烟草植物组织培养实验报告.docx
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烟草植物组织培养实验报告
烟草叶片组织培养
一、试验目
本试验经过配制3种不一样培养基来实现烟草种子苗叶片诱导、分化及植株再生从而深刻了解植物细胞全能性、学习和掌握植物组织培养技术,
二、试验原理
植物组织培养是从20世纪30年代早期发展起来一项生物技术。
因为其拥有占地少、繁殖系数大等特点,现以在全世界园林植物尤其是花卉种苗繁育上得到广泛应用。
本文着重介绍组织培养技术理论原理、操作过程、生产技术以及经济核实等方面内容,使大家对组织培养在园林植物尤其是花卉种苗繁育应用有所了解,为以后实际操作提供依据。
在植物组织培养中,关键目标是诱导愈伤组织形成和形态发生,使一个离体细胞、一块组织或一个器官细胞,经过脱分化形成愈伤组织,并由愈伤组织再分化形成植物体。
从一块外植体形成经典愈伤组织,大致要经历三个时期:
起动期、分裂期和形成期。
培养基配方设计是组培法育苗中关键步骤。
依据理论与实际经验,对不一样种类花卉及不一样取材部位,需设计出相适应配方,并从中筛选出最好者。
继代芽增殖培养:
很多花卉植物经过2-6 周培养即可分化出大量不定芽。
依据情况能够将这些增殖了大量新芽外植体重新分割进行几代培养,以扩大繁殖规模直至满足繁殖需要为止。
三、试验材料
植物材料:
烟草植株
药品:
激素（2,4-D、NAA、6-BA浓度均可）、1N NaOH、1N HCl 蒸馏水、70%酒精、0.01%升汞
仪器:
1 玻璃杯、1玻璃棒、1pH试纸（5.5-9.0） 1瓶无菌水、1个无菌烧杯、1包无菌滤纸、1个无菌白瓷板 、培养瓶若干移液器、微波炉、灭菌器、超净工作台、 酒精灯、解剖刀、镊子
四、试验方法与步骤
4.1MS培养基母液配制
母液
成 分
要求量
浓缩
倍数
称取量（mg）
母液
体积（ml）
配制1升培养基吸收量定容
编号
种类
1
大量元素
KNO3
1900
10
19000
1000
100
NH4NO3
1650
10
16500
MgSO4·7H2O
370
10
3700
KH2PO4
170
10
1700
2
CaCl2·2H2O
440
10
4400
1000
100
3
微量元素
MnSO4·4H2O
22.3
100
2230
1000
10
ZnSO4·7H2O
8.6
100
860
H3BO3
6.2
100
620
KI
0.83
100
83
Na2MoO4·7H2O
0.25
100
25
CuSO4.5H2O4
0.025
100
2.5
CoCL2.6H2O
0.025
100
2.5
4
铁盐
Na2-EDTA
37.3
100
3730
1000
10
FeSO4.4H2O
27.8
100
2780
5
有机物
甘氨酸
2.0
100
100
500
10
盐酸吡哆醇
0.5
100
25
盐酸硫铵素
0.1
100
5
烟酸
0.5
100
25
6
肌酸
100
100
5000
500
10
注意:
1．大量元素根据使用时高10倍数值称取,分别将多种化合物称量后,除CaCl2·2H2O单独配制外,其它化合物混合在500ml烧杯中加适量蒸馏水溶解,用玻璃棒搅拌促溶,倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度,置小口瓶中保留,贴上标签注明化合物名称（或编号）,浓缩倍数,配制日期和配制者姓名,CaCl2·2H2O配制同上置于另一小口瓶中。
2．微量元素母液配制
按要求浓缩100倍数值称取,分别将多种化合物称量除铁盐（FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外,其它化合物可混合置于烧杯内加少许蒸馏水溶解后,定容在1000ml容量瓶中,置小口瓶中保留,贴上标签。
3．铁盐配制将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中,加热,（很关键）不停搅拌,溶解后,两液混合,调PH至5.5加水定容至1000ml,置于小口瓶中,贴上标签。
