基因工程知识要点说明.docx

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基因工程知识要点说明

第一章

1.基因工程:

是在分子水平上进行的遗传操作，指将一种或多种生物体（供体）的基因或基因组提取出来，或者人工合成的基因，按照人们的愿望进行严密的设计，经过体外加工重组，转移到另一种生物体（受体）的细胞，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。

2.基因工程的基本过程为哪些？

切—接—转—增—检

①获得目的基因：

从供体细胞分离出基因组DNA，用切酶将外源DNA切开。

——切（同时选择运载目的基因的载体）②目的基因与载体DNA拼接：

用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，形成DNA重组分子。

——接③重组体分子导入受体细胞：

借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中。

——转

④短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中。

——增⑤筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞。

——检

3.哪些基因是真核生物特有的？

①假基因：

核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同，但却不能合成出功能蛋白质的失活基因。

②基因家族：

由功能相关的基因成套组合形成③重复序列

哪些是原核生物特有的：

插入序列。

哪些是真核和原核共有的：

移动基因、重叠基因

第二章

1.寄主细胞控制的限制与修饰

宿主控制限制——核酸限制性切酶

宿主控制修饰——修饰的甲基转移酶

以λ（k）噬菌体侵染E.coliB菌株为例解释寄主控制与修饰的现象。

（简述寄主控制的限制与修饰现象。

v大多数细菌的噬菌体侵染都存在着一些功能性障碍。

所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。

R/M体系：

寄主是由两种酶活性配合完成的

R/M体系的作用：

v保护自身的DNA不受限制；

v破坏外源DNA使之迅速降解；

2.简述Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型核酸切酶的基本特性。

（1）Ⅰ型酶基本特性

①有切酶活性和甲基化酶活性——互斥②需要ATP、SAM（S—腺苷甲硫氨酸）和Mg2+辅助因子；③EcoB和EcoK是由三种不同亚基组成。

γ多肽链：

特异性亚基，识别DNA序列的活性。

β多肽链：

修饰亚基，具有甲基化酶活性。

α多肽链：

限制亚基：

具有核酸切酶活性④有特定的识别位点⑤切割方式：

结合在识别位点，以滚环形式沿着DNA分子转位，从距识别位点5’一侧几千bp处随机切割分子，无特异性。

（2）Ⅱ型酶：

①有切酶活性和甲基化酶活性——分开反应②能识别专一的核苷酸序列，并在固定位置上切割③识别序列的核苷酸对顺序呈回文结构（那项具有回文结构：

识别位点的DNA序列呈双重旋转对称）④切割可形成两种核苷酸切割末端————粘性末端和平末端。

粘性末端定义：

指DNA分子在限制酶作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，能通过互补碱基间配对而重新环化起来。

（3）Ⅲ型酶：

①由两个亚基组成的蛋白质复合物，即同时具有切酶活性和甲基化酶活性

②需Mg2+、ATP、SAM辅助因子③可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3’端24～26bp处切开ＤＮＡ，所以它的切割位点也是没有特异性的

4.同尾酶：

指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸切酶。

利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。

同裂酶：

指来源不同但识别相同靶序列的核酸切酶。

同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。

但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。

星号活性：

同一限制酶当某些反应条件变化时酶的专一性发生改变，即酶切位点专一性改变的活性。

包装上标“＊”注明。

5.DNA缺口平移、取代反应的概念

DNA缺口平移：

在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶Ⅰ的5’→3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。

（概念：

当外切酶活性从缺口的5’一侧移去一个5’核苷酸之后，聚合酶作用就会在缺口的3’一侧补上一个新的核苷酸，但PolⅠ不能在3’-OH和5’-P之间形成一个键，随着5’一侧的核苷酸不断移去，3’一侧的核苷酸又按序列增补，缺口便沿着DNA分子合成的方向移动。

）

②用途：

通过DNA缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。

取代反应：

如果在反应混合物中仅存在一种dNTP，则此酶的3’→5’的外切酶活性将从dsDNA的3’端降解，直到互补于该dNTP的碱基出现为止，然后在该位置发生合成和取代反应。

