0.1g酚酞，溶于250ml70%乙醇中。

（5）6MHCl和6MNaOH各100ml。

四、操作步骤

1．制作葡萄糖标准曲线

取7支20ml具塞刻度试管编号，按表4.1分别加入浓度为1mg/ml的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。

表4.1葡萄糖标准曲线制作

管号

1mg/ml葡萄糖标准液

（ml）

蒸馏水

（ml）

DNS

（ml）

葡萄糖含量

（mg）

光密度值

（OD540nm）

1.5

0.2

1.8

1.5

0.2

0.4

1.6

1.5

0.4

0.6

1.4

1.5

0.6

0.8

1.2

1.5

0.8

1.0

1.5

1.0

1.2

0.8

1.5

1.2

将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至20ml，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。

调波长540nm，用0号管调零点，测出1~6号管的光密度值。

以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。

2．样品中

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