4．有机物母液配制,按母液要求浓缩50倍,除蔗糖按3%单独临时称量外,其它分别称量后,溶解,定容在500ml容量瓶中,置于小口瓶中保留,贴上标签。
5．母液最好在2~4℃冰箱中贮存,尤其是有机类物质,贮存时间不宜过长,无机盐母液最好在一个月内用完,如发觉有霉菌和沉淀产生,就不能再使用。
1．制备母液和营养培养基时,所用蒸馏水或无离子水必需符合标准要求,化学药品必需是高纯度（分析纯）。
2．称量药品采取高灵敏度天平,每种药品专用一药匙。
．生长调整剂母液配制:
为了操作方便,节省时间,生长调整剂也可如同配制母液一样,先配成原液,这么配制培养基时只要稍加计算,按需要量取即可。
不一样药品在配制时若不溶于水,可用少许不一样溶剂先溶解,萘乙酸（NAA）,吲哚乙酸（IAA）,赤霉素（GA3）,2,4-D等生长素和玉米素（ZT）可先用少许95%酒精溶解,然后加水,如溶解不完全再加热。
激动素（KT）和6-苄基嘌呤（BA）可溶于少许1mol/L盐酸中,叶酸需用少许稀氨水溶解。
称取50mg生长调整物质,溶解后,在100ml容量瓶中定容,配制母液每毫升则含有生长调整物质0.5mg,配制后通常要求在低温（0~4℃）保留,配制培养基时如每升（1000ml）需添加生长调整剂物质为0.5mg时,则取1ml母液即可。
4.2培养基配制和灭菌
4.2.1培养培养基配制程序
此次试验使用
（1）愈伤组织诱导及其幼芽分化培养基:
MS+2,4-D 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L;
（2）幼芽增殖培养基:
MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L;
（3）生根培养基:
MS+NAA 0.2 mg/L。
注意事项:
上述培养基均在MS固体培养基溶化后降低到50左右后,加入对应激素所得,MS固体培养基配置过程在此不作过多赘述
上述培养基均附加3%蔗糖,0.8%琼脂,pH5.8,培养温度25±2℃,光照强lx。
（一）.母液吸收量计算
配制培养基升数
公式1:
母液吸收量=母液体积（CC）×——————————
母液浓缩倍数
培养基要求含量
公式2:
母液吸收量=———————————（多种生长调整剂）
母液每CC含量
（二）多种母液按次序编号排列
A.大量元素;B.CaCl2.2H2O;C.微量元素;D.铁盐;E.有机物;F．生长素萘乙酸（NAA）:
配制0.5mg/mlNAA称取50mg,NAA用少许95%酒精溶解后加蒸馏水定容至1000ml;G..细胞分裂素、激动素（KT）配制0.5mg/mlKT称50mgKT用少许1NHCL溶解后,加蒸馏水定容至100ml。
（三） 配制培养基（1000ml）
1.琼脂:
称取5~7g琼脂,加入300ml蒸馏水,加热溶解直至完全溶解为止.
2.蔗糖3%用质量很好白糖替换,称取30g白糖,溶于溶有琼脂300ml蒸馏水中。
3.多种母液吸收（培养基1L）
（1）用50ml量筒量取大量元素母液（A）和CaCl2·2H2O母液（B）各100ml
（2）分别用10ml移液管或吸管吸收微量元素（C）,铁盐（D）母液各10ml
（3）用10ml移液管或吸管吸收有机物（H）10ml
（4）移取激素
将上述溶液全部混合于琼脂与蔗糖溶液中,混合均匀后,加热至80℃左右,用酸度计或精密PH试纸测定培养基PH通常要求5.8~6.0,过酸过碱则用1NNaoH和1NHCL调整。
二．分装:
用一个接有胶管分装器趁热装培养基,1000ml培养基分装到25-30个三角瓶中,每个三角瓶约30ml左右（通常占试管、三角瓶容量1/4~1/3左右）注:
培养基勿碰瓶壁。
三. 包装:
分装好三角瓶用封口膜包扎好,标明培养基代号即可进行灭菌。
用具清理和洗涤:
多种母液按原位置摆整齐,用过量筒,移液管、烧杯、铝锅等用水洗涤洁净,然后按次序放回原处。
4.2.2培养基灭菌——高压蒸汽灭菌（高压蒸汽灭菌锅使用方法）
具体操作步骤:
1.高压锅放水至平把架;
2.把包扎好培养基装入高压锅;
3.盖上热压锅盖,上紧螺帽（注意对角拧紧螺帽）关上气阀和安全阀.