6.各DNA聚合酶的基本特性及其区别；

（1）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（PolⅠ）的酶活性

①5’→3’的聚合酶活性：

需Mg2+

②5’→3’的外切酶活性：

可以从游离的5’-OH末端水解DNA分子（修复作用）

③3’→5’的外切酶活性（较低）：

从DNA链的3’-OH末端向5’水解DNA（校对作用）

用途：

主要功能参与DNA的合成，起到修复作用；PolⅠ同DNA分子克隆的关系最为密切。

（2）PolⅠ的Klenow片断

①5’→3’的聚合酶活性；②3’→5’的外切酶活性③无5’→3’外切酶活性。

Klenow片断的主要用途：

①修补经限制酶消化的DNA所形成的3’隐蔽末端；②标记DNA片断的末端；

③cDNA克隆中的第二条链cDNA的合成；④DNA序列的测定。

（3）PolⅡ（参与DNA修复过程）

酶活性：

①5’→3’的聚合酶活性：

要求模板是双链DNA，中间有空隙的单链DNA部分，且空隙部分不长于100bp；②具有3’→5’的外切酶活性，无5’→3’外切酶活性；

③主要在DNA的损伤修复中有一定的作用

（4）PolⅢ

①聚合作用：

是细胞DNA复制所必需的；②3’→5’的外切酶活性，底物是单链DNA；③5’→3’外切酶活性，底物是单链DNA。

（5）T4DNA聚合酶

①5’→3’的聚合酶活性；②3’→5’的外切酶活性；③无5’→3’外切酶活性；

④取代反应:

在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止；

（6）T7DNA聚合酶

①5’→3’的聚合酶活性；②3’→5’的外切酶活性（是klenow片段的1000倍）；

③无5’→3’外切酶活性；

（7）耐热DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）（选择题）

①具耐高温的特性，最适活性温度为72℃，连续保温30min仍有活性，一次加酶即可满足PCR反应全过程的需求；②Mg2+依赖酶；③具有聚合酶活性；④具有5’→3’外切酶活性，无3’→5’外切酶活性⑤SDS完全抑制其酶活性。

（8）反转录酶

依赖RNA的DNA的聚合酶。

α多肽链——具有反转录酶活性和RNaseH活性；

β多肽链——具有以RNA-DNA杂交分子为底物的5’→3’脱氧核酸外切酶活性。

以mRNA为模板合成cDNA；在反转录酶作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条cDNA。

7.连接酶所需的条件——供能分子、磷酸基团和羟基。

概念：

能够催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶。

即能够将DNA链上彼此相邻的3’-羟基（OH）和5’-磷酸基团（-P），在供能分子的作用下，形成磷酸二酯键。

需要三种成分参与：

3’-OH，5’-P，提供能量的分子

供能分子：

NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核酸）——在E.coli等细菌中选用

ATP（腺苷三磷酸）——动物细胞、噬菌体中选用

注：

①只能连接缺口（nick）；②不能连接裂口（gap）；

③而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。

8.缺口：

在双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去磷酸二酯键所出现的单链断裂。

裂口：

在双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链断裂。

9、碱性磷酸酶：

将DNA末端的5’端磷酸基除去，使其5’端变成3羟基，能防止自身环化。

作用：

（1）去除DNA和RNA的5”--磷酸基，然后在T4多聚核苷酸激酶催化下，用[γ—32P]ATP进行末端标记，继而进行序列分析。

（2）去除载体DNA5”--磷酸基，防止自身环化，降低本底，提高重组DNA检出率。

发夹结构：

10、末端转移酶特性：

①催花dNTP添加到3’-OH端，且不需模板；②需Co2+。

用途：

①给载体或cDNA加上互补的同聚尾；②标记3’末端。

第三章

1、基因载体：

离开染色体的外源DNA不能复制，而插入的外源DNA可作为复制子的一部分在受体细胞中进行复制，这种复制子就是外源基因的载体。

2、报告基因：

有特殊意义的基因，重组子转入宿主细胞中，可依据报告基因从其他细胞中识别区分甚至挑选出来。

2、载体应具备的特性：

①能在宿主细胞进行独立和稳定的DNA自我复制，插入外源基因后，仍保持稳定的复制状态；②易于从宿主细胞中分离，并行纯化；③载体DNA序列中有单一的酶切位点，并位于DNA复制的非必需区；④具有能够观察的表型特征，如报告基因（遗传标记），插入外源DNA后，这些特征可以作为重组DNA选择标志。

3、载体的致死效应：

利用载体进行克隆时，有时可能对大量的克隆化基因和克隆化基因产物可能有害，宿主细胞呈现致死效应。

如大量表达目的蛋白不利于宿主繁殖，使其致死。

3、R1质粒和ColE1-K30质粒

R1质粒

ColE1-K30

E.Coli中

严紧型

松弛型

奇异变形杆菌中

松弛型

严紧型

4、质粒构型：

常见的构型:

SC>L>OC

A.共价闭合环形DNA（cccDNA）:

呈现超螺旋的SC构型B.开环DNA（ocDNA）:

即OC型。

C.线性DNA（lDNA）:

即L型。

根据寄主细胞所含的拷贝数多少质粒分为严紧型和松弛型。

5、质粒的种类

F质粒：

又叫F因子、性质粒或致育质粒。

是最具代表性的单拷贝的接合型质粒，共编码着19个转移基因。

R质粒：

又称抗药性因子，它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因。

Col质粒：

产生大肠杆菌素因子，编码有控制大肠杆菌素合成的基因。

属非结合质粒。

6、ColE1质粒的迁移作用：

由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移的过程。

其中参与迁移的有两种基因：

bom基因：

位于ColE1DNA上的特异位点

mob基因：

ColE1质粒特有的，其编码的核酸酶作用于bom位点

7、细菌质粒的不相容性

在同一个大肠杆菌细胞，一般不能同时含有两种不同的质粒。

也称为质粒的不亲和性。

是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。

8、质粒的报告基因应用类型：

插入失活效应；α—互补

简述如何应用插入失活和α-互补（蓝白筛选）来筛选重组子

pBR322质粒载体有:

抗氨苄青霉素基因（ampr）;抗四环素基因（tetr）

②α—互补：

LacZ（半乳糖苷酶基因）有两个主要的亚基，α亚基和ω亚基，α与ω相结合就能表现出半乳糖苷酶活性，能将无色底物X-Gal变成蓝色。

ω片段基因——coli基因组α-肽基因——质粒

Ø将含有α-肽的质粒转化到coli上（α-互补），形成蓝色菌落；

Ø插入外源基因，使α-肽编码区被破坏，LacZ失活则形成白色菌落。

利用α-互补（蓝白斑筛选）进行重组子的筛选。

9、如何对质粒进行人工改造，使其成为载体。

（1）减小分子量：

可容纳外源DNA更长；

（2）改造切酶位点，具有若干限制酶切单一位点的多克隆位点（人工合成且密集排列）；

（3）插入外源基因后，较易导入宿主菌复制和表达，且不会因接触而转移到另一个细菌；

（4）具有一个或几个报告基因。

克隆载体：

复始起始点、遗传标记、多克隆位点

10、pBR322和pUC质粒的各组成部分的来源分别是什么？

（1）pBR322主要组成部分的来源

1亲本：

pMB1和pSF2124;②ampr基因来源于pSF2124；

③tetr基因来源于Psc101;④复制起点（ori）ColE1

11、穿梭质粒：

是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞存活和复制的质粒载体。

专题——核酸分子的提取及核酸凝胶电泳

2、简述提取质粒DNA的原理及步骤。

碱变性法原理：

利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。

步骤：

①材料的准备②破碎细胞或包膜，使容物释放③核酸分离、纯化

④沉淀或吸附核酸，去除杂质⑤核酸溶解在适量缓冲液或水中

3、如何防止RNase污染？

①塑料器皿用0.1%DEPC水溶液浸泡12h以上，高温灭菌后，180℃烘干6h以上。

②在超净工作台上操作。

③操作时带一次性手套和口罩。

④提取缓冲液中加入RNase抑制剂。

1、温和噬菌体：

既可引起宿主细胞的裂解死亡，又可将其核算整合到细菌染色体上，使细菌细胞继续生长繁殖，并被溶溶原化的噬菌体。

烈性噬菌体：

将噬菌体感染的记住细胞转变成为噬菌体的“制造厂”，能产生出大量子代噬菌体。

溶原化：

用温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程。

噬箘粒：

由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列，称为噬菌粒载体。

柯斯质粒：

一类由人工构建的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。

载体，也称粘粒、柯斯载体。

4、PAGE、琼脂糖凝胶电泳和脉冲电泳的区别及其应用围。

电泳技术

用途

区别

琼脂糖凝胶电泳

检测总DNA或总RNA的完整性、对PCR产物进行检测以及对核酸进行回收和纯化

分辨100bp~50kb的核酸片段

聚丙烯酰胺凝胶电泳

生物多样性检测以及亲子鉴定等

分辨1bp~1000bp的核酸片段

脉冲电场凝胶电泳

分离大分子量的DNA分子

分辨>50kb的核酸片段

2、λ噬菌体的繁殖方式

①溶菌性方式：

λ噬菌体利用宿主的酶类和原料，λDNA复制成子代λDNA，并装配呈子代λ噬菌体，最后裂菌，释放出许多新的λ噬菌体。

②溶源性方式：

感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体DNA上，成为细菌DNA的一个组成部分。

3、λ噬菌体的类型及体外包装程序

（二）体外包装程序

①包装反应的底物，按照滚环复制机理合成多连体形式的DNA，在具备噬菌体头部前体的条件下，从cos位点处被切割成单体分子。

②将线性单体分子装填到头部外壳里，由于具有粘性末端而发生环化。

③把头部和分别组装的尾部结构连成一体，形成成熟的λ噬菌体颗粒。

4、M13载体的优点和用途;