4.然后接通电源.
5.压力计升至0.05MPa时,打开放气阀,排除冷空气（此步很关键）。
6.排除冷空气后,关闭放气阀,待压力升到0.11MPa位置时,开始计算灭菌时间,具体方法:
当压力锅指针升至0.12MPa时,关闭电源,待指针下降至0.11MPa时接通电源,不停反复此操作过程,维持20分钟。
7.灭菌时间达成20分钟后,除去电源,打开放气阀（注意要逐步放气）待高压锅内空气完全排除后,打开热压灭菌锅盖（注意对角扭松螺帽）稍待冷后再把培养基取出。
8. 经过灭菌营养培养基不宜放置太长,应尽早使用,但为了在使用前能检验培养基有没有微生物污染,可将培养基置于25℃下保留4天,假如培养基需要贮存较长时间,可在4℃低温下保留。
灭菌高压锅有大型卧式、中型立式、小型手提式等多个型号和规格,不管哪种型号,操作步骤都很相近。
进水→放进培养基→盖紧锅盖→关上放汽阀→检验安全阀→接上加热源→待压力升至0.05MPa时排锅内冷空气,关上放气阀→0.11MPa（121℃）下灭菌20~25分钟,保持稳定压力→除热源→逐步打开放气阀→锅内空气排除完后→开放锅盖→稍冷后取出培养基。
4.3植物材料表面灭菌——消毒剂灭菌
从外界或室内选择植物材料,都不一样程度地带有多种微生物。
这些污染源一旦带入培养基,便会造成培养基污染。
所以,植物材料必需经严格表面灭菌处理,再经无菌操作手续接到培养基上,这一过程叫做接种。
1.接种步骤:
第一步:
清理材料→→流水冲洗→→加入吐温（或洗衣粉）清洗→→自来水冲洗
第二步:
对材料表面浸润灭菌:
70%酒精浸10-30秒→→无菌水
第三步:
灭菌剂处理→→0.1-1%升汞5-8min（或其她灭菌剂）
第四步:
无菌水进行冲洗
注意事项:
１.灭菌剂通常要临时配制,现配现用．升汞能够短期储存．
２.对去除较轻易灭菌剂灭菌后无菌水冲洗３-４次,升汞通常５-８次,每次不少于３min
３.灭菌时要轻轻搅拌,消除气泡,使消毒更根本．
４.灭菌时间是从倒入消毒液开始,至倒入无菌水时为止。
５.灭菌液要充足浸没材料
2.无菌操作可按以下步骤进行:
（1）在接种3天前用甲醛熏蒸接种室,并于接种前3小时打开其内紫外线灯进行杀菌;
（2）在接种前20分钟,打开超净工作台风机以及台上紫外线灯;
（3）接种员先洗净双手,在缓冲间换好专用试验服,并换穿拖鞋等;
（4）上工作台后,用酒精棉球搽拭双手,尤其是指甲处。
然后搽拭工作台面;
（5）先用酒精棉球搽拭接种工具,再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍,然后反复过火尖端处,对培养皿要过火烤干;
（6）接种时,接种员双手不能离开工作台,不能说话、走动和咳嗽等;
材料吸干后,一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀,对材料进行合适切割。
（如叶片
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