优点：

①只含单链DNA，因此可用作对DNA测序的模板及其它基因克隆实验，如异源双链DNA分析，互补RNA的分离及DNA序列分析等；

②可用来产生单链的DNA探针以选择和分离互补的RNA；③RF型是双链DNA，便于限制酶的识别和切割；

④RF型DNA经包装后分泌到细胞外而不溶菌；⑤不存在包装限制问题。

用途：

①制备测序用单链DNA模板；②用于制备杂交探针；③用于定点突变。

6、质粒、λ噬菌体和柯斯质粒的包装限制。

（1）λ噬菌体的包装能力控制在为野生λ噬菌体DNA长度（约48.5kb）的75%-105%。

①蛋白质外壳容纳DNA的能力②λ噬菌体载体克隆外源DNA的能力

（2）柯斯质粒：

可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。

但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞。

克隆的外源基因可达45kb，比λ噬菌体大许多。

由于包装限制的缘故，存在最低限值（>30kb）。

:

噬箘粒特点：

Ø噬菌粒载体的分子量较小，约3000bp；

Ø既有质粒的复制起点又有噬菌体的复制起点。

在寄主，可以按正常的双链质粒DNA形式复制，形成的双链DNA既稳定又高产，具有常规的质粒特性（选择性标记、多克隆位点等

Ø在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体，包装成噬菌体颗粒后被挤出寄主细胞。

Ø用噬箘粒克隆DNA进行测序，免去从质粒到噬菌体这一亚克隆步骤。

（分子量小、克隆能力大；能稳定遗传；可用来制备单、双链DNA。

）

（一）聚合酶链式反应（PCR）

1、原理：

双链DNA分子在临近沸点的温度下加热时便会分离成两条单链的DNA分子，然后DNA聚合酶以单链DNA为模板，引物与互补DNA结合后，经单链杂交复性，并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）按5’→3’方向将引物延伸，合成新生的DNA互补链。

2、反应过程：

①模板DNA的变性：

模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链。

变性：

通过热处理将待扩增模板的双链DNA变性裂解成单链DNA;

退火：

降低温度，使单链靶序列与寡核苷酸引物杂交结合；

延伸：

在适当条件下，DNA聚合酶使引物延伸，产生新的双链。

72℃

3、反应体系和反应条件

PCR反应体系：

模板：

DNA；引物：

P1P2；DNA聚合酶：

Taq；原料：

dNTP；反应缓冲液；辅助因子：

Mg2+

Mg2+的作用：

①Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。

适宜浓度为0.5-2.5mmol/L反应体系。

1Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。

2Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。

4、引物二聚体：

一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引物长度相近的双链DNA片段。

（引物之间或引物自身存在互补序列）

7、Southern杂交的原理——毛细管作用：

用限制性切酶将DNA消化成一定大小的片段，用琼脂糖凝胶电泳分离消化片段，再用毛细管转移等方法将变性的DNA片段转移到滤膜上，然后用标记的ssDNA（单链DNA）或RNA探针对固定在滤膜上的DNA进行杂交。

操作程序：

①用凝胶电泳分离DNA片段②用碱变性也预处理凝胶，并将其放在两端浸在缓冲液中的滤纸上③在凝胶上覆盖一滤膜④滤膜上加一叠干滤纸，并放上重物⑤稳定DNA片段，并用X光胶片曝光后得放射自显影照片，并与凝胶谱带比较

为何在转移之前需要进行碱变性处理凝胶？

使DNA片段保持单链状态而易于同探针分子发生杂交作用。

8、Southern用途：

（1）掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置；

（2）构建DNA分子的遗传图（3）分析基因组DNA消化片段、相互关系及长度的多样性（4）转基因生物基因组中外源基因整合及整合位点的鉴定（5）基因操作过程中复杂基因构件的分析鉴定

Nornthernblotting（RNA印迹杂交）用途;

Ø检测真核基因的转录水平、转录子的分子大小及相对丰度；是研究真核细胞基因表达的强有力手段。

注意：

防止RNA的降解

8、原位杂交（菌落或噬菌斑杂交）的概念及原理：

生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑，按照其原来的位置不变地转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用。

第六章基因文库的构建

一、基因文库的概念

基因文库：

将某种生物的全部基因组的遗传信息贮存在可以长期保存的稳定的重组体中，以备需要时能够随时应用它分离所需要的目的基因，这种保存基因组遗传信息的材料称为基因文库。

注：

基因文库与基因库的区别

2.cDNA文库:

指某生物某一发育时期所转录的mRNA全部经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆集合。

与基因组文库的区别：

cDNA文库不含非转录的基因组序列

一、cDNA文库的特征

①不含真核基因的间隔序列及调控区，不是真正意义上的基因；②仅包含某种组织或细胞正在表达的基因；③基因总量比基因组文库小得多，易于筛选克隆；④具有时效性，在转录水平上反映该生物在某一特定发育时期，某一特定组织在某种环境条件下的基因表达情况，不能包括该生物体的全部基因。

2．三种分离mRNA的方法

（1）传统的分离方法是用oligo（dT）-纤维素柱分离总RNA；

（2）把oligo（dT）-磁珠同总RNA混合，在强磁场下分离mRNA（3）用蔗糖梯度离心mRNA核糖体复合体（溶解细胞）来分离mRNA

2、cDNA的合成:

第一链的合成:

mRNA,反转录酶oligo（dT）核酸末端转移酶，dNTPs：

1.oligo（dT）引导的cDNA合成法2.随机引物引导的cDNA合成法

第二链的合成:

用RNaseH酶降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA，加入聚合酶Ⅰ，以第一条cDNA链为模板，降解的mRNA的段片段为引物合成第二链。

3．cDNA文库构建的程序：

（1）分离细胞总RNA，从中纯化出主要含mRNA的分部；

（2）合成第一链cDNA；

（3）将mRNA-DNA杂交分子转变成双链cDNA分子；（4）将合成的双链cDNA重组到质粒载体或噬菌体载体上，导入大肠杆菌寄主细胞增殖。

（三）cDNA克隆的优越性

①以mRNA为材料；（一些RNA病毒，不经过DNA中间体，对其研究，cDNA是唯一可行的方法）②cDNA文库的筛选比较简单易行；③由于每一个cDNA克隆都含有一种mRNA序列，在选择中出现假阳性的几率比较低；④克隆在细菌中表达的基因，用作基因序列的测定和发育过程中或组织中基因特异表达

一、应用mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）原理：

用3’-端锚定引物和反转录酶合成cDNA的第一链；用3’-端锚定引物和5’-端10-mer随机引物组成引物对，以反转录第一链为模板进行PCR扩增（DDRT-PCR），在标准的序列胶中电泳2~3小时，可显示出50~100条长度在100~5000bp之间的DNA条带。

2.建立文库的目的，应用围

目的：

①便于目的基因的保存、扩增和纯化；②分离克隆目的基因的主要途径；③是复杂基因组作图的重要依据。

应用围：

①研究基因的结构、功能和筛选基因工程目的基因；②基因定位、基因调控等方面研究。

第七章目的基因的制取

2.保护基团的作用

保证合成反应能够定向地进行，将不需要参加反应的基团，用保护基选择性地保护起来，以获得特定序列。

（二）磷酸三酯法原理

对于参加缩合反应的带5’端保护基团的单核苷酸，其磷酸分子中的一个-OH基团已带上适当的保护基团。

余下的另一个具有活性的-OH与另一个带有3’端保护基团的单核苷酸的5’-OH缩合形成具磷酸三酯键的二核苷酸分子。

（四）用寡核苷酸片段组装基因的方式

1.小片段粘接法：

将待合成的目的基因分成若干小片段，每段长12~15bp，两条互补链分别设计成交错覆盖的两套小片段，然后通过化学方法合成，并退火形成双链DNA大片段。

小片段粘接法：

根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段

优点：

化学合成的DNA片段小，收率高；

缺点：

各段的互补序列较短，易在退火时发生错配。

2.补丁延长法

将目的基因的一条链分成若干40~50bp大小的片段，另一条链设计成与上述大片段交错互补的小片段（约20bp的补丁）。

两组不同大小的DNA单链片段退火后，用klenow酶将空缺部分补齐，最后用T4DNA连接酶修复缺口

补丁延长法：

根据目的基因两条互补链全序列，分别合成20碱基长的单链DNA小片段以及40-50碱基长的单链DNA中片段

优点：

化学合成与酶促合成相结合的方法减少寡聚核苷酸的合